Name: Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Lernen Sie einen Protein-Microarray-Assay zur serologischen Bestimmung antigenspezifischer Antikörperantworten nach Clostridium difficile-Infektion. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Quantifizierung multipler Isotypen und stammspezifischer Antikörper.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Forschung wurde durch eine Hermes-Fellowship Ola Negm und Tanya Monaghan und durch gesonderte Finanzierung von Nottingham verdauungsfördernden Krankheiten Zentrum und die NIHR Nottingham verdauungsfördernden Krankheiten Biomedical Research Centre unterstützt.

1. Vorbereitung einer Microarray-Platte
<ol><li>C. Difficile Antigene mit einem Drucken Puffer [PBS-Tween-Trehalose (50 mM)] bei der optimalen Konzentration (das vordefiniert wurde vor dem Ausführen der Patientenseren) verdünnen: Toxin ein (200 µg/mL) und Toxin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL) und gereinigte Native ganze SLPs abgeleitet ribotypen 001 und 002 027 (200 µg/mL). Hinweis: Toxin B war ein Toxin B exprimierenden Stamm CCUG 20309 (90 µg/mL) entnommen.<ol>
<li>Die Positivkontrollen Lysates von C. Albicansund Tetanus-Toxoid mit dem Drucken Puffer bei 100 µg/mL zu verdünnen. Zu guter Letzt Verdünnen der gereinigten Immunglobulin vom Menschen passend getesteten Antikörper Isotype seriell, beginnend bei 50 µg/mL über 10 Verdünnungen im Drucken Puffer eine Kalibrierkurve erstellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie 10 µL Verdünnungen im Drucken Puffer in einem 384-Well-Platte.</li>
	<li>Die Platte mit einer Platte Dichtung und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min abdecken.</li>
</ol>2. Druck-Arrays mit einem Kontakt Roboter
<ol><li>Hitze der Silizium-Pin mit der Hand Gasbrenner 3 x 2 s und spülen in sauberem Wasser 3 x 3 s.</li>
	<li>Platzieren Sie die Microarray-Platte, in die Patrone geladen von der Arrayer.</li>
	<li>Der Diahalter aminosilan Folien auflegen. Hinweis: Der Diahalter fasst 27 Folien: drei Reihen von neun Folien. Die Folien sind im Hochformat, die ausgehend von der linken Seite der unteren Reihe angeordnet und der Rest der Räume sind bedeckt mit leeren Folien um sicherzustellen, dass die Löcher auf den Diahalter abgedeckt sind.<ol>
<li>Drücken Sie "OK" und überprüfen Sie, dass ein Vakuum aktiviert wurde und alle Folien sicher sind. Verlassen Sie die Folien in der feuchten Umgebung für mindestens 1 h vor dem Start des Drucks. Hinweis: Die aminosilan Folien sind in einem versiegelten Beutel mit Trockenmittel ausgestattet. Einmal geöffnet, sollten alle unbenutzten Folien sofort in den Exsikkator für Lagerung bis zum Verfallsdatum zurückgegeben werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clostridium Difficile Antigene Drucken geeignet Drucken Programm eingerichtet. Starten Sie die TAS-Anwendungs-Suite und öffnen Sie die erforderlichen Druckparameter laufen-Datei aus dem Verzeichnis "My Gridding läuft". Wählen Sie Clostridium Difficile -Datei für den Druck die Clostridium Difficile -Antigene in vervierfacht.</li>
	<li>Nach Doppelklick auf das MicroArray-Symbol im Hauptfenster erscheint ein Fenster mit drei Registerkarten genannt "MicroArraying Parameter".  Die drei Registerkarten sind "Quelle", "Target" und "Optionen". Die Registerkarte "Quelle" zeigt Details die Anzahl der Stichproben in der Microarray-Platte verwendet. Registerkarte "Target" zeigt Details wie die Folien sind geladen werden, wo das Array auf die Folie gedruckt werden soll und das Folienlayout (16 Subarrays Formate) zu bearbeiten. Die Registerkarte "Optionen" zeigt Details der waschen Protokoll und Tool verwendet zBwerden. Waschen Sie nach jedem abgeschlossenen Probe. Reinigen Sie die Silizium-Pin zwischen Proben, Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Proben zu vermeiden.</li>
	<li>Die Programmiermöglichkeiten befinden sich unter Optionen > führen Sie Einstellungen in der TAS-Anwendungs-Suite-Symbolleiste. Es gibt 9 Registerkarten in diesem Abschnitt durcharbeiten und wie Sie komplette ein Tab zum nächsten wechseln indem Sie darauf klicken. Klick auf "OK" Schaltfläche gelangen Sie aus "Run Vorlieben." Im Register "Allgemein" den "Run-Einstellungen" gibt es eine Reihe von Kontrollkästchen unter diesem Abschnitt in Bezug auf das Instrument Verhalten wird, wenn eine Programm gestartet wird. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Prime Bad vor Beginn der Ausführung" alle drei Waschstationen durchläuft eine kurze Priming-Sequenz vor laufen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Waschen bei Beginn der Ausführung", das Stift-Werkzeug wird gewaschen werden, bevor die erste Quelle besuchen. "Wash am Ende des Laufs" das Kontrollkästchen, das Stift-Werkzeug wird gewaschen werden, nachdem die letzte Quelle zu besuchen. Der Benutzer kann die Anzahl der Waschgänge festlegen. Starten Sie im Register "Klima" der "Run-Einstellungen" die Befeuchtung. Die Einstellung, die wir verwenden sind wie folgt: start Preis 55 %, Ausführen von 55 %, minimum Luftfeuchtigkeit 55 %, Ziel Luftfeuchtigkeit 60 %. Starten Sie den Durchlauf nicht, bis die soll-Luftfeuchtigkeit erreicht wurde, ansonsten die Spots die falsche Größe werden und die Bibliothek wird schnell verdunsten.</li>
