Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

Diese Methode kann dazu beitragen, klinisch nützliche Immuntherapien für Clostridium difficile-Infektionen patientenspezifisch zu optimieren und auszuwählen und die Immunantwort des Menschen auf Clostridium difficile aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genaue und gleichzeitige Quantifizierung von Multi-Isotyp- und stammspezifischen Antikörperantworten auf C.difficile-Antigene ermöglicht. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da Fachwissen bei der Einrichtung und Optimierung eines Panels hochgereinigter Antigene und beim Aufbau der technologischen Plattform erforderlich ist.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da methodische Listentypen, die an der Vorbereitung der Mikrowellenplatte, dem Array-Druck, einem sicheren Verfahren und der Datenanalyse beteiligt sind, Aufmerksamkeit für die Details erfordern. Ein Teil des Verfahrens wird von Sam Greenwood, einem Techniker aus meinem Labor, vorgeführt. Verdünnen Sie zunächst Clostridium difficile-Antigene und Druckpuffer auf optimale Konzentration.

Übertragen Sie anschließend 10 Mikroliter Antigenlösung auf eine 384-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit einer Plattendichtung ab und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300-facher Schwerkraft. Verwenden Sie für den Microarray-Druck einen Gasbrenner, um den Silizium-PIN dreimal für jeweils zwei Sekunden zu erhitzen.

Spülen Sie dann den Silikon-PIN dreimal für jeweils drei Sekunden in sauberem Wasser ab. Legen Sie die Microarray-Platte in die Ladekassette eines Arrayers. Werfen Sie das Fach aus, legen Sie dann die Aminosilan-Objektträger in das Objektträgerfach und drücken Sie die OK-Taste, um das Vakuum einzuschalten.

Stellen Sie sicher, dass alle Folien gesichert sind, und klicken Sie dann auf OK. Setzen Sie das Fach wieder in den Ursprung ein und schließen Sie den Deckel. Starten Sie als Nächstes das entsprechende Programm und gehen Sie zu Datei, dann zu Microarraying-Parametern und dann zu Öffnen. Wählen Sie die Datei Clostridium difficile, um alle Antigene in vierfacher Ausfertigung zu drucken.

Öffnen Sie in diesem Fenster die Registerkarte Quelle, um die Probenlagerung anzugeben, und die Registerkarte Ziel, um Microarray-Details einzugeben. Öffnen Sie dann die Registerkarte Optionen, um das Waschwerkzeug auszuwählen. Wählen Sie auf der Registerkarte Allgemein der Ausführungseinstellungen in der Symbolleiste der TAS-Anwendungssuite die Option "Beim Start des Laufs waschen" und "Am Ende des Laufs waschen" aus.

Öffnen Sie die Registerkarte Klima und stellen Sie die Luftfeuchtigkeit zwischen 55 und 60 % einStarten Sie nun den Lauf und überprüfen Sie den Arrayer regelmäßig, um sicherzustellen, dass er ordnungsgemäß funktioniert. Legen Sie die gedruckten Objektträger nach dem Druck vorsichtig in einen Objektträgerhalter mit 16 Multi-Well-Kammern. Geben Sie dann 100 Mikroliter 5%BSAT in jeden Block.

Decken Sie die Objektträger ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln. Verwenden Sie 120 Mikroliter PBST, um jeden Block fünfmal für jeweils eine Minute unter Schütteln zu waschen. Als nächstes tauen Sie die Serumproben von C-difficile-infizierten Patienten und gesunden Kontrollpersonen 20 Minuten lang auf Eis auf.

Geben Sie das im Handel erhältliche Antikörperverdünnungsmittel in den Master-Block, fügen Sie dann Proben in den Master-Block hinzu und mischen Sie. Verwerfen Sie den Waschpuffer und geben Sie 100 Mikroliter jeder verdünnten Probe in die Versuchsblöcke. Für den Negativkontrollblock fügen Sie 100 Mikroliter nur des Antikörperverdünnungsmittels hinzu.

Inkubieren Sie die Objektträger dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Verwenden Sie anschließend 120 Mikroliter PBST, um jeden Block fünfmal für jeweils drei Minuten unter Schütteln zu waschen. Geben Sie dann 100 Mikroliter biotinylierten Ziegen-Anti-Human-Antikörper, verdünnt in Antikörperverdünnungsmittel, zu jedem Block.

