Name: Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Lernen Sie die Live-Cell-Imaging-Methode zur Visualisierung der Chromosomensegregation während der Mitose in Mäusembryonalfibroblasten mittels Histone2B-GFP und Spinning-Disc-Konfokalmikroskopie. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung genetischer und pharmakologischer Einflüsse auf die Chromosomendynamik.

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Wir möchten Dr. Guo-Chiuan Hung und Dr. Bharatkumar Joshi für wertvolle Kommentare bedanken, die das Manuskript verbessert.

Alle Experimente, die in diesen Studien wurden gemäß Protokollen durch die institutionelle Animal Care and Use Committee bei der Food and Drug Administration (FDA) Forschungseinrichtung genehmigt durchgeführt.
1. Isolierung und Kultur der Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs)
<ol><li>Isolieren Sie Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) aus einem PP2A-B56γ-Maus-Stamm und Wildtyp Wurfgeschwistern, indem Sie standard-Protokoll 7,8,9.</li>
	<li>ExpandMEFs für 3 Durchgänge, Einfrieren und lagern bis für Experimente 8benötigt.</li>
</ol>2. Kultivierung Mefs in 2-Well gekammerten Deckglas für Live-Imaging
<ol><li>Bereiten Sie 500 mL MEF Wachstumsmedien Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM/F12) mit 10 % mit fetalen Bovine Serum (FBS), 1 X Penicillin/Streptomycin Antibiotika, L-Glutamin (200 mM) und 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) in einen 500-mL-Medien-Flasche.</li>
	<li>Tauen Sie Fläschchen mit gefrorenen MEFs vom Wildtyp und PP2A-B56γ-Mäuse in der Passage 3 in vorgewärmten Wasserbad bei 37 ° C.</li>
	<li>Transfer MEFs, 15-mL-Röhrchen aufgetaut und die 15-mL-Röhrchen mit einer 10 mL-Pipette langsam tropfenweise 20 mL DMEM/F12 Medien hinzufügen.</li>
	<li>Übertragen Sie MEFs zusammen mit 20 mL DMEM/F12 Wachstumsmedien in T75 Kolben, und erweitern Sie sie, bis die Zellen 70 % Zusammenfluss sind. Konfluenz dürfte mit einem inversen Mikroskop bei 4 X oder 10 X Vergrößerung.</li>
	<li>Aspirat das Wachstumsmedium mit einer Glas-Weide pipette ein Vakuum-System in der Haube befestigt, 3 mL 0,25 % Trypsin/EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Add 3 mL DMEM/F12 Wachstumsmedium, die Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen mit geringer Geschwindigkeit (300 X g) für 5 min bei Raumtemperatur. Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL DMEM/F12 Nährmedium bei 37 ° C in einem Wasserbad vorgewärmt.</li>
	<li>Auflisten von Zellen unter Verwendung der Trypan blau Ausschluss-Methode oder anderen entsprechenden Zelle zählen Methode 8.</li>
	<li>Etwa 20.000 Samen MEFs/Brunnen in einer 2-gut gekammerten Deckglas. Fügen Sie 200 µL/Well DMEM/F12 Wachstumsmedium und lassen Sie die Zellen durch brüten sie über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2befestigen.</li>
</ol>3. Synchronisation
<ol><li>Synchronisieren von MEFs in G0/G1-Phase durch Inkubation der Zellen in DMEM/F12 Wachstumsmedien mit 0,1 % FBS für 24 h, um eine maximale Anzahl von Zellen in der G0/G1-Phase zu erhalten. Hinweis: Obwohl Serum Hunger als Methode des Geschmacks verwendet wurde, können verschiedene andere Methoden je nach der mitotischen Phase verwendet werden bei denen Zellen erforderlich sind, um verhaftet 10sein.</li>