	<li>Klicken Sie in der Menü Bar des TAS auf grüne gehen.  Starten Sie den Durchlauf und in regelmäßigen Abständen zu beobachten Sie, dass die Arrayer während der Auflage zu bestimmten alles in Ordnung ist. Hinweis: Dies ermöglicht die Analyse von 15 Proben parallel auf jeder Folie ein Unterarray als Negativkontrolle verwendet wird. Das Design von Teilmatrizen richtet sich nach der Anzahl der gedruckten Proteine (Antigene) und die Anzahl der gedruckten biologischen repliziert. Hinweis: Nach dem Drucken jede Probe, der Kopf bewegt sich in Richtung der waschbäder erlauben mehrere Eintauchen des Stiftes in zwei waschen Bäder mit destilliertem Wasser und 0,002 % Tween 20 für 1.5 s in jedem Bad, gefolgt von der Pin mit Reinstwasser Spülung und Trocknung den Stift im die wichtigsten Waschstation für 4 s.</li>
</ol>3. Lagerung der Arrays
<ol><li>Halten Sie die gedruckten Folien, die über Nacht bei Raumtemperatur in den Exsikkator gelagert. Hinweis: Die bedruckten Folien können bis zu einer Woche aufbewahrt werden.</li>
</ol>(4) Array sondieren
<ol><li>Platzieren Sie sorgfältig gedruckte Folien in einen Diahalter 16 Multi-gut Kammern Format. Hinweis: Die Kammern, mit einer Tiefe von ca. 7,5 mm bieten eine großzügige Fläche Volumen-Verhältnis zu mischen und Waschschritte.</li>
	<li>Lassen Sie alle Reagenzien vor Gebrauch auf Zimmertemperatur erwärmen. Sofern nicht anders angegeben, führen Sie die folgenden Schritte bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL gefilterte 5 % Rinderserumalbumin Tweens (BSAT; Gebrauch einer 0,2 µm Spritze Filter), jeder block, decken die Folien und inkubieren sie mit Schütteln für 1 h.</li>
	<li>Waschen der Dias 5 x 1 min in 120 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (PBST; 0,1 % Tween) pro Bohrloch mit schütteln. Lassen Sie sich nicht die Folien austrocknen.</li>
	<li>Die Serumproben für 20 min auf Eis Auftauen und mit Hintergrund verringern Komponente jede Probe mit einem handelsüblichen Antikörper Verdünnungsmittel verdünnen (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Optimieren Sie die Verdünnung die Serumproben nach der getesteten Immunglobulin, wie in Tabelle 2dargestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alle Blöcke mit einer Ausnahme, die als Negativkontrolle verwendet werden übermitteln Sie 100 µL verdünnter Serumproben; dieser Block fügen Sie nur 100 µL Antikörper Verdünnungsmittel hinzu. Inkubieren Sie die Folien mit sanften Agitation für 1 h.</li>
	<li>Die Objektträger 5 x 3 min in 120 µL PBST waschen (0,1 % Tween) pro Bohrloch mit schütteln.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL eines biotinylierte Ziege Anti-Human-Antikörpers mit Antikörper Verdünnungsmittel verdünnt.<ol>
<li>Optimieren Sie die Verdünnung der Sekundärantikörper nach der getesteten Immunglobulin, wie in Tabelle 2beschrieben. Decken Sie die Folien und inkubieren sie mit sanft Schütteln für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Folien 5 x 3 min in 120 µL PBST pro Bohrloch mit zitternden.</li>
	<li>Jeder Block verdünnt 1: 2000 in 5 % BSA fügen Sie 100 µL Streptavidin Cy5 hinzu. Decken Sie die Folien mit einer Folie zum Schutz vor Licht, während 15 min. unter Rühren sanft schütteln.</li>
	<li>Waschen Sie die Dias 5 x 1 min in 120 µL der PBST pro Bohrloch mit schütteln, gefolgt von 2 Wäschen von 1 min in PBS nur mit zittern.</li>
	<li>Drehen Sie die Folien für 5 min bei 300 X g zu trocknen.</li>
	<li>Halten Sie die Folien in einer dunklen Box für Transport und Lagerung bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Gehen Sie zum Scannen die Arrays sofort um Signal Konsistenz nach sondieren zu gewährleisten. Hinweis: Allerdings sondierten Folien können im Dunkeln aufbewahrt und innerhalb einer Woche nach sondieren gescannt.</li>
</ol>5. Scannen die Arrays
<ol><li>Schalten Sie den Laserscanner (siehe Tabelle der Materialien) 30 min vor dem Scannen zum Aufwärmen des Lasers. Laden Sie die Scanner-Software und verbinden Sie den Computer mit dem Scanner.</li>
	<li>Legen Sie eine Folie mit der beschrifteten Seite nach oben in den Scanner, bis das Spiel leuchtet grün Lämpchen.</li>
	<li>Drücken Sie die Schaltfläche " Einstellungen " und passen Sie die folgenden Einstellungen beim Scannen von Dias wie folgt:-Scan-Modus, Median; Erwerb, 635 nur; Akquisitionsmodus, Handbuch; Gewinn, 20; Power, Low; Folie Typ, unbeschriftete Folie; Fokus, Autofokus. Deaktivieren Sie automatischer Bildlauf und Barcode Reading Pixel Größe 10 und Scannen 35.</li>
	<li>Speichern Sie die resultierenden Bilder als 16-Bit-Graustufen mehrere Bild-TIFF-Format. Drücken Sie die Schaltfläche " Import Grid " und wählen Sie die entsprechende Arrayliste. Hinweis: Die Array-Liste beschreibt die Größe und Position von Teilmatrizen und die Namen der bedruckten Stoffe verbunden mit jedem Feature-Indikator.<ol>
<li>Richten Sie das Gitter, um die Flecken auf der Folie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysieren Sie die Bilder durch Drücken der Taste Quantifizierung Prozess um die Fluoreszenz Signalintensitäten an jeder Stelle zu messen und die Ergebnisse in einem Textformat namens GenePix Ergebnisse (GPR) speichern. Hinweis: Die GPR-Datei enthält die Lokalisierung und Identifizierung Variablen Antigen Ziele auf das Array und auch der mittlere Fluoreszenzintensität und lokalen Hintergrund, der die Antikörperbindung darstellt signalisieren Werte von jedem Fleck.</li>
</ol>(6) Datenanalyse
<ol><li>Den Median für die Wiederholungen der jedes Antigen nach Hintergrundabzug mit eine kostenlose Microarray-Analyse-Software namens reverse Phase Protein Arrays (RPPA) Analyzer, ein Modul innerhalb der statistischen Sprache auf CRAN36R zu berechnen.</li>
	<li>Plot der Standardkurve und interpolieren die Signale der jedes Antigen im Verhältnis zu der Immunglobulin-Standardkurve mit kommerziellen wissenschaftliche Grafik und Statistik-Software (siehe Tabelle der Materialien), die Antikörpertiter zu berechnen.</li>
</ol>

