Adeno-assoziierten Virus-vermittelten Transgene Ausdruck in genetisch definierten Nervenzellen des Rückenmarks

Das übergeordnete Ziel der intraspinalen Verabreichung von rekombinanten Adeno-assoziierten Viren ist es, die histologische Markierung und funktionelle Manipulation von genetisch definierten Neuronen im dorsalen Rückenmark zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Schmerzbereich zu beantworten, z. B. welche neuronalen Schaltkreise für die Wahrnehmung verschiedener Schmerzmodalitäten erforderlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass genetisch markierte Neuronen auf eine speziell eingeschränkte und zeitlich kontrollierte Weise manipuliert werden können.

Lokalisieren Sie das kaudalste Rippenpaar, indem Sie entlang der Wirbelsäule der anästhesierten Maus tasten. Machen Sie dann einen 1,5 bis 2,5 Zentimeter langen Längsschnitt in die Haut, beginnend mit dem rostralen bis zum kaudalsten Rippenpaar. Hebe die Haut mit einer Pinzette an und löse sie mit einer Schere vom darunter liegenden Muskel.

Halten Sie das freiliegende Gewebe während der gesamten Operation mit sterilem 0,9%igem Natriumchlorid feucht. Machen Sie mit einer feinen Pinzette und einer kleinen Schere einen Schnitt in die nächst dünne membranöse Schicht, direkt neben der Mittellinie, und schneiden Sie sie von den Dornfortsätzen weg. Mehrere anatomische Orientierungspunkte können bei der Identifizierung der richtigen Wirbel helfen.

Im Folgenden beschreiben wir drei Alternativen. Palpieren Sie entlang der Wirbelsäule. Das kaudalste Rippenpaar befindet sich knapp rostral zu den T13-Wirbeln und der Beckenknochen auf Hüfthöhe auf Höhe der L6-Wirbel

Alternativ können Sie die Haut in Richtung Schwanz zurückziehen, um den Beckenkamm freizulegen. Auf gleicher Höhe verbindet sich das kaudalste Paar sichtbarer intetransversaler Bänder mit dem L6-Wirbelsäulenfortsatz. Zählen Sie rückwärts in kaudaler bis rostraler Richtung, um die interessierenden Wirbel zu identifizieren.

Andernfalls suchen Sie die Stelle, an der die Sehne an der Seite der Wirbelsäule am weißesten und medialsten ist. Der T13-Wirbel befindet sich direkt rostral. Innerhalb dieses Wirbels befindet sich das lumbale Rückenmarksegment L4.

Legen Sie das Tier dann auf ein Kissen aus aufgerolltem Gewebe, um es zu den Wirbelsäulenklemmen des stereotaktischen Rahmens zu heben. Richten Sie die Klemmen neben den Zielwirbeln aus. Fixieren Sie eine Klemme in Position und halten Sie dann die Wirbelsäule mit einer Adson-Pinzette fest, während Sie die zweite Klemme fixieren.

Bestätigen Sie die korrekte Klemmung, indem Sie vorsichtig auf die Zielwirbel drücken. Entfernen Sie dann den paraspinösen Muskel über den interessierenden Wirbeln. Machen Sie zunächst einen Schnitt direkt medial zu den Sehnen parallel zur Wirbelsäule.

Machen Sie dann senkrechte Schnitte rostral und kaudal zu den Zielwirbeln. Verwenden Sie als Rongeure den paraspinösen Muskel über den interessierenden Wirbeln. Verwenden Sie bei Bedarf eine Pinzette, um Gewebe zu entfernen, das an den Wirbeln oder über der Dura im intravertebralen Raum verbleibt.

Das dorsale Blutgefäß sollte nun sichtbar sein und die Mittellinie des Rückenmarks markieren. Bei einseitigen Injektionen führen Sie eine partielle Laminektomie mit einem feinen Zahnarztbohrer durch, der mit einem 0,5 Millimeter Kugelfräser ausgestattet ist, um sehr vorsichtig ein Loch in die Mitte der Zielseite der Wirbel zu bohren. Entfernen Sie alle verbleibenden Knochenfragmente mit einer abgeschrägten 26-Gauge-Nadel, um das Rückenmark freizulegen.

Verwenden Sie die Nadel, um die Dura in den intravertebralen Räumen rostral und kaudal der Zielwirbel zu perforieren, etwa 300 Mikrometer lateral des dorsalen Blutgefäßes. Perforieren Sie dann die Dura unter dem Bohrloch. Zu diesem Zeitpunkt sollte Liquor cerebrospinalis aus den Löchern austreten und das Rückenmark sollte sich leicht ausbeulen.

Bereiten Sie die Injektionsspritze vor, indem Sie zuerst die Glaskapillare auf eine Mikroliterspritze aufsetzen. Ziehen Sie die Mutter fest an, um einen festen und sicheren Sitz zu gewährleisten. Füllen Sie die Mikroliterspritze mit sterilem destilliertem Wasser und drücken Sie dann den Kolben.