</ol>4. Kennzeichnung
<ol><li>Bereiten Sie 1,5 mg/mL Stammlösung von Nocodazole in DMSO. Nocodazole Festnahmen durch Hemmung der Mikrotubuli Bildung 10Zellen in G2/M-Phase.</li>
	<li>Drei Tage nach Synchronisation, fügen Sie 200 µL Wachstumsmedium (mit 10 % FCS), 200 ng/mL Nocodazole und CL-HB Regent (Histon 2 b-GFP BacMam 2.0).</li>
	<li>Berechnen Sie die CL-HB-Regent Partikel pro Zelle (PPC) Zellen wie folgt hinzugefügt werden: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> Wo die Anzahl der Zellen die geschätzte Gesamtzahl der Zellen zum Zeitpunkt der Kennzeichnung ist, PPC ist die Anzahl der Teilchen pro Zelle, und 1 × 108 ist die Anzahl der Teilchen pro mL Reagenz. Z. B. auf Label 20.000 Zellen mit einem PPC 30 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> Hinweis: CL-HB Regent funktioniert gut mit den meisten Zelltypen zwischen 10 und 50 PPC. Allerdings funktionierte 30 PPC am besten für diese Studie.</li>
	<li>18 h bei 37 ° C und 5 % CO2MEFs inkubieren. Hinweis: Für das aktuelle Experiment trat Visualisierung von Chromosomen in mitotischen Zellen, die Flucht des Spindel Baugruppe Prüfpunkt 18 h nach Zellzyklus Festnahme mit Nocodazole.</li>
</ol>(5) Visualisierung rückständiger Chromosomen
<ol><li>Visualisieren Sie Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) mit einem drehenden Scheibe confocal Mikroskopsystem eine Klimakammer mit einem Ölimmersion, 63 X Objektiv ausgestattet.<ol>
<li>Verwenden Sie Erregung Wellenlänge von 488 nm und Emission Wellenlänge 450 nm für die GFP Kanal Bildaufnahme.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Datenträgersystem confocal Mikroskop Spinnen mit der Fähigkeit der motorisierten Scan Stufen, Z-Piezo einfügt, Bühne-Top Inkubation und direkte Fluoreszenz Erholung nach dem Foto bleichen für diese Technik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Einen Tag vor Bildgebung, schalten Sie die Klimakammer macht und über Nacht die ganze Kammer bei 37 ° C erwärmen.</li>
	<li>Schalten Sie Strom für Mikroskopstativ, Kamera, Spinning Disk Unit, Beleuchter, Argonlaser, Computer und motorisierte Bühne.</li>
	<li>Lassen Sie das System 3 min. warmlaufen; Starten Sie den Argonlaser durch Drehen am Zündschlüssel. Schalten Sie den Kippschalter für Argonlaser aus dem "Standby", "laser"-Lauf.</li>
	<li>Die Daten-Erfassung und Verarbeitung-Software zu starten.</li>
	<li>Den CO-2 -Controller für die Bühne Top Inkubator zu initiieren und die Konzentration von CO2 auf 5 % festgesetzt. Dies muss vor Beginn der Bildgebung.</li>
	<li>Entfernen Sie die gekammerten Deckglas aus dem Inkubator und stellen auf der Bühne für die Visualisierung. Zellen über ein Öl eintauchen 63 X Objektiv (NA1.4) zu visualisieren.</li>
	<li>Blick durch das Okular Objektive, das Bild zu konzentrieren und eine Zelle in Kernhülle Aufschlüsselung (NEBD) Phase zu identifizieren.</li>
	<li>Geeigneten Laser (488 nm Argonlaser Histone2B-GFP zu visualisieren) zu initiieren.</li>
