Name: Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Erfahren Sie, wie man den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in permeabilisierten Thoraces von Drosophila mit hochauflösender Respirometrie misst. Diese Methode erfordert minimale Gewebe und liefert physiologisch relevante Ergebnisse.

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Diese Studie wurde finanziert durch Zuschüsse aus dem National Sciences und Engineering Research Council (NSERC, Entdeckung Grant) und Université de Moncton, NP. LHB möchte die finanzielle Unterstützung des Canadian Institute of Health Research (CIHR), New Brunswick Innovation Foundation (NBIF) und der Université de Moncton anerkennen. Die Arbeit des EHC wird von der Université de Moncton und Alzheimer Gesellschaft des Gehirns Kanada, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, Kanada, New Brunswick Health Research Foundation unterstützt.

(1) Reagenzien Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die folgenden Lösungen für Dissektion und Permeabilisierung des Gewebes.<ol>
<li>Bereiten Sie Erhaltung Lösung: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, Taurin, 20 mM 15 mM Na2Phosphokreatin, 20 mM Imidazol, 0,5 mM Dithiothreitol, und 50 mM K-MES, pH 7,1 (kann gespeichert werden bei-20 ° C).</li>
		<li>Bereiten Sie Saponin Lösung: 5 mg Saponin in 1 mL der Bewahrung Lösung (bereiten Sie täglich frisch).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie folgenden Lösungen für die Messung der Atmung.<ol>
<li>Bereiten Sie Atmung Medium: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2und 0,2 % BSA (w/V), pH 7,2.</li>
		<li>Entkuppler, Substrate, Inhibitoren vorzubereiten. Lösen Sie alle Substrate in H2O und lösen Sie der Entkuppler FCCP sowie die Inhibitoren in Ethanol absolut (mit Ausnahme von malonat die H2O verdünnt ist auf). Die meisten der Substrate sowie malonat (siehe Tabelle der Materialien) zu neutralisieren. Alle Konzentrationen im Protokoll gegeben sind Endkonzentrationen in 2 mL Kammern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung und Kalibrierung von hochauflösenden Respirometer.
<ol><li>Die Kammern, Kappen und Stopfen der Respirometer dreimal mit 70 % Ethanol und dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen.</li>
	<li>Kalibrieren auf NULL Sauerstoffkonzentration: pipettieren 2,3 mL Atmung Medium in den Kammern und 10 mg Natrium Dithionite hinzufügen. Zwar das maximale Volumen der Kammer 2 mL, 2,3 mL hinzugefügt, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter der Stopper bleibt, wenn die Kammern zu schließen. Schließen Sie die Kammern mit den Stöpseln und Messen Sie der Sauerstoffkonzentration für 10-20 min. kalibrieren die Elektroden bei Null Sauerstoffkonzentration mit der daraus resultierenden Sauerstoff-Verbrauch zu.</li>
	<li>Die Kammern mit distillated Wasser zu waschen, in absoluten Ethanol für 10 min inkubieren, und dann mit destilliertem Wasser abspülen.</li>
	<li>Bei Sättigung der Luft kalibrieren: pipettieren 2,3 mL Atmung Medium in den Kammern, legen Sie die Stopper, Aspirieren Sie das überschüssige Medium auf die Stopper und heben Sie dann die Stopper mit Abstandhalter. Überschüssige Atmung Medium ist in den Kammern (Volumen von 2 mL gesamt) pipettiert, um das Vorhandensein von Luftblasen zu vermeiden, nach dem Schließen der Kammern.</li>