Wenn das Wasser nicht leicht aus der Spitze ausgestoßen werden kann, ist die Mikropipette wahrscheinlich verstopft und sollte ausgetauscht werden. Montieren Sie die Spritze auf einen Mikromanipulator, der mit einem elektronisch gesteuerten Mikroinjektor verbunden ist. Verwenden Sie dann den Mikroinjektor, um etwa einen Mikroliter Luft anzusaugen, um das Wasser und das Virus zu trennen.

Pipettieren Sie anschließend einen 2,5-Mikroliter-Tropfen verdünnter Viruslösung auf ein Stück Paraffinfilm. Schieben Sie die Spitze der Mikropipette vorsichtig mit dem stereotaktischen Rahmen in das Tröpfchen und ziehen Sie sie nach oben in die Mikropipette. Drücken Sie dann auf Dosieren, bis ein Tropfen Viruslösung an der Spitze austritt.

Ziehen Sie die Spritze zurück und markieren Sie die Mikropipette mit einem Stift mit einer Skala, um das abgegebene Volumen zu überwachen. Bewegen Sie mit dem stereotaktischen Arm die Spitze der Mikropipette über eines der Löcher in der Dura und dann nach unten, bis eine leichte Vertiefung auf der Oberfläche des freiliegenden Rückenmarks erscheint. Um die Injektion auf das Rückenhorn der Wirbelsäule auszurichten, bewegen Sie die Spitze in Schritten von 100 Mikrometern bis zu einer Tiefe von 500 Mikrometern und dann um 200 Mikrometer nach oben, um eine mechanische Stabilisierung des Gewebes zu ermöglichen.

Die endgültige Tiefe der Spitze beträgt 300 Mikrometer. Nachdem Sie die Pumpe so programmiert haben, dass sie 300 Nanoliter bei einer Injektionsgeschwindigkeit von 50 Nanolitern pro Minute injiziert, drücken Sie die Starttaste, um die Infusion zu starten. Überprüfen Sie nach Abschluss der Injektion die Skala auf der Mikropipette, um festzustellen, ob der Virusspiegel gesunken ist.

Lassen Sie die Mikropipette weitere drei Minuten an Ort und Stelle, damit sich der Druck ausgleichen kann. Ziehen Sie die Mikropipette nach drei Minuten langsam zurück und wiederholen Sie den Vorgang für die beiden anderen Injektionsstellen. Entfernen Sie nach der letzten Injektion die Wirbelsäulenklemmen und das Kissen unter der Maus.

Schließen Sie die Schnittschichten mit unterbrochenen Nähten, indem Sie die oberflächlichen Gewebeschichten mit resorbierbaren Nähten und die Haut mit nicht resorbierbaren Nähten vernähen. Tragen Sie jodhaltiges Desinfektionsmittel auf die vernähte Wunde auf. Beenden Sie die Anästhesie und lassen Sie das Tier auf der Heizmatte, bis es sich erholt hat, bevor Sie es in seinen Heimatkäfig zurückbringen.

Am Ende des Versuchs soll das Wirbelsäulengewebe an der Injektionsstelle untersucht werden. Dies ist notwendig, um eine erfolgreiche Injektion und Transduktion zu verifizieren und eine übermäßige Gewebeschädigung durch die Operation auszuschließen. Um die Expressionsniveaus zu veranschaulichen, die durch intraspinale Injektion von rekombinantem AAV erreicht werden können, wurde ein Virus, das für das fluoreszierende Protein eGFP kodiert, in das lumbale Rückenmark von Wildtyp-Mäusen injiziert.

Drei Injektionen im Abstand von etwa einem Millimeter führten zu einer nahezu kontinuierlichen Infektion der Lendenwirbelsäulensegmente L3 bis L5. Die Virusinjektion in einer Tiefe von 300 Mikrometern von der Wirbelsäulenoberfläche führt zu einer vorherrschenden Infektion von Zellen im Hinterhorn des Rückenmarks. Infizierte Zellen konnten aber auch im Bauchhorn gefunden werden. Ein cre-abhängiger Flexvektor, der eGFP exprimiert, wurde in das Rückenmark von GlyT2:Cre-transgenen Mäusen injiziert.

Dies führte zu einer eingeschränkteren eGFP-Expression, die die Verteilung der GLYT2-positiven Neuronen widerspiegelt. Das Befolgen dieses Protokolls ermöglicht das Targeting von drei aufeinanderfolgenden Wirbelsäulensegmenten. Wir haben festgestellt, dass dies ausreicht, um robuste Verhaltensergebnisse zu erhalten.

Diese Technik wird es ermöglichen, die Funktion spezifischer Neuronen- und Zellpopulationen sowie sensorischer Bahnen zu untersuchen.