	<li>Übernahme-Kontroll-Fenster zu öffnen und Belichtungszeit für den GFP-Kanal eingestellt. Eine Zelle im NEBD zu identifizieren.<ol>
<li>Manuell bestimmen Sie die Zielzelle oben und unten Brennebene, und geben Sie die Xyz optische Einstellungen-Schnitt.</li>
		<li>Beobachten Sie es für 20 min; Wenn die Zelle nicht durch Zellteilung fort, stoppen Sie Bildaufnahme nach 20 min zu, und fahren Sie mit der nächsten Zelle NEBD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ca. 1 h pro Zelle ist Bild rückständigen Chromosomen während der Mitose in PP2A-B56γ-Zellen notwendig, der aus der SAC entkommen. Um Daten für einen Film zu erhalten, fotografieren Sie alle 3 Minuten. Hinweis: Wildtyp Zellen zu verhaften und komme nicht voran, vorbei an NEBD wenn mit Nocodazole behandelt.</li>
	<li>Speichern von Bildern in Zvi-Datei-Format zur weiteren Analyse.</li>
</ol>6. Verarbeitung und Analyse von Bildern
Hinweis: Führen Sie dreidimensionale Bildverarbeitung und-Analyse mit jeder verfügbaren Software wie Axiovision Version 4.8.2 oder Imaris Version 8.2. Für diese Studie die ImageJ wurde Software verwendet.
<ol><li>Öffnen Sie die Bildsequenz. Wenn die Bilder bereits in einem Stapel-Format sind, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn nicht, kombinieren alle relevanten Bilder in einem Stapel mit "Bild &gt; Stacks &gt; Bilder zum Stapel" in der Menüleiste.</li>
	<li>Durchführen Sie alle Einstellungen je nach Bedarf, Helligkeit/Kontrast und Ebenen.</li>
	<li>Der Film einen Zeitstempel hinzu:<ol>
<li>Gehen Sie auf "Bild &gt; Stacks &gt; Label..." in der Menüleiste.</li>
		<li>Wählen Sie das entsprechende Format Zeit Startwert und der zeitliche Abstand zwischen jedem Bild.</li>
		<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Vorschau" und passen Sie Speicherort und das Format Einstellungen an. Drücken Sie "OK", um den Zeitstempel anzuwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Der Film eine Maßstabsleiste hinzufügen:<ol>
<li>Legen Sie die Bildskalierung unter "Analyze &gt; Set Maßstab" in der Menüleiste.</li>
		<li>Geben Sie im Feld "Abstand in Pixel" eine Anzahl von Pixeln, wo die Entfernung bekannt ist, und geben Sie im Feld "Bekannte Distanz" den Abstand. Legen Sie die richtige Einheit der Länge für den Abstand, z. B.in µm. Drücken Sie 'OK', um die Anwendung der Skala auf den Stapel.</li>
		<li>Gehen Sie auf "Analyze &gt; Tools &gt; Skala Bar..." die Maßstabsleiste hinzufügen. Die Größe des Balkens als "Breite in µm", und passen Sie die verbleibenden Formatierung Optionen nach Bedarf. Kontrollkästchen Sie das "Beschriften Sie alle Scheiben" um den gesamten Stapel die Maßstabsleiste hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eine Vorschau des Films durch einen Klick auf den dreieckigen Play-Button am unteren linken Rand des Bildfensters. Passen Sie die Frame Rate mit "Bild &gt; Stacks &gt; Animation &gt; Animationsoptionen in der Menüleiste.</li>
	<li>Exportieren Sie die Filmdatei durch die Auswahl "Datei &gt; Speichern unter &gt; AVI..." und wählen Sie die Bildrate und Kompression.</li>
	<li>Drücken Sie 'OK', um das Speichern wählen Speicherort und den Dateinamen. Drücken Sie "Save", um die Filmdatei speichern.</li>
</ol>