	<li>Überwachen den Sauerstoffverbrauch für 45 Minuten bis eine Stunde, bis der Sauerstoff-Konzentration (blaue Spur) stabil rund 250 ist nM bei 24 ° C.</li>
</ol>(3) sezieren von fliegen und Permeabilisierung der Gewebe
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass alle Schritte ausgeführt werden, auf dem Eis.</li>
	<li>Betäuben sechs männlichen fliegen von dem gleichen Stamm, dasselbe Alter und auf die gleiche Diät auf Eis, Dissektion der fliegen zu erleichtern (Wildtyp w1118, 15 Tage alt, mit Maismehl Medium gefüttert) erhoben.</li>
	<li>Mit einem Skalpell und feine Spitzen Pinzette, sezieren Sie die fliegen (entfernen Sie die Köpfe und Bäuche) um nur des Thoraxes, enthält die Flugmuskeln zu halten. Dieser Schritt kann mit dem bloßen Auge erfolgen. Die daraus resultierende Thoraxes mit feinen Spitzen Pinzette zu behandeln.</li>
	<li>Drei seziert Thoraxes in einem 25 mm Petrischale mit 2 mL eiskaltes Bewahrung Lösung mit der Pinzette zu übertragen.</li>
	<li>Mit der feinen Spitze Pinzette mechanisch permeabilize des Thoraxes durch Einfügen von der Spitze der Zange in die Thoraxes und wiederholt zerreißen des Gewebes um ein locker verbundenes Netzwerk zu erhalten.</li>
	<li>Füllen Sie in einer 24-Well-Platte zwei Brunnen mit 12,5 µL der Saponin-Lösung und 1 mL der Bewahrung Lösung um eine Endkonzentration von 62,5 µg/mL von Saponin zu erhalten. Füllen Sie die zwei benachbarten Brunnen mit 1 mL der Atmung Medium.</li>
	<li>Mit der feinen Spitze Pinzette drei permeabilized Thoraxes in die verdünnte Saponin-Lösung und mit milden Agitation auf einem Orbitalschüttler auf Eis, für 20 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie nach der zweiten Inkubation die Fasern in die benachbarten Vertiefungen gefüllt mit der Atmung Medium mit milden Agitation, auf Eis, für 5 min die Saponin abzuspülen.</li>
</ol>4. Bestimmung der Trockenmasse
<ol><li>Trocknen Sie der permeabilized Thoraxes auf einer saugfähigen Unterlage und drehen Sie 3-4 mal mit der feinen Spitze Pinzette um sicherzustellen, dass alle Feuchtigkeit entfernt wird.</li>
	<li>Wiegen Sie die drei Thoraxes auf einer Mikrowaage zusammen. Beachten Sie die erhaltenen Gewicht, wie es verwendet wird, um die mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch zu normalisieren.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gewebe sofort in einem Tropfen Atmung Medium auf Eis.</li>
</ol>(5) Sauerstoff Verbrauch Rate Bestimmung
<ol><li>Öffnen Sie die Kammern der Respirometer (entfernen Sie die stopfen) und fügen Sie 10 mM von Pyruvat und 2 mM von Malate in jeder Kammer.</li>
	<li>Fügen Sie die permeabilized Gewebe direkt in die Kammern, die mit der Atmung Medium gefüllt.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Stopper mit Abstandhalter.</li>
	<li>Mit einer Spritze 60 mL sammeln Sie Sauerstoff direkt aus einer Sauerstoffflasche zu und Spritzen Sie 2-5 mL Sauerstoff durch die Stopper Kapillare jeder Kammer um sicherzustellen, dass Sauerstoffdiffusion durch das Gewebe nicht Sauerstoffverbrauch beschränkt wird.</li>