<ol><li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+humoral+immune+responses+to+Clostridium+difficile.-specific+antigens+by+protein+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).</li>
<li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+subclass-specific+binding+and+neutralizing+antibodies+against+Clostridium+difficile.+toxins+in+adult+cystic+fibrosis+sera%3A+possible+mode+of+immunoprotection+against+symptomatic+C.+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).</li>
<li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+against+Clostridium+difficile.+are+present+in+intravenous+immunoglobulin+and+are+retained+in+humans+following+its+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration.</a> Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).</li>
<li>Monaghan, T., et al. <a target="_blank" href="http://gut.bmj.com/content/66/Suppl_2/A31.1">OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection.</a> Gut. 66, Suppl. 2 31(2017).</li>
<li>Bacon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+directed+against+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile+in+the+general+population+and+patients+with+antibiotic-associated+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).</li>
<li>Viscidi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+antibody+response+to+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile.</a> The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).</li>
<li>Salcedo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+immunoglobulin+therapy+for+severe+Clostridium+difficile+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis.</a> Gut. 41 (3), 366-370 (1997).</li>
<li>Abougergi, M. S., Kwon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+immunoglobulin+for+the+treatment+of+Clostridium+difficile+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).</li>
<li>Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24926170">Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis.</a> Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).</li>
<li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+carriage+of+Clostridium+difficile+and+serum+levels+of+IgG+antibody+against+toxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A.</a> The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).</li>
<li>Solomon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+in+patients+with+Clostridium+difficile+infection+correlates+with+host+pro-inflammatory+and+humoral+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses.</a> Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).</li>
<li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+antibody+response+to+toxin+A+and+protection+against+recurrent+Clostridium+difficile+diarrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea.</a> Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).</li>
<li>Leav, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+anti-toxin+B+antibody+correlates+with+protection+from+recurrent+Clostridium+difficile+infection+%28CDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI).</a> Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).</li>
<li>Drudy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+response+to+surface+layer+proteins+in+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).</li>
<li>Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immune+response+as+predictor+of+recurrence+in+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).</li>
<li>Wilcox, M. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28121498">Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).</li>
<li>Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24637887">Vaccines against Clostridium difficile.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).</li>
<li>Ghose, C., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prospect+for+vaccines+to+prevent+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).</li>
<li>Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+safety+and+efficacy+of+vaccines+as+prophylaxis+for+Clostridium+difficile+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections.</a> Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li>
<li>Delehanty, J. B., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+printing+functional+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Method for printing functional protein microarrays.</a> BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).</li>
<li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3680110/">Overview of protein microarrays.</a> Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21(2013).</li>
<li>Huang, Y., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+array-based+approaches+for+biomarker+discovery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).</li>
<li>Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+humoral+immune+response+to+infectious+agents+using+high-density+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays.</a> Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).</li>
<li>Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14678154">Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays.</a> Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).</li>
<li>Davies, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+humoral+immune+response+to+infection+by+using+proteome+microarrays%3A+high-throughput+vaccine+and+diagnostic+antigen+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).</li>
<li>Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+antigen+microarrays+for+serum%2Fplasma+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection.</a> Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).</li>
<li>Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26599287">Applications in high-content functional protein microarrays.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).</li>
<li>Crompton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+analysis+of+the+Ab+response+to+Plasmodium+falciparum+before+and+after+a+malaria+season+by+protein+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).</li>
<li>Khodakov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oligonucleotide+microarray+for+multiplex+real-time+PCR+identification+of+HIV-1%2C+HBV%2C+and+HCV%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV.</a> BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).</li>
<li>Ryabinin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+oligonucleotide+microarray+for+sub-typing+of+Influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus.</a> PLoS One. 6 (4), 17529(2011).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+diagnostics+using+a+coronavirus+protein+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).</li>
<li>Cleton, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+the+difference%3A+development+of+a+syndrome+based+protein+microarray+for+specific+serological+detection+of+multiple+flavivirus+infections+in+travelers%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers.</a> PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580(2015).</li>
<li>Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+recombinant+antigen+array+for+simultaneous+detection+of+viral+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies.</a> PLoS One. 8 (9), 73842(2013).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+array+identification+of+protein+markers+for+serodiagnosis+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Scientific Reports. 5, 15349(2015).</li>
<li>Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20634205">RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).</li>
<li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+antibody+and+memory+B-cell+responses+to+C.+difficile-associated+diarrhoea%2C+inflammatory+bowel+disease+and+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis.</a> PLoS One. 8 (9), 74452(2013).</li>
<li>Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17984513">Current microarray surface chemistries.</a> Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).</li>
<li>Wellhausen, R., Seitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facing+current+quantification+challenges+in+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Facing current quantification challenges in protein microarrays.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).</li>
<li>Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. <a target="_blank" href="https://www.crcpress.com/Functional-Protein-Microarrays-in-Drug-Discovery/Predki/p/book/9780849398094">Functional Protein Microarrays in Drug Discovery</a>. , CRC Press. Boca Raton. (2007).</li>
</ol>

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass diese Microarray eine geeignete Plattform für die Humorale Immunantwort auf C. Difficile -Protein-Antigene in Patientenseren (Abbildungen 3 und 6) und kommerzielle Vorbereitung der IVIg (Abbildung 5) Definition ist. Wir haben auch gezeigt, dass die Microarray-Technik führt auch im Vergleich zu konventionellen ELISA (Abbildung 2) und zeigt hervorragende Reproduzierbarkeit mit I...