<ol><li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+CIN%3A+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li>
<li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+issues%3A+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li>
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<li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+segregation+and+cancer%3A+cutting+through+the+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li>
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<li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP2A-B56%CE%B3+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362(2014).</li>
<li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26904940">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li>
<li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+%28hPrm1%29+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li>
<li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine%3A+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Zellzyklus Kontrolle Checkpoints, die genaue Chromosom Abtrennung sicherstellen zu verhindern, dass Aneuploidie und Zelle Transformation 1,2,3. In der vorliegenden Studie fanden wir die Inaktivierung von PP2A-B56γ führte zu einem geschwächten Spindel Baugruppe Checkpoint. Live Cell Imaging konnten wir beobachten, dass chromosomale MIS Trennung während der Mitose in PP2A-B56γ MEFs mit Nocodazole 9behandelt...

In das folgende Protokoll beschreiben wir eine bequeme Methode, um die chromosomalen Segregation und mitotischen Fortschreiten im Zellzyklus in Maus embryonalen Fibroblasten mit 2 b-GFP Histone, BacMam 2.0 Kennzeichnung und live Cell Imaging zu visualisieren.
Zellzyklus Kontrolle Checkpoints überwachen Chromosom Abtrennung und spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der die genetische Integrität der Zelle 1,2,3. Ansammlung von MIS getrennten Chromosomen führt zu Aneuploidie, die ist ein Markenzeichen von soliden Tumoren 4. Daher, Erkennung von rückständigen Chromosomen als Methode lässt sich um chromosomale Instabilität zu studieren.
Proteine können verwendet werden, live Chromosom Abtrennung zu visualisieren und chromosomalen hinkt aber die Generation der mCherry-Tags oder H2B-GFP markiert Protein erfordert umfangreiches Wissen von gen Lieferung und Molekularbiologie 5Eindringmittel gekennzeichnet. Hier beschreiben wir die Verwendung von CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0-Reagenz, CL-HB Regent, der Einfachheit halber nachfolgend genannt. Dieses Reagenz ist sofort einsetzbar und damit Bedenken Vektor Qualität und Integrität. Darüber hinaus erfordert das Reagenz nicht den Einsatz von potenziell schädlichen Behandlungen oder Lipide und Farbstoff-Loading Chemikalien. Im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenzmarkierungen Flecken die CL-HB-Regent unabhängig von Funktion (zB., Membranpotential). Die CL-HB-Regent kann einfach hinzugefügt, um die Zellen und Protein-Expression über Nacht inkubiert. Die CL-HB-Regent repliziert nicht in Säugetierzellen und Biosafety Niveau (BSL) 1 Labor Einstellungen verwendet werden. Auch kann dieses transiente Transfektion nach Übernachtung Inkubation für bis zu 5 Tage, genügend Zeit nachgewiesen werden, zur dynamischsten zellulären Analysen durchführen.
Alternativ konnte Chromosomenanomalien durch verschiedene Techniken wie Durchflusszytometrie, Immunohistochemistry oder Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) 6untersucht werden. Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um Aneuploidie, die gemessen werden kann anhand der DNA-Gehalt und die Phase der Zellen in den Zellzyklus zu studieren. Obwohl Durchflusszytometrie Aneuploidie Messen verwendet werden kann, bietet es keine Informationen auf MIS chromosomalen Segregation. Fisch und immunhistochemische Techniken verwenden fluoreszierende Sonden binden an DNA oder Chromosomen. Obwohl diese Techniken eine Momentaufnahme des Status von einer Bevölkerung der Zellen bieten, erlauben sie nicht live Cell imaging, dadurch fehlen Informationen, die durch räumlich-zeitliche Visualisierung der Zytokinese in bestimmten Zellen, die über einen bestimmten Zeitraum hinweg verfolgt.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um rückständige Chromosomen oder chromosomalen MIS Segregation im Nocodazole behandelt Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) von PP2A-B56γ-Mäusen isoliert zu studieren. Zusätzlich zu oben Anwendung bietet dieses Protokoll ein einfaches Tool zum Beschriften und chromosomalen Segregation in verschiedenen Zelltypen, die zur Regulierung des Zellzyklus Untersuchung oder chromosomale Instabilität in Tumorzellen zu visualisieren. Darüber hinaus kann es auch chromosomale Instabilität verursacht durch verschiedene medikamentöse Behandlungen zu studieren oder Studie zu den Auswirkungen von gen Knock-out führt MIS chromosomalen Segregation verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>EMD Millipore</td><td>MX 1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Aufbewahrungsboxen für kryogene Fläschchen</td><td>Fisherbrand</td><td>10-500-28</td><td></td></tr><tr><td>Kryogene Fläschchen</td><td>Corning/costar</td><td>431416</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>Cellstar</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>2 gut gekammertes Deckglas</td><td>Nunc</td><td>155380PK</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Cell Profiler</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Cellometer Vision Trio</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Histon 2B-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Cell Observer Konfokales Mikroskopsystem mit Spinning-Disk</td><td>Carl Zeiss</td><td>Mikroskopie Zeiss Cell Observer SD</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Thermoscientific</td><td>280 series</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Sanyo kommerzielle Lösungen</td><td>MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>The Baker Company</td><td>SterilGard</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Software</td><td>Zeiss</td><td>Ver.4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institute of Health</td><td>Ver. 1.51r</td><td></td></tr></tbody></table>

