Punktion-induzierte Iris Neovaskularisation als einem Mausmodell der Rubeosis Iridis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Induktion von Irisgefäßen, die eine direkte in-vivo-Visualisierung angiogener Prozesse ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Augenheilkunde zu beantworten, insbesondere bei neovaskulären Erkrankungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Albino-Mäuse verwendet, um die vivo-Visualisierung der Blutgefäße zu ermöglichen.

Durch diese Methode kann ein Einblick in die neovaskuläre Erkrankung des Auges gegeben werden. Es kann auch als allgemeines Modell der Angiogenese angewendet werden, z. B. bei der Erprobung neuer angiogener Therapien. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Irisdissektion aufgrund der geringen Größe des Mausauges eine Herausforderung darstellt.

Mit etwas Übung lässt es sich jedoch meistern. Nachdem Sie eine P12.5-Maus anästhesiert und für den Eingriff vorbereitet haben, bringen Sie sie in die seitliche Liegeposition unter ein Stereoskop und bestätigen Sie, dass die Maske gut positioniert ist. Das Auge sollte das Sichtfeld ausfüllen.

Eine klare Fokussierung des Auges ist unerlässlich. Als nächstes schieben Sie mit einer kleinen Bindezange in der nicht dominanten Hand vorsichtig das Auge hervor, indem Sie Druck nach unten auf die Augenlider, dorsal und ventral zum Auge ausüben. Es hilft, das Augenlid fest im Griff zu haben.

Bevor Sie fortfahren, dokumentieren Sie das Gefäßsystem bei 40X. Verwenden Sie als Nächstes das Stereoskop, um den Hornhautlimbus zu lokalisieren. Der Limbus von Albino-BALB/c-Mäusen kann leicht als zirkulärer Gefäßplexus hinter der Hornhaut identifiziert werden.

Halten Sie nun in der dominanten Hand eine abgeschrägte Nadel mit 30 Gauge und führen Sie damit eine kleine Aderhautpunktion in der Nähe der hinteren Limbusgrenze der Uvea zwischen dem Ziliarkörper und der Ora serrata durch. Mache die Punktion nur mit der Spitze der Nadel und nicht mehr als mit der Hälfte der Fase. Vermeiden Sie es, die Linse zu zerreißen.

Die Punktion sollte selbstdichtend sein, aber dennoch eine intraokulare Injektion der untersuchten Substanzen durch die Wunde ermöglichen. Als nächstes führen Sie eine zweite Aderhautpunktion an der gegenüberliegenden Stelle des Auges durch. Optimieren Sie die Einstiche so, dass sie sich in der dorsalen und ventralsten Position befinden.

Wiederholen Sie die Aderhautpunktionen alle vier Tage an den gleichen beiden Positionen bis P24.5. Und bevor Sie die Punktion wiederholen, prüfen Sie immer, ob es sich um einen traumatischen Katarakt handelt. Nachdem Sie das Auge enukleiert und wie im Textprotokoll beschrieben fixiert haben, entfernen Sie die Fixierlösung und spülen Sie das Auge dreimal mit frischem PBS aus.

Legen Sie dann das Auge mit der Vorderkammer nach oben auf eine glatte, trockene Oberfläche. Führen Sie als Nächstes eine abgeschrägte 30-Gauge-Nadel hinter dem Limbus ein, um einen Eintrittspunkt zu schaffen. Befestigen Sie dann den vorderen Abschnitt mit einer kleinen Bindezange und verwenden Sie eine gerade Clayman-Vannas-Schere, um den Limbus zu schneiden, während Sie das Auge drehen.

Die Verwendung von Teilschnitten kann den Prozess erleichtern. Wenn dies abgeschlossen ist, sollte sich der hintere Augenabschnitt lösen. Positionieren Sie als Nächstes das vordere Segment nach unten, um die Linse freizulegen.

Entferne die Linse vorsichtig, indem du sie mit einer kleinen Pinzette greifst und nach oben ziehst. Positionieren Sie nun den vorderen Augenabschnitt mit der Hornhaut nach unten und mit dem Schnitt senkrecht zum Gesichtsfeld. Fassen Sie dann vorsichtig das Gewebe hinter dem Ziliarkörper mit einer kleinen Bindezange in der nicht dominanten Hand.

Clayman-Vannas gerade Schere zum Trimmen direkt vor dem Ziliarkörper mit dem Ziel, das Trabekelwerk zu entfernen und die Iris zu isolieren. Die Iris sollte sich dann innerhalb der Hornhaut bewegen. Fassen Sie anschließend mit einer kleinen Bindezange die Hornhaut und übertragen Sie die vordere Augenmuschel vorsichtig auf eine 96-Well-Platte mit 200 Mikrolitern PBS.

Behalten Sie den Griff auf der Hornhaut bei und fahren Sie mit dem Präparieren der Iris fort, indem Sie das Gewebe mit PBS spülen. Bei Bedarf kann eine 30-Gauge-Nadel verwendet werden, um die Iris zu verschieben. Entferne nun die Hornhaut mit der kleinen Bindezange.

Die isolierte Iris kann dann in PBS bei vier Grad Celsius zwischengelagert werden, bis mit ihr experimentiert wird. Albino BALB/c-Mäuse bei P12,5 wurden wie beschrieben jeden vierten Tag bis P24,5 einer Aderhautpunktion unterzogen. Aufgrund der Transparenz der Hornhaut und des Melaninmangels bei BALB/c-Mäusen ist das Irisgefäßsystem bei P16,5-Welpen gut sichtbar und intensiviert sich während der Dauer des Protokolls.

Bei P27,5 wurden die Mäuse eingeschläfert und ihre Iris sorgfältig präpariert. Die Einstiche induzierten eine vaskuläre Reaktion der Iris, indem sie das Wundheilungssystem auslösten. Die Immunhistochemie wurde gegen PECAM1 durchgeführt.

Der resultierende Fleck zeigte eine Zunahme des Gesamtgefäßsystems in der Iris von punktierten Augen im Vergleich zu Kontrollen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Iris-Angiogenese induzieren und die Iris der Maus erfolgreich isolieren können. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie QBCR durchgeführt werden, um zusätzliche molekulare und zelluläre Fragen zu beantworten, wie z.B. die Prüfung der Wirksamkeit von pro-angiogenen oder anti-angiogenen Substanzen.

Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher geebnet, neovaskuläre Erkrankungen mit nicht-invasiven In-vivo-Methoden am Modell kleiner Nagetiere zu erforschen.