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung eines neuartigen und kundenspezifische Protein Microarray Assays für die Erkennung und semi-Quantifizierung der Bakterienstamm und Isotype-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile -Antigene. Wir nutzen erfolgreich unsere C. Difficile-spezifische Microarray-Assay als viel versprechende neue Werkzeug für die kompositorische Bioanalytik der spezifischen Antikörper Inhalte in Patientenseren1,2, Vorbereitungen von IVIg3, und Kennung der Antikörper-Besonderheiten, die mit schlechten Ergebnissen im CDI4korrelieren. Wir zeigen wie Biobanked Serumproben und kommerzielle Vorbereitung der IVIg auf Microarray Folien, analysiert werden können, ermöglicht qualitativ hochwertige reproduzierbare profiling von C. Difficile Erreger-spezifischen Antikörper-Reaktionen in diesem Assay.
Viele gesunde Kinder und Erwachsene haben nachweisbar Serum IgG und IgA Antikörper gegen C. Difficile Toxine A und B5,6. Diese werden gedacht, um nach vorübergehender Exposition in der Kindheit und nach Exposition gegenüber C. Difficile im Erwachsenenalter auftreten. Aus diesem Grund wurde polyklonale IVIg off-Label-zur Behandlung von wiederkehrenden und fulminanten CDI7,8,9verwendet. Seine endgültige Rolle und Wirkungsweise bleibt jedoch unklar. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Humorale Immunantwort auf C. Difficile Toxine in Krankheit Präsentation und das Ergebnis eine Rolle spielt. Insbesondere zeigen asymptomatische Patienten eine erhöhte Serum Anti-Toxin A IgG Konzentration im Vergleich zu Patienten, die Symptomen der Krankheit10zu entwickeln. Eine nachweisbare Verbindung wurde für mittlere Anti-Toxin-A IgG-Titer und 30-Tage Mortalität aller Ursachen11berichtet. Mehrere Berichte haben auch gezeigt, dass eine Vereinigung mit einem Schutz gegen Rezidive und Antikörper Reaktionen auf Toxin A, B und mehrere nicht-Toxin-Antigene (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD und Oberflächenschicht Proteine (SLPs))12,13 , 14 , 15. diese Beobachtungen haben die Entwicklung der ersten passiven Immuntherapie Drug targeting C. Difficile Toxin B (Bezlotuxumab), die vor kurzem von der US Food and Drug Administration und die Europäische Arzneimittel-Agentur genehmigt wurde angespornt Agentur für die Prävention von wiederkehrenden CDI16. Impfstrategien mit inaktivierten Toxinen oder rekombinantes Toxin Fragmente sind auch derzeit in der Entwicklung17,18,19. Diese neue Therapieansätze werden zweifellos die Voraussetzung für die Bewertung der humoralen Immunantwort auf mehrere Antigene in große Stichprobenumfänge stimulieren.
Heute gibt es ein bemerkenswerten Mangel an handelsüblichen Hochdurchsatz-Assays in der Lage, gleichzeitig Bakterienstamm und Isotype-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile -Antigene zu beurteilen. Es besteht ein ungedeckter Bedarf, solche Tests Erleichterung künftiger Forschung und klinische Anwendungen zu entwickeln. Protein Microarrays sind eine Methode, um große Anzahl von einzeln-gereinigte Proteine als räumlich organisierten Array von Flecken auf einer mikroskopischen folienbasierten Oberfläche zu immobilisieren, mit einem Robot-System, die entweder ein Kontakt20 oder ein berührungsloses sein kann Drucken Tool21. Die Spots können komplexe Mischungen wie Zelle Lysates, Antikörper, Gewebe Homogenates, endogenen oder rekombinante Proteine oder Peptide, Körperflüssigkeiten oder Drogen22,23darstellen.
Protein-Microarray-Technologie bietet deutliche Vorteile gegenüber standard im Haus ELISA-Techniken, die traditionell verwendet wurden, um Anti -C. Difficile Antikörperantworten zu beurteilen. Dazu gehören eine erhöhte Kapazität für eine Reihe von Multi-Isotype-spezifische Antikörper gegen eine umfangreichere Gruppe von Protein-Targets, geringerer Anforderungen für Antigene, Proben und Reagenzien, Erkennung und eine verbesserte Fähigkeit, eine größere integrieren Anzahl der technischen Replikationen, zusätzlich mehrere interne Qualitätskontrolle (QC) misst1. Microarrays sind daher sensibel, präzise und reproduzierbare und haben einen größeren Dynamikbereich. Diese Faktoren machen Microarrays eine billigere und potenziell günstige Alternative zu ELISAs für die groß angelegte Erkennung von bekannten Proteinen. Jedoch Nachteile der Microarray-Technologie resultieren im Wesentlichen aus der große Vorabkosten zugeordnet zur Gründung einer Gruppe von hochgereinigten Antigenen und die technologische Plattform einrichten.
Protein Microarrays haben in den letzten zwei Jahrzehnten als Diagnose- und grundlegende Recherche-Tool in der klinischen Anwendung intensiv genutzt. Spezielle Anwendungen sind Protein-Expression profiling, das Studium der Enzym-Substrat-Beziehungen, Biomarker Screening, Analyse von Host-Mikroben-Interaktionen und profiling Antikörper Spezifität23,24, 25,26,27,28. Viele neue Erreger Protein/Antigen Microarrays entstanden unter anderem Malaria (Plasmodium)29, HIV-130, Grippe31, schwere akute respiratorische Syndrom (SARS)32, virale hämorrhagische Fieber33, , Herpesviren34und Tuberkulose35.
Dieses Protokoll bezieht sich auf die Einrichtung eine einfach operative C. Difficile reaktive Antigen Microarray Assay, ermöglicht präzise, genaue und spezifische Quantifizierung der Multi-Isotype und Stamm-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile Antigene in Sera und polyklonalen IVIg. Hier zählen wir repräsentative Ergebnisse in Bezug auf eine akzeptable Microarray Testleistung im Vergleich zu ELISA sowie Assay-Präzision und Reproduzierbarkeit Profile. Dieser Test könnte weiter entwickelt werden, um andere klinikmustern Profil und setzt einen neuen Standard für die Forschung in der molekularen Grundlagen des CDI.