	<li>Einsetzen Sie eine Hamilton-Spritze in der Kapillare von jedem Anschlag um sicherzustellen, dass die Thoraxes in der Kammer verbleiben.</li>
	<li>Die Kammern vollständig zu schließen, wenn die Sauerstoffkonzentration rund 400 beträgt nM, Sauerstoffgehalt über Luft Sättigung zu erreichen (etwa 160 % Luft Sättigung) in den Kammern.</li>
	<li>Beenden Sie und starten Sie den Rührer für Luftblasen in den Kammern zu überprüfen.</li>
	<li>Geben Sie die Masse von Gewebe vorher gewogen, um die Atmung durch die Masse von Gewebe (mg), Anzeige Massenspezifische Sauerstoffverbrauch (Pmol O2 consumed.s-1.mg-1 des Gewebes) normalisieren.</li>
	<li>Sobald der Sauerstoffverbrauch (rote Spur) stabilisiert wird, fügen Sie 5 mM ADP mit einer Hamilton-Spritze.</li>
	<li>Spülen Sie nach jeder Injektion Spritzen mit destilliertem Wasser, 70 % Ethanol, und destilliertem Wasser wieder.</li>
	<li>Sobald der Sauerstoffverbrauch wieder stabil ist, injizieren Sie 5 µL einer 4 mm von Cytochrom c.</li>
	<li>Gehen Sie zu den sequentiellen Injektionen der folgenden Substrate, die mitochondriale Sauerstoffverbrauch auf verschiedenen Stufen des ETS zu bewerten:<ol>
<li>5 µL von einer 2 M Proline hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL einer 1 M-Succinat.</li>
		<li>Fügen Sie 30 µL einer 1 M Glycerin-3-Phosphat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren der Entkuppler FCCP in gewissem Sinne Titration in Schritten von 0,5-1 µm (2 µL einer 1 mM Lösung) bis die optimale Konzentration erreicht, d. h., die Konzentration, den höchsten Sauerstoffverbrauch möglich ohne Hemmung zu erreichen (Vorsicht: siehe Tabelle Materialien).</li>
	<li>Injizieren der folgende Hemmnisse gegenüber dem Vorquartal um vollständig hemmen das Elektron Flussmittel in der ETS um den Restsauerstoff Verbrauch (ROX) messen also nicht-respiratorischen Reaktionen wie Cyclooxygenase Reaktionen unter anderem:<ol>
<li>1 µL einer 1 mM Rotenon hinzufügen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>5 µL von einer 2 M malonat hinzufügen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Fügen Sie 1 µL einer 5 mM Antimycin A (Achtung: siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 0,2 mM Ascorbat und 0,5 mM TMPD nacheinander in die Kammern beginnend mit Ascorbat, den Sauerstoffverbrauch von Komplex IV zu messen.</li>
	<li>Fügen Sie 20 mM von Natriumazid Komplex IV hemmen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Sobald das Signal stabil ist, die Kammern mit Abstandhalter, wieder mit Sauerstoff die Kammern durch die Injektion von 2 mL reinem Sauerstoff bei öffnen und Schließen der Kammern ist die Konzentration um 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>Das Signal für 10-15 min zu messen und chemischen Hintergrund, d. h. den Sauerstoffverbrauch durch Autoxidation TMPD zu berechnen.</li>
</ol>6. Reinigung der Respirometer
<ol><li>Nach den Messungen einmal spülen Sie die Kammern mit destilliertem Wasser und spülen Sie die Kammern dreimal in 70 % igem Ethanol.</li>
	<li>Brüten Sie in absoluten Ethanol für 10 min, die Inhibitoren zu inaktivieren.</li>
	<li>Spülen Sie drei Mal mit destilliertem Wasser, füllen Sie die Kammern mit 70 % Ethanol und ersetzen Sie die stopfen und die Kappen bis zum nächsten Einsatz.</li>
</ol>