live cell imaging der segregation der chromosomen während der mitose

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomen müssen zuverlässig und gleichmäßig in Tochterzellen während der mitotische Zellteilung getrennt werden. Treue der chromosomalen Segregation wird durch mehrere Mechanismen gesteuert, die die Spindel Baugruppe Checkpoint (SAC) enthalten. Der SAC ist Teil eines komplexen Feedbacksystems, das Prävention einer Zelle Fortschritte durch Mitose zu verantworten hat, es sei denn alle chromosomalen Kinetochore angebracht haben, um die Mikrotubuli Spindel. Chromosomale rückständigen und abnorme Chromosom Segregation ist ein Indikator der dysfunktionalen Zellzyklus Kontrolle Checkpoints und kann verwendet werden, um die genomische Stabilität der teilenden Zellen zu messen. Deregulierung des SAC kann die Umwandlung von einer normalen Zelle in einer malignen Zelle durch die Anhäufung von Fehlern während der chromosomalen Segregation führen. Umsetzung des SAC und die Bildung von komplexen Kinetochor sind streng reguliert durch Wechselwirkungen zwischen Kinasen und Phosphatase wie Protein Phosphatase 2A (PP2A). Dieses Protokoll beschreibt live Cell Imaging rückständiger Chromosomen in Maus embryonalen Fibroblasten isoliert von Mäusen, die einen Ko von der regulatorischen Untereinheit PP2A-B56γ hatte. Diese Methode überwindet die Mängel anderer Zellzyklus Kontrolle bildgebender Verfahren wie Durchflusszytometrie oder Immunocytochemistry, die nur eine Momentaufnahme eines Zelle Zytokinese Status anstelle einer dynamischen räumlich-zeitliche Visualisierung der Chromosomen während der Mitose.

MEFs vom Wildtyp und PP2A-B56γ-Mäuse waren in einem 2-Well-Kammer Abdeckung Glas ausgesät und legen durfte. Am 2. Tag, MEFs wurden synchronisiert mit 0,1 % FBS für 24 h. Am 3. Tag, MEFs in Medien mit 200 ng/mL inkubiert Nocodazole und 30 PPC CL-HB Regentwere 18 h bei 37° C und 5 % CO2. Am 4. Tag wurden die Zellen abgebildet mit einem drehenden Scheibe confocal Mikroskopsystem (Abbildung 1). Live Cell Imaging wurde verwendet, um das Schic...