<table><tbody><tr><td>BioRobotics MicroGrid II Arrayer</td><td>Digilab, Malborough, MA, USA</td><td>N/A</td><td>Kontakt-Arrayer zur automatisierten Spotting der Antigene auf den Objektträgern.</td></tr><tr><td>Scanner InnoScan 710.</td><td>Innopsys</td><td>N/A</td><td>Ein fluoreszierender Microarray-Objektträgerscanner mit einem roten (Cy5) Laser zum Ablesen der Reaktion.</td></tr><tr><td>MAPIX Software Version 7.2.0</td><td>Innopsys</td><td>N/A</td><td>Messen Sie die Signalintensitäten der Spots.</td></tr><tr><td>Silikon-Kontaktstift</td><td>Parallel Synthesis Technologies</td><td>SMT-P75</td><td>Drucken Sie die Proben auf die Objektträger.</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Exsikkator</td><td>Thermo Scientific</td><td>41102426</td><td>Zur Aufbewahrung der neuen und gedruckten Objektträger.</td></tr><tr><td>384-Well-Platte</td><td>Genetix</td><td>X7022UN</td><td>Zur Vorbereitung der Antigene.</td></tr><tr><td>Plattenabdeckung</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>CLS6570-100EA</td><td>Zur Reduzierung der Verdunstung der Proben.</td></tr><tr><td>Aminosilan-Objektträger</td><td>Schott,&nbsp; Deutschland</td><td>1064875</td><td>Die Folie der Wahl für den Druck der Antigene.</td></tr><tr><td>Objektträgerhalter</td><td>GraceBio Labs, USA</td><td>204862</td><td>Teilen Sie die Objektträger in identische 16 Subarrays auf. Bei diesen Haltern handelt es sich um wiederverwendbare, abnehmbare, auslaufsichere Brunnen.</td></tr><tr><td>Candida albicans Lysat</td><td>NIBSC</td><td>PR-BA117-S</td><td>Positivkontrolle</td></tr><tr><td>Tetanus Toxoid&nbsp;</td><td>Athen Forschung und Technologie</td><td>04/150</td><td>Positivkontrolle</td></tr><tr><td>Immunglobulin G (IgG), Normales menschliches Plasma</td><td> Athener Forschung und&nbsp; Technologie&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707</td><td>Gereinigtes natives humanes Immunglobulin G IgG, menschliches Plasma.</td></tr><tr><td>Immunglobulin G1 (IgG1), normales menschliches Plasma</td><td>&nbsp; Athener Forschung und&nbsp; Technologie&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-1</td><td>Gereinigtes natives humanes Immunglobulin G1 IgG1, menschliches Plasma.</td></tr><tr><td>Immunglobulin G2 (IgG2), normales menschliches Plasma</td><td>&nbsp; Athener Forschung und&nbsp; Technologie&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-2</td><td>Gereinigtes natives humanes Immunglobulin G2 IgG2, menschliches Plasma.</td></tr><tr><td>Immunglobulin G3 (IgG3), normales menschliches Plasma</td><td>&nbsp; Athener Forschung und&nbsp; Technologie&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-3</td><td>Gereinigtes natives humanes Immunglobulin G3 IgG3, menschliches Plasma.</td></tr><tr><td>Immunglobulin G4 (IgG4), normales menschliches Plasma</td><td>&nbsp; Athener Forschung und&nbsp; Technologie&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-4</td><td>Gereinigtes natives humanes Immunglobulin G4 IgG4, menschliches Plasma.</td></tr><tr><td>Immunglobulin A (IgA), menschliches Plasma</td><td>&nbsp; Athener Forschung und&nbsp; Technologie&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701</td><td>Gereinigtes natives humanes Immunglobulin A (IgA), menschliches Plasma.</td></tr><tr><td>Immunglobulin A1 (IgA1), Plasma des humanen Myeloms</td><td> Athener Forschung und&nbsp; Technologie&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701-1M</td><td>Gereinigtes natives humanes Immunglobulin A1 (IgA1), menschliches Plasma.</td></tr><tr><td>Immunglobulin A2 (IgA2), Plasma des humanen Myeloms</td><td> Athener Forschung und&nbsp; Technologie&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701-2M</td><td>Gereinigtes natives humanes Immunglobulin A2 (IgA2), menschliches Plasma.</td></tr><tr><td>Immunglobulin M (IgM), menschliches Plasma</td><td>&nbsp; Athener Forschung und&nbsp; Technologie&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090713</td><td>Gereinigtes natives humanes Immunglobulin M (IgM), menschliches Plasma.</td></tr><tr><td>Biotinylierter Anti-Human-IgG-Antikörper aus Ziegen, Gamma-Ketten-spezifischer</td><td>Vector Labs</td><td>BA-3080</td><td>Anti-Human-IgG-Antikörper (&gamma;-kettenspezifisch)-Biotin-Antikörper reagiert spezifisch mit humanem IgG, aber nicht mit anderen Immunglobuline.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9052-08&nbsp;</td>Der <td>Anti-Human-IgG1-Biotin-Antikörper der Ziege reagiert spezifisch mit humanem IgG1, aber nicht mit anderen Immunglobulinen.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human-IgG2 Fc-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9060-08&nbsp; &nbsp;</td><td>Der Anti-humane IgG2-Biotin-Antikörper der Ziege reagiert spezifisch mit humanem IgG 2, jedoch nicht mit anderen Immunglobulinen.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9210-08&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td>Der <td>anti-humane IgG3-Biotin-Antikörper der Ziege reagiert spezifisch mit humanem IgG3, aber nicht mit anderen Immunglobulinen.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human-IgG4 pFc'-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9190-08&nbsp; &nbsp;</td><td>Ziegen-Anti-Human-IgG-Biotin-Antikörper reagiert spezifisch mit humanem IgG, aber nicht mit anderen Immunglobulinen.</td></tr><tr><td>Anti-Human-IgA, Alpha-Ketten-spezifisch, hergestellt in Ziege - Biotinylated</td><td>Vector Labs</td><td>BA-3030</td><td>Ziegen-Anti-Human-IgG-Biotin-Antikörper reagiert spezifisch mit humanem IgG, aber nicht mit anderen Immunglobuline.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human IgA1-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9130-08</td><td>Ziege Anti-Human-IgG-Biotin Antikörper reagiert spezifisch mit humanem IgG, aber nicht mit anderen Immunglobulinen.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human IgA2-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9140-08&nbsp; &nbsp;</td><td>Ziegen-Anti-Human-IgG-Biotin-Antikörper reagiert spezifisch mit humanem IgG, aber nicht mit anderen Immunglobulinen.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human IgM-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9020-08&nbsp;</td><td>Ziegen-Anti-Human-IgG-Biotin-Antikörper reagiert spezifisch mit humanem IgG, aber nicht mit anderen Immunglobulinen.</td></tr><tr><td>0,2 mm Spritzenvorsatzfilter</td><td>Thermo scientific</td><td>723-2520</td><td>Filtern Sie die 5% BSA.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A7284</td><td>Verwenden Sie 5% BSA zum Blockieren der Objektträger.</td></tr><tr><td>Antikörperverdünnungsmittel</td><td>Dako, UK</td><td>S3022</td><td>Zur Verdünnung des Serums und des Sekundärantikörpers.</td></tr><tr><td>Streptavidin Cy5</td><td>eBioscience</td><td>SA1011</td><td>Nachweis der Immunreaktion.</td></tr><tr><td>Gereinigte ganze C. difficile-Toxine A und B (Toxinotyp 0, Stamm VPI 10463, Ribotyp 087)</td><td>Toxins Group, Public Health England</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigtes ganzes C. difficile-Toxin B (CCUG 20309 Toxin B, das nur den Stamm exprimiert)</td><td>Toxins Group, Public Health England</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vorläuferform des B-Fragments des binären Toxins, pCDTb</td><td>Universität Bath&nbsp;</td><td>NA</td><td>Hergestellt in E. Coli aus einem vollständig synthetischen rekombinanten Genkonstrukt. Aminosäuresequenz basierend auf einer veröffentlichten Sequenz aus dem Ribotyp 027 (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)</td></tr><tr><td>Aufgereinigte native Ganzribotyp-spezifische (001, 002, 027) Oberflächenschichtproteine</td><td>Dublin City University&nbsp;</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Vigam (IVIg-Vorbereitung 1)</td><td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Privigen (IVIg-Vorbereitung 2)</td><td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Intratect (IVIg-Vorbereitung 3)</td><td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