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<li>Bender, T., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+health+and+disease%3A+To+carry+or+not+to+carry%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie wird ein Verfahren zur Probenaufbereitung vor den Messungen der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Drosophila beschrieben. Diese Methode wurde entwickelt, um verschiedene Probleme im Zusammenhang mit der Protokolle, die mit mitochondrialen Isolationen, insbesondere im Hinblick auf Dauer und Anzahl der Personen erforderlich. Anstatt zu arbeiten mit mitochondrialen Isolationen, erfordern in der Regel große Menge an Gewebe aus mehreren Personen gewonnen, erfolgt dieses Experiment permeabilized Muskelfas...

Der Taufliege Drosophila Melanogaster, dient als Modellorganismus für genetische Forschung für über ein Jahrhundert1. Die Studie dieses Organismus führte nicht nur zu erheblichen Grundlagenwissen über geschlechtsgebundene Vererbung2, Mutation Satz3, die Entwicklung des Nervensystems und die Zelle Schicksal Bestimmung4, sondern hat auch vor kurzem entstanden, als ein wertvolles Instrument, um die Mechanismen, die verschiedene Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson5,6zu studieren. Darüber hinaus ist es ein beliebtes Modell, den Alterungsprozess zu studieren, da sie in großer Zahl über einen kurzen Zeitraum hinweg angehoben werden können und eine kurze Lebensdauer haben. Sie besitzen auch homologe Strukturen menschlicher Organe, wie Herz, Oenocytes (Hepatozyten-ähnliche Zellen), Fett Körper (funktionieren ähnlich wie die Leber und weißen Fettgewebe), Insulin produzierenden Zellen (β-Pankreaszellen entspricht), sowie die Hämolymphe Transport von Metaboliten (analog zu dem Blut der Wirbeltiere)7. Darüber hinaus sind die zentralen Bahnen des intermediären Stoffwechsels (einschließlich Insulin/Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-ähnliche Signalweg und Target of Rapamycin-TOR Wege) auch hoch konservierte7. Aus diesen Gründen Drosophila haben vor kurzem wurde ausgenutzt, um die grundlegenden Mechanismen zu beschreiben, die Stoffwechsel, vor allem in pathologischen Zuständen inhärenten menschlichen Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes8steuern. Ein wichtiger Bestandteil des Stoffwechsels ist das Mitochondrium, das mehrere Wege integriert und führt eine der wichtigsten biologischen Lebensfunktionen, ATP-Produktion über die Oxidative Phosphorylierung-Verfahren (OXPHOS). Angesichts ihrer zentralen Rolle im Stoffwechsel des Organismus ist es nicht verwunderlich, dass die mitochondriale Funktionsstörungen bei vielen Erkrankungen wie Parkinson9 und Alzheimer Erkrankungen10sowie Amyotrophe Lateralsklerose beteiligt sind 11 , 12. sie sind auch wesentliche Determinanten des Alterungsprozesses. In der Tat sind die Hauptproduzenten von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, die auf die Zelle in hoher Konzentration durch oxidativen Schäden11nachteilig sein kann. Alterung wurde auch die Anhäufung von beschädigten oder mutierte mitochondriale DNA-13, Mitophagy Dysfunktionen14,15 , sowie Beeinträchtigung der mitochondrialen Biogenese16gebracht. Mitochondrien sind ebenfalls wichtige Determinanten der Homöostase der Zelle, wie sie verschiedene Substrate anpassen verschiedene Zellfunktionen entsprechend der Fülle oder Mangel an Makronährstoffen17,18nutzen können.
In der Tat sind die verschiedenen Nährstoffe in der Nahrung (Kohlenhydrate, Lipide und Proteine) verdaut, absorbiert und in die Zellen transportiert. Sie werden dann umgewandelt in das Zytosol, und die abgeleitete Substrate werden in der mitochondrialen Matrix, wo sie reduzierende Mittel, wie NADH und FADH219 produzieren,transportiert. Diese Verringerung äquivalente werden dann von verschiedenen enzymatischen komplexen Elektronentransport-System (ETS) oxidiert. Diese komplexe sind eingebettet in die mitochondriale innere Membran, wie Komplex I und Komplex II. Darüber hinaus vertreten anderen enzymatischen komplexe wie die mitochondriale Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase und Prolin Dehydrogenase alternative Routen für die Eingabe von Elektronen in die ETS-20,-21. Diese "alternative" komplexe sind besonders wichtig bei Insekten, können als je nach Tierart, sie aktiv um die Atmung20,22,23,21zu erhöhen. Elektronen