Decken Sie die Objektträger ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Verwenden Sie 120 Mikroliter PBST, um jeden Block fünfmal für jeweils drei Minuten unter Schütteln zu waschen. Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter Streptavidin SY5-Konjugat hinzu, verdünnt in 5% BSAT, in einem Verhältnis von ein- bis zweitausend zu jedem Block.

Decken Sie die Objektträger mit Folie ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Waschen Sie die Objektträger zuerst fünfmal für jeweils eine Minute mit 120 Mikrolitern PBST und dann zwei weitere Male für jeweils eine Minute mit PBS. Um die Objektträger zu trocknen, drehen Sie sie fünf Minuten lang bei der 300-fachen Schwerkraft.

Schalten Sie den Laserscanner 30 Minuten vor dem Scannen ein, damit er sich aufwärmen kann. Legen Sie dann das Dia mit der bedruckten Oberfläche nach oben in den Scanner, bis die Plattenleuchte durchgehend grün leuchtet. Drücken Sie anschließend die Schaltfläche Einstellungen.

Stellen Sie auf der ersten Registerkarte sicher, dass das Kontrollkästchen Automatisches Scrollen und Barcode deaktiviert sind. Stellen Sie dann die Pixelgröße auf 10, den Scan-Modus auf Mittel, die Erfassung auf nur 635, den Erfassungsmodus auf Manuell, die Verstärkung auf 20 und die Leistung auf niedrig ein. Stellen Sie auf der zweiten Registerkarte sicher, dass der Folientyp nicht beschriftet ist.

Legen Sie auf der dritten Registerkarte die Fokuseinstellung auf Autofokus fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Raster importieren", um die entsprechende Array-Liste auszuwählen, die dem gescannten Bild zugeordnet ist. Drücken Sie dann die Schaltfläche "Automatisch suchen", um das Raster an den Stellen auf der Folie auszurichten.

Drücken Sie abschließend die Schaltfläche Quantifizierungsprozess, um die Fluoreszenzintensität jedes Spots zu messen. Speichern Sie dann die Ergebnisse in einem geeigneten Format für die weitere Analyse. In diesem Protokoll wird ein Protein-Microarray mit dem ELISA verglichen, um die Reproduzierbarkeit zwischen diesen beiden Techniken zu bewerten.

Die Spearman-Korrelationskoeffizienten-Analyse zeigt eine signifikante Übereinstimmung zwischen dem Microarray und dem ELISA für den Nachweis von IgG-, Anti-Toxin A- und Anti-Toxin B-Spiegeln in Serumproben. Die Reproduzierbarkeit des Protein-Microarrays im Intro-Assay und zwischen den Assays wird anhand der Serumproben von sieben Patienten berechnet. Die Proben, die auf zwei verschiedenen Objektträgern gegen Toxin A, Toxin B, SLP001, SLP002, SLP027, Toxin B von Toxin B, das nur den Stamm CCUG produziert, und pCDTb-Antigene analysiert wurden, zeigen eine gute Reproduzierbarkeit.

Ein Protein-Microarray wird durchgeführt, um eine isotypspezifische Antikörperantwort gegen Clostridium difficile-Toxine nachzuweisen. Die Serumproben von Patienten und gesunden Personen werden verwendet, um die IgG- und IgA-Spiegel gegen Toxin A, Toxin B, Toxin B von einem Clostridium difficile-Toxin B, das nur den Stamm exprimiert, und die Vorläuferform eines B-Fragments von binärem Toxin nachzuweisen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben Stunden durchgeführt werden.

Während des Qualitätskontrollexperiments sollten verschiedene Parameter wie die Auswahl der geeigneten Oberflächenchemie, das Drucken von Puffern, das Blockieren von Puffern und Verdünnungen von Serumproben und Sekundärantikörpern vor der Entnahme von Proben bewertet werden. Das Drucken eines hochwertigen Arrays erfordert ein gutes Verständnis des Arrays oder der Software, um den Druck der Parameter gemäß dem experimentellen Protokoll anzupassen. Es ist von entscheidender Bedeutung, eine optimale Leistung des Arrayers und eine staubfreie Umgebung während des gesamten Experiments aufrechtzuerhalten.

Diese Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Immunologie und Molekularbiologie den Weg ebnen, wenn es darum geht, humorale Immunantworten auf Infektionen zu charakterisieren und serodiagnostische Antigene zu entdecken. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infizierten Blutproben und bakteriellen Toxinen gefährlich sein kann. Im Allgemeinen sollten im Labor bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Sicherheits-, Sicherheits- und Standardvorkehrungen berücksichtigt werden.