ein protein-microarray-assay für die serologische bestimmung der antigen-spezifische antikörper antworten folgende clostridium difficile infektion

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

Wir bieten eine detaillierte Übersicht über ein neuartiges Hochdurchsatz-Protein-Microarray-Assay für die Bestimmung der Anti -Clostridium Difficile -Antikörpern im menschlichen Serum und in separaten Vorbereitungen von polyklonalen intravenöses Immunglobulin (IVIg). Das Protokoll beschreibt die methodischen Schritte zur Probenvorbereitung, Druck von Arrays, Testverfahren und Datenanalyse. Darüber hinaus könnte dieses Protokolls weiter ausgebaut werden, um vielfältigen klinischen Proben einschließlich Plasma und Zell-Kultur Überstände. Wir zeigen, wie Protein Microarray verwendet werden kann, um festzustellen, eine Kombination aus Isotype (IgG, IgA, IgM), Unterklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) und Stamm-spezifische Antikörper gegen hoch gereinigt ganze C. Difficile Toxin A und B (Toxinotype 0, Stamm VPI 10463, ribotyp 087), Toxin B aus einem C. Difficile Toxin-B-nur mit dem Ausdruck ihrer Stamm (CCUG 20309), eine Vorstufe-Form eines B-Fragments des binären Toxins, pCDTb, ribotyp-spezifische ganze Oberflächenschicht Proteine (SLPs, 001, 002, 027), und Steuern Proteine (Tetanus Toxoid und Candida Albicans). Während des Experiments sind Microarrays sondiert mit Sera von Einzelpersonen mit C. Difficile -Infektion (CDI), Einzelpersonen mit Cystischer Fibrose (CF) ohne Durchfall, gesunden Kontrollpersonen (HC), und von Einzelpersonen Pre- und Post-IVIg Therapie für die Behandlung von CDI, kombinierte Immundefizienz Unordnung und chronisch entzündliche demyelinisierende polyradikulopathie. Wir begegnen erhebliche Unterschiede in Toxin Neutralisation Wirksamkeiten und Multi-Isotype spezifischen Antikörpertiter Patientengruppen, kommerzielle Vorbereitung der IVIg, und Sera vor und nach IVIg Verabreichung. Außerdem gibt es eine signifikante Korrelation zwischen Microarray und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) für Antitoxin-IgG-Werte in Serumproben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Microarray ein viel versprechendes Instrument für die Profilerstellung Antikörperantworten auf C.difficile Antigene in geimpften oder infizierten Menschen werden könnte. Mit der Verfeinerung der Antigen-Panels und eine Reduzierung der Produktionskosten rechnen wir Microarray-Technologie optimieren und wählen Sie die klinisch nützlichen Immuntherapien für C. Difficile Infektion in einer Patienten-spezifischen Weise helfen kann.

Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm, beschreibt die wichtigsten Schritte in der beschriebenen Protokoll. Abbildung 2 zeigt Spearman Korrelationstests zeigen bedeutende Abkommen zwischen Microarray und ELISA für IgG und IgA Anti-Toxin A und B im Patiententest Sera Ebenen. Abbildung 3 zeigt differenzierte IgG und IgA Antikörper-Klasse spezifische antikörperreaktionen auf Toxin A und Toxin B binäres Tox...

Dieser Artikel beschreibt eine einfache Protein Microarray Methode für Clostridium Difficile Antigene im menschlichen Serum Profilerstellung humorale Immunantworten auf einer 7-Plex Jury hoch gereinigt werden. Das Protokoll kann zur Bestimmung der spezifischen Antikörperantworten in die Vorbereitungen der polyklonalen intravenöses Immunglobulin erweitert werden.

Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Diese Methode kann dazu beitragen, klinisch nützliche Immuntherapien für Clostridium difficile-Infektionen patientenspezifisch zu optimieren und auszuwählen und die Immunantwort des Menschen auf Clostridium difficile aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genaue und gleichzeitige Quantifizierung von Multi-Isotyp- und stammspezifischen Antikörperantworten auf C.difficile-Antigene ermöglicht. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da Fachwissen bei der Einrichtung und Optimierung eines Panels hochgereinigter Antigene und beim Aufbau der technologischen Plattform erforderlich ist.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da methodische Listentypen, die an der Vorbereitung der Mikrowellenplatte, dem Array-Druck, einem sicheren Verfahren und der Datenanalyse beteiligt sind, Aufmerksamkeit für die Details erfordern. Ein Teil des Verfahrens wird von Sam Greenwood, einem Techniker aus meinem Labor, vorgeführt. Verdünnen Sie zunächst Clostridium difficile-Antigene und Druckpuffer auf optimale Konzentration.Übertragen Sie anschließend 10 Mikroliter Antigenlösung auf eine 384-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit einer Plattendichtung ab und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300-facher Schwerkraft. Verwenden Sie für den Microarray-Druck einen Gasbrenner, um den Silizium-PIN dreimal für jeweils zwei Sekunden zu erhitzen.Spülen Sie dann den Silikon-PIN dreimal für jeweils drei Sekunden in sauberem Wasser ab. Legen Sie die Microarray-Platte in die Ladekassette eines Arrayers. Werfen Sie das Fach aus, legen Sie dann die Aminosilan-Objektträger in das Objektträgerfach und drücken Sie die OK-Taste, um das Vakuum einzuschalten.Stellen Sie sicher, dass alle Folien gesichert sind, und klicken Sie dann auf OK. Setzen Sie das Fach wieder in den Ursprung ein und schließen Sie den Deckel. Starten Sie als Nächstes das entsprechende Programm und gehen Sie zu Datei, dann zu Microarraying-Parametern und dann zu Öffnen. Wählen Sie die Datei Clostridium difficile, um alle Antigene in vierfacher Ausfertigung zu drucken.Öffnen Sie in diesem Fenster die Registerkarte Quelle, um die Probenlagerung anzugeben, und die Registerkarte Ziel, um Microarray-Details einzugeben. Öffnen Sie dann die Registerkarte Optionen, um das Waschwerkzeug auszuwählen. Wählen Sie auf der Registerkarte Allgemein der Ausführungseinstellungen in der Symbolleiste der TAS-Anwendungssuite die Option "Beim Start des Laufs waschen" und "Am Ende des Laufs waschen" aus.Öffnen Sie die Registerkarte Klima und stellen Sie die Luftfeuchtigkeit zwischen 55 und 60 % einStarten Sie nun den Lauf und überprüfen Sie den Arrayer regelmäßig, um sicherzustellen, dass er ordnungsgemäß funktioniert. Legen Sie die gedruckten Objektträger nach dem Druck vorsichtig in einen Objektträgerhalter mit 16 Multi-Well-Kammern. Geben Sie dann 100 Mikroliter 5%BSAT in jeden Block.Decken Sie die Objektträger ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln. Verwenden Sie 120 Mikroliter PBST, um jeden Block fünfmal für jeweils eine Minute unter Schütteln zu waschen. Als nächstes tauen Sie die Serumproben von C-difficile-infizierten Patienten und gesunden Kontrollpersonen 20 Minuten lang auf Eis auf.Geben Sie das im Handel erhältliche Antikörperverdünnungsmittel in den Master-Block, fügen Sie dann Proben in den Master-Block hinzu und mischen Sie. Verwerfen Sie den Waschpuffer und geben Sie 100 Mikroliter jeder verdünnten Probe in die Versuchsblöcke. Für den Negativkontrollblock fügen Sie 100 Mikroliter nur des Antikörperverdünnungsmittels hinzu.Inkubieren Sie die Objektträger dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Verwenden Sie anschließend 120 Mikroliter PBST, um jeden Block fünfmal für jeweils drei Minuten unter Schütteln zu waschen. Geben Sie dann 100 Mikroliter biotinylierten Ziegen-Anti-Human-Antikörper, verdünnt in Antikörperverdünnungsmittel, zu jedem Block.Decken Sie die Objektträger ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Verwenden Sie 120 Mikroliter PBST, um jeden Block fünfmal für jeweils drei Minuten unter Schütteln zu waschen. Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter Streptavidin SY5-Konjugat hinzu, verdünnt in 5% BSAT, in einem Verhältnis von ein- bis zweitausend zu jedem Block.Decken Sie die Objektträger mit Folie ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Waschen Sie die Objektträger zuerst fünfmal für jeweils eine Minute mit 120 Mikrolitern PBST und dann zwei weitere Male für jeweils eine Minute mit PBS. Um die Objektträger zu trocknen, drehen Sie sie fünf Minuten lang bei der 300-fachen Schwerkraft.Schalten Sie den Laserscanner 30 Minuten vor dem Scannen ein, damit er sich aufwärmen kann. Legen Sie dann das Dia mit der bedruckten Oberfläche nach oben in den Scanner, bis die Plattenleuchte durchgehend grün leuchtet. Drücken Sie anschließend die Schaltfläche Einstellungen.Stellen Sie auf der ersten Registerkarte sicher, dass das Kontrollkästchen Automatisches Scrollen und Barcode deaktiviert sind. Stellen Sie dann die Pixelgröße auf 10, den Scan-Modus auf Mittel, die Erfassung auf nur 635, den Erfassungsmodus auf Manuell, die Verstärkung auf 20 und die Leistung auf niedrig ein. Stellen Sie auf der zweiten Registerkarte sicher, dass der Folientyp nicht beschriftet ist.Legen Sie auf der dritten Registerkarte die Fokuseinstellung auf Autofokus fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Raster importieren", um die entsprechende Array-Liste auszuwählen, die dem gescannten Bild zugeordnet ist. Drücken Sie dann die Schaltfläche "Automatisch suchen", um das Raster an den Stellen auf der Folie auszurichten.Drücken Sie abschließend die Schaltfläche Quantifizierungsprozess, um die Fluoreszenzintensität jedes Spots zu messen. Speichern Sie dann die Ergebnisse in einem geeigneten Format für die weitere Analyse. In diesem Protokoll wird ein Protein-Microarray mit dem ELISA verglichen, um die Reproduzierbarkeit zwischen diesen beiden Techniken zu bewerten.Die Spearman-Korrelationskoeffizienten-Analyse zeigt eine signifikante Übereinstimmung zwischen dem Microarray und dem ELISA für den Nachweis von IgG-, Anti-Toxin A- und Anti-Toxin B-Spiegeln in Serumproben. Die Reproduzierbarkeit des Protein-Microarrays im Intro-Assay und zwischen den Assays wird anhand der Serumproben von sieben Patienten berechnet. Die Proben, die auf zwei verschiedenen Objektträgern gegen Toxin A, Toxin B, SLP001, SLP002, SLP027, Toxin B von Toxin B, das nur den Stamm CCUG produziert, und pCDTb-Antigene analysiert wurden, zeigen eine gute Reproduzierbarkeit.Ein Protein-Microarray wird durchgeführt, um eine isotypspezifische Antikörperantwort gegen Clostridium difficile-Toxine nachzuweisen. Die Serumproben von Patienten und gesunden Personen werden verwendet, um die IgG- und IgA-Spiegel gegen Toxin A, Toxin B, Toxin B von einem Clostridium difficile-Toxin B, das nur den Stamm exprimiert, und die Vorläuferform eines B-Fragments von binärem Toxin nachzuweisen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben Stunden durchgeführt werden.Während des Qualitätskontrollexperiments sollten verschiedene Parameter wie die Auswahl der geeigneten Oberflächenchemie, das Drucken von Puffern, das Blockieren von Puffern und Verdünnungen von Serumproben und Sekundärantikörpern vor der Entnahme von Proben bewertet werden. Das Drucken eines hochwertigen Arrays erfordert ein gutes Verständnis des Arrays oder der Software, um den Druck der Parameter gemäß dem experimentellen Protokoll anzupassen. Es ist von entscheidender Bedeutung, eine optimale Leistung des Arrayers und eine staubfreie Umgebung während des gesamten Experiments aufrechtzuerhalten.Diese Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Immunologie und Molekularbiologie den Weg ebnen, wenn es darum geht, humorale Immunantworten auf Infektionen zu charakterisieren und serodiagnostische Antigene zu entdecken. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit infizierten Blutproben und bakteriellen Toxinen gefährlich sein kann. Im Allgemeinen sollten im Labor bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Sicherheits-, Sicherheits- und Standardvorkehrungen berücksichtigt werden.