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und bequeme Methode zum Beschriften und visualisieren live Chromosomen in mitotischen Zellen mit Histone2B-GFP BacMam 2.0-Gütezeichen und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopie System.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Markierung und Visualisierung lebender Chromosomen in mitotischen Zellen unter Verwendung von Histon, 2B-GFP, BacMam 2.0-Markierung und einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskopiesystem. Diese Methode kann verwendet werden, um mitotische Chromosomen in kultivierten Zellen sichtbar zu machen, um die Auswirkungen genetischer Modifikationen oder medikamentöser Behandlungen auf die Chromosomensegregation zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache und bequeme Methode zur Markierung und Visualisierung lebender Chromosomen in mitotischen Zellen bietet.Das Live-Imaging-Verfahren wird von Dr. Kazuyo Takeda demonstriert, der die Microscopy and Imaging Core Facility in der Abteilung für virale Produkte am FDA Center for Biologics Evaluation and Research betreibt. Die in diesem Experiment verwendeten embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus werden über Nacht in einem Deckglas mit zwei Vertiefungen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 gezüchtet, wie im Textprotokoll beschrieben. Synchronisieren Sie am nächsten Tag die MEFs in der G0/G1-Phase, indem Sie sie in DMEM/F12-Wachstumsmedium mit 0,1 % FBS inkubieren.Bereiten Sie am Tag der Markierung eine Stammlösung von 1,5 Milligramm pro Milliliter Nocodazol in DMSO vor. Ein kritischer Schritt besteht darin, die richtige Menge an CL-HB-Partikeln pro Zelle zu berechnen, um eine ausreichende Markierung für die Chromosomenvisualisierung ohne Toxizität für die Zellen zu erreichen. Wir haben zuvor durch Titrationsexperimente festgestellt, dass 30 PPC am besten wirkt.Zu den MEFs werden 200 Mikroliter Wachstumsmedium mit 10 % FCS, 200 Nanogramm pro Milliliter Nocodazol und CL-HB-Reagenz mit 30 Partikeln pro Zelle hinzugefügt. Inkubieren Sie die MEFs 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Die Visualisierung der MEFs erfolgt mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskopsystem, das mit einer Klimakammer und einer 63X-Objektivlinse ausgestattet ist.Schalten Sie einen Tag vor der Bildgebung die Klimakammer ein und erwärmen Sie die gesamte Kammer über Nacht auf 37 Grad Celsius. Schalten Sie am nächsten Tag das Mikroskopstativ, die Kamera, die rotierende Scheibeneinheit, das Illuminator, den Argonlaser, den Computer und den motorisierten Tisch ein. Nachdem Sie das System drei Minuten lang erwärmt haben, starten Sie den Argon-Laser, indem Sie den Zündschlüssel einschalten.Schalten Sie den Kippschalter für den Argonlaser von Standby auf Laserlauf. Starten Sie die Datenerfassungs- und -verarbeitungssoftware. Starten Sie den CO2-Regler für den Inkubator auf der Bühne und stellen Sie die CO2-Konzentration auf 5 % einEntfernen Sie das Deckglas aus dem Inkubator, platzieren Sie es auf dem Mikroskoptisch und wählen Sie die Ölimmersionsobjektive 63X aus.Schauen Sie durch die Okularlinsen, fokussieren Sie das Bild und identifizieren Sie eine Zelle im Stadium des Zusammenbruchs der Kernhülle (Nuclear Envelope Breakdown, NEBD). Initiieren Sie den 488-Nanometer-Argon-Laser, um Histon 2B-GFP zu visualisieren. Öffnen Sie das Fenster zur Steuerung der Aufnahme und stellen Sie die Belichtungszeit für den GFP-Kanal ein.Identifizieren Sie eine Zelle, die sich in NEBD befindet. Bestimmen Sie dann manuell die obere und untere Fokusebene der Zelle und geben Sie die Einstellungen für den optischen XYZ-Schnitt ein. Beobachten Sie die Zelle 20 Minuten lang.Es ist wichtig, sich darüber im Klaren zu sein, dass nicht alle Zellen eine Mitose durchlaufen und der mitotische Fortschritt aktiv überwacht werden muss. Wenn die Zelle nach 20 Minuten die Zellteilung nicht durchläuft, stoppen Sie die Bildaufnahme und fahren Sie mit der nächsten Zelle fort, die sich in NEBD befindet. Um Daten für einen Film zu erhalten, nehmen Sie alle drei Minuten Bilder auf.Etwa eine Stunde pro Zelle wird benötigt, um verzögerte Chromosomen während der Mitose in PP2A-B56-gamma-Zellen abzubilden, die aus dem Kontrollpunkt der Spindelassemblierung entwichen sind. Speichern Sie die Bilder im ZVI-Dateiformat für die weitere Analyse. Die Bildgebung lebender Zellen wurde verwendet, um das Schicksal einzelner Zellen auf ihrem Weg von der NEBD durch die Mitose zu visualisieren.Nach der Behandlung mit Nocodazol wurden alle 21 beobachteten Wildtyp-Zellen in der Metaphase arretiert. Im Gegensatz dazu konnten von den 21 beobachteten Zellen, denen PP2A-B56-gamma fehlte, 16 nach einer Nocodazol-Behandlung eine Mitose durchlaufen. Darüber hinaus wurde bei 13 dieser MEFs eine abnormale Chromosomensegregation festgestellt.Ein Beispiel für eine PP2A-B56-gamma-Zelle, die einer chromosomalen Fehltrennung unterzogen wird, ist in diesem Videoclip zu sehen. Sobald diese Technik gemeistert ist, dauert es drei bis vier Tage, abhängig von der Zellbehandlung vor dem Markierungsprotokoll. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass es sich um eine vorübergehende Transfektion handelt und Signale nur bis zu fünf Tage detektiert werden können.Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur Zellzyklusregulation, zur genomischen Instabilität und zur Qualität der Zelltherapieprodukte zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung könnte diese Technik verwendet werden, um die Live-Bildgebung von Chromosomen in einer Vielzahl von Zelllinien zu untersuchen, wie z. B. primären Zelllinien, Stammzellen, Neuronen und immortalisierten T-Zellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie lebende Chromosomen in mitotischen Zellen mit der Histon-2B-GFP-BacMam-2-Markierung und einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskopiesystem einfach markieren und visualisieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir eine grundlegende Protokoll, um Bild und Quantifizierung der mitotischen Zeitpunkt der Live-Säugetier-Zellkultur-Zellen nach siRNA-Transfektion.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Quelle: Schumacher, D., und Sogaard-Andersen, L. Fluoreszenz-Lebendzellbildgebung des vollständigen vegetativen Zellzyklus des langsam wachsenden sozialen Bakteriums Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert die Verwendung von Live-Zell-Bildgebung zur Verfolgung fluoreszenzmarkierter Chromosomenursprünge während der bakteriellen Zellteilung. Es erfasst die Dynamik der Chromosomensegregation mittels Zeitraffer-Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskopie.