aus diesen ETS Zuführsysteme werden das Ubiquinon und anschließend zum Komplex III und dann Komplex IV, bis die endgültigen Akzeptor, molekularen Sauerstoff übertragen. Diese Elektronentransfer erzeugt eine Kraft, Proton-Motiv auf der inneren mitochondrialen Membran fahren die Phosphorylierung von ADP zu ATP bei komplexen V (Abbildung 1). Unter Berücksichtigung der zentralen Rolle der Mitochondrien in der Zelle Homöostase, mitochondrialen Stoffwechsel mit der relevanten Modell D. Melanogaster stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, die zugrunde liegenden Mechanismen der verschiedenen abzugrenzen pathophysiologischen Bedingungen oder unter Mobilfunk und Umwelt betont. Überraschend jedoch nur eine Handvoll Studien gemessen tatsächlich mitochondriale Atmung in Drosophila24,25,26. Tatsächlich erfordern Experimente mit dem Ziel, mitochondriale Sauerstoffverbrauch bewerten die Isolation von Mitochondrien. Obwohl für die Messung der verschiedenen mitochondriale Funktionen (z. B. ROS-Produktion oder P/O Verhältnis als Marker der mitochondrialen Effizienz27,28) vorteilhaft, erfordern diese Isolationen in der Regel ziemlich große Mengen Gewebe aus mehreren Individuen24,29. Diese Anforderung für hohe Mengen von Gewebe und Einzelpersonen ist ein wichtiger begrenzende Faktor, besonders wenn man bedenkt, dass alle Personen, die im gleichen Alter sein sollte und vorzugsweise des gleichen Geschlechts für die Experimente machen das Maß der Atmung zu anderen Zeitpunkt am besten verweist mühsam. Darüber hinaus während mitochondriale Isolationen bedeutenden Einblick in die grundlegenden Mechanismen mitochondrialen Stoffwechsel zur Verfügung stellen können, haben die Methoden verwendet, um die Mitochondrien isolieren einige Nachteile wie die Schwierigkeit, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen , Störungen der mitochondrialen Netz- und Veränderung der mitochondrialen Struktur und Funktion29,30,31.
Das Ziel dieser Studie ist es, ein robustes Protokoll zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Drosophila mit nur eine minimale Menge an Gewebe aus sehr wenige Individuen zu präsentieren. Dieses Protokoll besteht aus mitochondriale Sauerstoff Verbrauch Messen in Situ mit permeabilized Muskelfasern29 von Drosophila Thoraxes in Kombination mit hochauflösender respirometrie32,33, 34 , 35. diese Methode hat auch weitere Vorteile im Vergleich zu den klassischen mitochondriale Isolationsmethode da die Interaktionen mit den anderen Komponenten der Zelle als auch mitochondrialen Struktur und Funktion in mehr konserviert werden permeabilized Fasern29,31,36, wodurch dieser Ansatz mehr physiologisch relevanten. Mit diesem Protokoll können mitochondriale Funktionen genau mit hochauflösender respirometrie in nur drei Thoraxes von Drosophila, mit Substraten ermöglicht die Bestimmung der Sauerstoffverbrauch bei mehreren verschiedenen Schritten des ETS ausgewertet werden. Dieses Protokoll könnte daher wichtige Fragen über die grundlegenden Mechanismen helfen, die Stoffwechsel im Zusammenhang mit vielen Umwelt- oder pathophysiologischen Bedingungen zu steuern, unter Ausnutzung des Drosophila-Modells.
Den Sauerstoffverbrauch bei mehreren verschiedenen Schritten des ETS Messen und auswerten wie verschiedene Substrate tragen zur Atmung, verschiedene Substrate (Abbildung 1), Entkuppler und Inhibitoren sind gebrauchte30 nach Permeabilisierung der der Gewebe. Insbesondere werden fortlaufende Ergänzungen von verschiedenen Substraten durchgeführt, um Regen die Einreise von Elektronen durch verschiedene komplexe des ETS. Ein Entkuppler Carbonyl Zyanid-4-(Trifluoromethoxy) Phenylhydrazone (FCCP), wird dann hinzugefügt, bei optimaler Konzentration, die Atmung nicht gekoppelt zu messen, d.h., die Atmung nicht Phosphorylierung stimuliert, um maximale Sauerstoff-Verbrauch. Sequentielle Hemmungen von komplexen I, II und III dann durchgeführt werden, um den Restsauerstoff-Verbrauch zu überwachen, der durch nicht-ETS-Oxidationsreaktionen ist. Zu guter Letzt Komplex IV maximal Atmung Kapazität ausgewertet werden kann, durch die Injektion von N, N, N', N, - Tetramethyl - p-Phenylendiamin (TMPD), eine künstliche Elektron Anbieter und Ascorbat. Es ist wichtig zu beachten, dass die Experimente bei 24 °C durchgeführt werden, da es die Temperatur an der die fliegen ausgelöst werden.