a-protein-microarray-assay-for-serological-determination-antigen

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Identifizierung von mikrobiellen Ziele der adaptiven Immunität bei idiopathischer Krankheiten können durch die Verwendung des enzyme-linked immunospot Test durchgeführt werden.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

Wir beschrieben ein Verfahren für die Zerlegung von Darmkrebs (CRC), lebensfähige einzelne Zellen, die dann auf kundenspezifische Antikörper Microarrays erkennen Oberflächen-Antigene (DotScan CRC-Microarray) erfasst zu produzieren. Sub-Populationen von Zellen gebunden, die Microarray kann durch Fluoreszenz-Multiplexing mit monoklonalen Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert profiliert werden.

Darmkrebs Zelloberflächenprotein Profiling mit einem Antikörper Microarray und Fluoreszenz Multiplexing

In diesem Video demonstrieren wir den Prozess zum Nachweis von Antikörper-Isotypen in mehreren menschlichen Serumproben anhand eines Microarray-Objektträgers, der mit antigenen Subtypen von Influenzavirusstämmen gedruckt wurde.

Viraler Antigen-Microarray-Assay zum Nachweis von Antikörper-Isotypen im Serum gegen virales Antigen

Dieses Video zeigt eine Methode zum Nachweis der Cyanobakterienstämme in einer Umweltprobe mit einem Antikörper-Microarray-Chip. Proben, die verschiedene Bakterien tragen, interagieren mit gedruckten Antikörpern, und die Immunfärbung mit Fluorophor-markierten Anti-Cyanobakterien-Stamm-Antikörpern zeigt das Vorhandensein spezifischer Cyanobakterienstämme durch Fluoreszenz an bestimmten Stellen.

Eine Technik zum Nachweis cyanobakterieller Stämme mit Hilfe eines Antikörper-Microarray-Chips

Das Vorhandensein von cyanobakteriellen Toxinen in Süßwasserreservoirs für den menschlichen Gebrauch ist ein großes Problem für die Wasserwirtschaftsbehörden. Um das Risiko einer Wasserkontamination zu bewerten, wird in diesem Artikel ein Protokoll für den Vor-Ort-Nachweis von Cyanobakterienstämmen in flüssigen und festen Proben unter Verwendung eines Antikörper-Microarray-Chips beschrieben.

Experimentelles Protokoll zum Nachweis Cyanobakterien In flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper Microarray-Chip

Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.

Snap Chip für Cross-reactivity frei und Spotter Multiplex Sandwich Immunoassays

Hier präsentieren wir ein Protokoll um die Entwicklung und Validierung eines einzelnen Moleküls Array digitale ELISA Assays, ermöglicht ultra-sensitive Detektion von allen IFN-α-Subtypen in humanen Proben zu beschreiben.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Verwendung eines Protein-Mikroarrays, das durch den Druck von Influenza-Antigenen auf nitrozellulosebeschichtete Dias konstruiert wurde, um gleichzeitig Serum für mehrere Antikörper-Isotypen gegen über 250 Antigene aus verschiedenen Virusstämmen zu sonden, Messung der Breite von Serumantikörpern über Virussubtypen hinweg.

Verwendung eines Influenza-Antigen-Mikroarrays zur Messung der Breite von Serum-Antikörpern über Virussubtypen hinweg

Im Einklang mit dem dringenden Bedarf an Screening auf Typ-1-Diabetes, Zöliakie und Coronavirus-Krankheit 2019 haben wir einen 6-Plex-Elektrochemilumineszenz-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um alle vier Inselautoantikörper, Gewebetransglutaminase-Autoantikörper und Antikörper gegen die Rezeptorbindungsdomäne des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 gleichzeitig nachzuweisen.

Ein Hochdurchsatz-Multiplex-Screening auf Typ-1-Diabetes, Zöliakie und COVID-19

Lernen Sie einen Protein-Microarray-Assay zur serologischen Bestimmung antigenspezifischer Antikörperantworten nach Clostridium difficile-Infektion. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Quantifizierung multipler Isotypen und stammspezifischer Antikörper.

Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion (Video) | JoVE Journal

Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

Weitere Videos entdecken