Zeitrafferbildgebung der Chromosomensegregation bei fluoreszierend markierten Bakterien

Neurale Vorläufer Mitose ist ein kritischer Parameter der Neurogenese. Viel von unserem Verständnis der neuralen Vorläufer Mitose basiert auf der Analyse von festen Gewebe basiert. Live-Bildgebung in der embryonalen Hirnschnitten ist eine vielseitige Technik zur Mitose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in einer kontrollierten Umgebung zu beurteilen.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Live Cell Imaging bietet eine Fülle von Informationen über einzelne Zellen oder ganze Bevölkerungen, die unerreichbar ist von festen Cell imaging allein. Hier werden live-Cell imaging Protokolle Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel bewerten beschrieben.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Hier präsentieren wir Live-Zell-Bildgebung, eine ungiftige Mikroskopiemethode, die es Forschern ermöglicht, das Proteinverhalten und die Kerndynamik in lebenden Spalthefezellen während Derose und Meiose zu untersuchen.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Zellteilungen können in Echtzeit mit fluoreszierend markierten Proteinen und Zeitraffermikroskopie visualisiert werden. Mithilfe des hier vorgestellten Protokolls können Benutzer die Timing-Dynamik der Zellteilung, die mitotische Spindelbaugruppe sowie den Chromosomenkongress und die Segregation analysieren. Defekte in diesen Ereignissen nach RNA-Interferenz (RNAi)-vermitteltem Genknockdown können bewertet und quantifiziert werden.

Einsatz von Drosophila S2-Zellen für Live Imaging of Cell Division

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression vor. Unsere Anwendung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es dem Anwender, Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose zu identifizieren, mitotische Defekte zu verfolgen und zu identifizieren und die Spindeldynamik und das mitotische Zellschicksal bei Exposition gegenüber Anti-Mitotik-Medikamenten zu analysieren.

Live Cell Imaging zur Bewertung der Dynamik von Metaphasen-Timing und Zellschicksal nach mitotischen Spindelstörungen

Die Zeitraffer-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Meiose in knospender Hefe. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Zellzyklus-Synchronisation, Zeitraffer-Mikroskopie und bedingte Depletion eines Zielproteins kombiniert, um zu zeigen, wie die Funktion eines bestimmten Proteins während der meiotischen Chromosomentrennung untersucht werden kann.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Lernen Sie die Live-Cell-Imaging-Methode zur Visualisierung der Chromosomensegregation während der Mitose in Mäusembryonalfibroblasten mittels Histone2B-GFP und Spinning-Disc-Konfokalmikroskopie. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung genetischer und pharmakologischer Einflüsse auf die Chromosomendynamik.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

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