<table><tbody><tr><td>Hochauflösendes Respirometer Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Österreich</td><td>10022-02</td><td>Startup O2K Respirometer Kit &nbsp;</td></tr><tr><td>O2K-Titrations-Set&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Österreich</td><td>20820-03</td><td>Hamilton Spritzen mit unterschiedlichen Volumina &nbsp;</td></tr><tr><td>Datlab Software</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Österreich</td><td>20700</td><td>Software zur Datenerfassung und -analyse &nbsp;</td></tr><tr><td>Antimagnetische Pinzette mit feiner Spitze</td><td>VWR</td><td>82027-400<</td><td>br/> &nbsp;</td></tr><tr><td>Secura225D-1S-DQE</td><td>Sartorius AG, Göttingen, Deutschland</td><td></td><td>Semi-Mikrowaage (wird von mehreren Unternehmen vertrieben)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster Wildtyp w1118</td><td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td><td></td><<td>br/> Lagerzustand: 24 &deg; C</td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-Tetraessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA Lagerbedingungen: RT</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>ACHTUNG: korrosiv gegenüber Metallen, akute Toxizität, Ätzwirkung auf die Haut, schwere Augenschäden, akute aquatische Toxizität. Lagerzustand: RT</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td> Lagerzustand: RT</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td> Lagerzustand: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td> Lagerbedingungen: RT</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td> Lagerbedingungen: RT</td></tr><tr><td>Na2Phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936<</td><td>br/> Lagerbedingungen: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td> Lagerbedingungen: RT</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632<</td><td>br/> Lagerbedingungen: 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>MES-Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250<</td><td>br/> Lagerbedingungen: RT</td></tr><tr><td>Saponin aus Quillaja-Rinde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td>Saponin Lagerbedingungen: RT Lösungsvorbereitung: 5 mg in 1 ml Konservierungslösung. Täglich frisch zubereiten.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td> Lagerzustand: RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td> Lagerzustand: RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td> Lagerzustand: RT</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05470</td><td> Lagerzustand: 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>Na2S2O4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>Natriumdithionit. ACHTUNG: selbsterhitzende Substanzen und Gemische, akute Toxizität, akute aquatische Toxi, chronische aquatische Toxizität. Lagerbedingungen: RT</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Pyruvat Lagerbedingungen: 2-8 &deg; C Lösungsvorbereitung: In MilliQ Wasser. Täglich frisch zubereiten.</td></tr><tr><td>L-(-)-Apfelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>Malat Lagerbedingungen: RT Lösungsvorbereitung: In MilliQ Wasser. Mit KOH neutralisieren und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Adenosin-5'-Diphosphat-Monokaliumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>ADP Lagerbedingungen: -20 &deg; C Lösungsvorbereitung: In MilliQ Wasser. Mit KOH neutralisieren und bei -80 °C lagern.</td></tr><tr><td>Cytochrom c aus dem Pferdeherzen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>Cytochrom c Lagerzustand: -20 &deg; C Lösungsvorbereitung: In MilliQ Wasser. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Prolin Lagerbedingungen: RT Lösungsvorbereitung: In MilliQ Wasser. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Natriumsuccinat zweibasisches Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>Succinat Lagerbedingungen: RT Lösungsvorbereitung: In MilliQ-Wasser. Mit HCl neutralisieren und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>sn-Glycerin-3-phosphat bis(cyclohexylammonium) salz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>Glycerin-3-phosphat Lagerbedingungen: -20 &deg; C Lösungsvorbereitung: In MilliQ Wasser. Mit HCl neutralisieren und bei -80 °C lagern.</td></tr><tr><td>Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP. VORSICHT: akute Toxizität, Sensibilisierung der Haut, chronische aquatische Toxizität. Lagerbedingungen: RT Lösungsvorbereitung: In absolutem Ethanol. In Glasfläschchen bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>VORSICHT: akute Toxizität, Hautreizung, Augenreizung, spezifische Zielorgan-Toxizität (Atemwegssystem), akute aquatische Toxizität, chronische aquatische Toxizität. Lösungszubereitung: In absolutem Ethanol. In dunklen Fläschchen bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Malonsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Malonat. VORSICHT: akute Toxizität, schwere Augenschädigung. Lagerzustand: RT Lösungsvorbereitung: In MilliQ Wasser. Neutralisieren Sie mit KOH. Täglich frisch zubereiten.</td></tr><tr><td>Antimycin A aus Streptomyces sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antimycin A. VORSICHT: akute Toxizität, akute aquatische Toxizität, chronische aquatische Toxizität. Lagerzustand: -20 &deg; C Lösungsvorbereitung: In absolutem Ethanol. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyl-p-phenylendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD Lagerbedingungen: RT Lösungsvorbereitung: In MilliQ-Wasser. In dunklen Durchstechflaschen aufbewahren bei&nbsp; -20 °C.</td></tr><tr><td>(+)-Natrium-L-Ascorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Ascorbat Lagerbedingungen: RT Lösungsvorbereitung: In MilliQ Wasser. In dunklen Durchstechflaschen aufbewahren bei&nbsp; -20 °C.</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Natriumazid. VORSICHT: akute Toxizität (oral und dermal), spezifische Zielorgan-Toxizität (Gehirn), aquatische Toxizität, chronische aquatische Toxizität Lösungsvorbereitung: In MilliQ Wasser. Bei -20 °C lagern.</td></tr></tbody></table>

messung der mitochondrialen sauerstoffverbrauch in permeabilized fasern von drosophila mit minimalen mengen von gewebe

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, stellt eine aufstrebende Modell für die Untersuchung des Stoffwechsels. In der Tat, Drosophila haben Strukturen, die Homolog zu menschlichen Organen, hoch konservierte Stoffwechselwege besitzen und haben eine relativ kurze Lebensdauer, die das Studium der verschiedenen grundlegenden Mechanismen in kurzer Zeit ermöglicht. Es ist jedoch verwunderlich, dass einer der Mechanismen wichtig für Zellstoffwechsel, die mitochondriale Atmung in diesem Modell nicht gründlich untersucht worden ist. Es ist wahrscheinlich, weil das Maß für die mitochondriale Atmung in Drosophila in der Regel eine sehr große Anzahl von Individuen erfordert und die erzielten Ergebnisse nicht sehr reproduzierbar sind. Hier ist eine Methode, die genaue Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch mit minimalen Mengen von Gewebe von Drosophila beschrieben. Bei dieser Methode des Thoraxes seziert und permeabilized sowohl mechanisch mit scharfen Zangen und chemisch mit Saponin, so dass verschiedene Verbindungen zu überqueren die Zellmembran und modulieren die mitochondriale Atmung. Nach Permeabilisierung wird ein Protokoll durchgeführt, um die Kapazität der verschiedenen komplexe der Elektronentransport-System (ETS), verschiedene Substrate zu oxidieren zu bewerten sowie ihre Reaktion auf einen Entkuppler und mehrere Inhibitoren. Diese Methode bietet viele Vorteile im Vergleich zu Methoden mit mitochondrialen Isolationen, wie es mehr physiologisch relevant, ist da die Mitochondrien noch mit den anderen zellulären Komponenten interagieren sind und die mitochondriale Morphologie konserviert. Darüber hinaus Probe Vorbereitungen sind schneller, und die erzielten Ergebnisse sind sehr reproduzierbar. Durch die Kombination der Vorteile von Drosophila als ein Modell für die Untersuchung des Stoffwechsels bei der Auswertung der mitochondrialen Atmung, wichtige neue Erkenntnisse können werden vorgestellt, vor allem wenn die fliegen erleben verschiedene Umwelt- oder pathophysiologischen Bedingungen.

In Abbildung 2ist eine repräsentative Spur von mitochondrialen Sauerstoffverbrauch unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls kostenfrei. Pyruvat und Malat in den Kammern zusammen mit den permeabilized Muskelfasern injiziert werden bezeichnet, die CI-LECK-Atmung, d.h.wenn der Komplex I von der ETS durch stimuliert wird die NADH produziert durch Oxidation von Pyruvat und Malat über die Tricarboxylic Säure Zyklus (CI). Während diese Atemfrequen...

In diesem Papier wird eine Methode zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch mit hochauflösender respirometrie in permeabilized Thoraxes von Drosophila beschrieben. Diese Technik erfordert eine minimale Menge an Gewebe im Vergleich zur klassischen mitochondriale Isolierung-Technik und die erzielten Ergebnisse mehr physiologisch relevant sind.

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die mitochondriale Atmung bei der gemeinen Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) mit Hilfe der hochauflösenden Respirometrie zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zuerst die Drosophila präpariert wird, um den Thorax zu sammeln. Die Thorasen, die die Flugmuskulatur enthalten, werden dann sorgfältig mechanisch mit einer scharfen Pinzette permeabilisiert und mit Saponin inkubiert, um sie weiter zu permeabilisieren. Die Thorasen werden dann in die Kammern eines Respirometers überführt, und der mitochondriale Sauerstoffverbrauch wird mit einer Kombination aus verschiedenen Substraten, Entkopplern und Inhibitoren gemessen. Hallo, ich bin Chlo

measurement-mitochondrial-oxygen-consumption-permeabilized-fibers

Research

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien...

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Die vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung einer Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus minimalen Mengen von Maus-Skelettmuskeln. Diese Assays sind in der Lage, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Hochauflösende Respirometrie verwendet mitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Dies ist eine einfache Technik mitochondrialen Atmungskette Komplexe '(I-IV) Atmungsraten, maximale mitochondrialen Elektronentransportsystemkapazität und mitochondrialen Außenmembran Integrität zu bestimmen.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

Eine Analyse der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung ist für ein gründliches Verständnis der regulatorischen Mechanismen der mitochondrialen Funktionalität erforderlich. Spezifische Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila-Eierstöcken werden in dieser Arbeit beschrieben und demonstriert.

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in Drosophila Ovarien

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung in Drosophila Melanogaster Larven und adulten Gehirn. Eine metabolische Analyzer ist eine angepasste und optimierte Protokoll genutzt. Micro-Gewebe Fesseln waren sind ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls entworfen und speziell für den Einsatz in dieser Analyse erstellt.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

Mitochondriale Atmung ist entscheidend für das organismal überleben; Sauerstoff-Verbrauch ist daher ein hervorragender Indikator für mitochondriale Gesundheit. In diesem Protokoll wir beschreiben die Verwendung von handelsüblichen Respirometer basale messen und maximale Sauerstoff-Verbrauch im Leben, intakt und frei bewegliche Caenorhabditis Elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Die coulometrische Respirometrie ist ideal für die Messung der Stoffwechselrate kleiner Organismen. Bei der Adaption für Drosophila melanogaster in der vorliegenden Studie lag der gemesseneO2-Verbrauch innerhalb des Bereichs, der in früheren Studien für Wildtyp D. melanogaster berichtet wurde. DerO2-Verbrauch pro Fliege war bei CASK-Mutanten , die kleiner und weniger aktiv sind, signifikant niedriger als beim Wildtyp.

Messung desO2-Verbrauchs in Drosophila melanogaster mittels coulometrischer Mikrorespirometrie

In dieser Arbeit stellen wir ein hochauflösendes Respirometrie-Protokoll zur Analyse der Bioenergetik in PINK1 B9-Null-mutierten Fruchtfliegen vor. Die Methode verwendet das SUIT-Protokoll (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

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Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen und Assemblierungen von integralen Membranproteinen in vitro mit verschiedenen Partnerfaktoren in einer lipidproximalen Umgebung.

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Erfahren Sie, wie man den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in permeabilisierten Thoraces von Drosophila mit hochauflösender Respirometrie misst. Diese Methode erfordert minimale Gewebe und liefert physiologisch relevante Ergebnisse.

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

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