Isolierung der menschlichen Endothelzellen aus normalen Colon und kolorektalen Karzinom - eine verbesserte Protokoll

Das übergeordnete Ziel dieses Zellisolationsprotokolls ist es, reine und lebensfähige Endothelzellen von Patienten mit kolorektalem Karzinom zu gewinnen, sowohl aus dem Tumor als auch aus dem entsprechenden normalen Dickdarm. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Tumorbiologie und Angiogenese zu beantworten, wie z.B. die Abschätzung und Analyse des Einflusses des Blutgefäßsystems auf die kolorektale Tumorgenese. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man eine relativ hohe Erfolgsquote bei der Gewinnung reiner und lebensfähiger menschlicher Endothelzellen von Patienten mit kolorektalem Karzinom haben kann.

Um die Gewebeprobe von kolorektalen Karzinompatienten zu gewinnen, verwenden Sie ein frisches Skalpell, um Gewebestücke zu gewinnen, die etwa ein Gramm wiegen. Anschließend werden die frischen Gewebestücke mit einer sterilen Pinzette in 40 Milliliter eiskaltem HBSS-Puffer mit Antibiotika in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Dann wird das Karzinom und das normale Gewebe mit einer separaten sterilen Pinzette nacheinander von einem Zentrifugenröhrchen in ein anderes übertragen, um viermal 40 Milliliter eiskalten HBSS-Puffer mit Antibiotika einzuwaschen.

Um sämtliches Fett, nicht-tumoröses Gewebe oder potenziell nekrotische Gewebeteile zu entfernen, verwenden Sie eine sterile Pinzette und übertragen Sie die Gewebestücke in eine sterile Zellkultur-Petrischale. Fügen Sie dann drei bis fünf Milliliter des mit Antibiotika angereicherten HBSS-Puffers hinzu, um die Gewebestücke feucht zu halten. Verwenden Sie anschließend ein frisches Skalpell, um die Taschentuchstücke zu schneiden.

Verwenden Sie dann ein Skalpell mit einer gebogenen Klinge, um das restliche Gewebe in kleine Stücke zu zerkleinern. Übertragen Sie die zerkleinerten Gewebestücke in ein Gewebedissoziationsröhrchen, das mit vorgewärmtem Zellkulturmedium gefüllt ist. Dissoziieren Sie die zerkleinerten Gewebestücke mit einem Gewebedissoziator zusammen mit einem Tumordissoziationskit für menschliches Gewebe gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Der erste kritische Schritt besteht darin, das Operationspräparat korrekt zu verarbeiten und zu mikrodisparieren, um Gewebestücke mit der richtigen Größe und dem richtigen Gewebetyp zu erhalten. Nachdem Sie die Gewebestücke dissoziiert haben, zentrifugieren Sie sie bei Raumtemperatur bei 300-facher Schwerkraft für eine Minute. Geben Sie dann mit einer serologischen Pipette 10 Milliliter vorgewärmtes DMEM Low Medium in das MACS-Röhrchen.

Gießen Sie anschließend die Zellsuspension aus dem Röhrchen auf ein Zellsieb mit einer Porengröße von 100 Mikrometern, das auf ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aufgesetzt ist. Pipettieren Sie weitere 10 Milliliter DMEM Low Medium in das MACS-Röhrchen, um die zusätzlichen Zellen aus dem Röhrchen durch das Sieb im Zentrifugenröhrchen zu spülen. Sobald die gesamte Zellsuspension filtriert ist, waschen Sie das Zellsieb mit zusätzlichen 10 Millilitern DMEM Low Medium.

Die Zellsuspension wird bei Raumtemperatur bei 300-facher Schwerkraft sieben Minuten lang zentrifugiert. Entsorgen Sie dann den Überstand, sobald die Zentrifugation beendet ist. Lösen Sie dann das Zellpellet in fünf Millilitern mit Antibiotika versetztem, vorgewärmtem EBM-2-MV-Medium im selben 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf.

Entfernen Sie die Beschichtungslösung aus dem Kulturkolben und überführen Sie die Zellsuspension direkt in einen T-25-Kulturkolben, der bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gehalten wird. Wenn die Konfluenz etwa 80 bis 90 % erreicht, fügen Sie einen Milliliter Accutase hinzu, um die Zellen im Kolben zu lösen. Lassen Sie dann die Zellen 10 Minuten lang mit der Accutase.

Geben Sie als Nächstes vier Milliliter EBM-2-MV-Medium in einem Winkel von 37 Grad zu den Zellen. Verwenden Sie dann ein automatisiertes Zellzählgerät mit einem Bereich von 10 bis 25 Mikrometern, um die Zellen zu zählen. Der zweitwichtigste Schritt sind alle Schritte, bei denen die Zellen geteilt werden müssen.

Die Schätzung des richtigen Zeitpunkts erfordert Erfahrung. Kommt die Teilung zu früh, sterben die Zellen ab. Wenn die Spaltung zu spät kommt, erreichen die Endothelzellen eine Seneszenz oder die Überwucherung der Fibroblasten ist ein Problem.

Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen vier Minuten lang bei Raumtemperatur bei der 250-fachen Schwerkraft und stoßen Sie den Überstand am Ende des Laufs aus. Als nächstes lösen Sie das Zellpellet in vorgewärmtem FACS-Puffer auf. Fügen Sie dann die FACS-Färbeantikörper zu den Zellen hinzu.

Mischen und anschließend insgesamt 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Hälfte dieser Inkubationszeit schnippen Sie einmal mit dem Röhrchen. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um zwei Milliliter FACS-Puffer zur markierten Zellsuspension hinzuzufügen.

Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension vier Minuten lang bei Raumtemperatur bei der 250-fachen Schwerkraft und dekantieren den Überstand nach Beendigung der Zentrifugation. Fügen Sie dann zwei Milliliter FACS-Puffer hinzu, um das Zellpellet aufzulösen, und zentrifugieren Sie die Zellsuspension vier Minuten lang bei Raumtemperatur bei 250-facher Schwerkraft. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern mit Antibiotika angereichertem EBM-2-MV-Medium.

Übertragen Sie anschließend die Zellen auf das FACS-Sortierinstrument. Identifizieren Sie dreifach positive Zellen und lassen Sie sie in die 24-Well-Kulturschale aussäen, die mit frischem, vorgewärmtem EBM-2-MV-Medium gefüllt ist. Kultivieren Sie die Zellen für die nächsten 48 Stunden und erneuern Sie dann das Medium.

Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, bis die Konfluenz in fünf bis 10 Tagen 90 bis 100 % erreicht. Erweitern Sie dann die Zellpopulation entsprechend der gewünschten Kulturschale. Ernten Sie dann, sobald die Konfluenz erreicht ist, und fahren Sie mit der Charakterisierung fort.

Zunächst wird die gewonnene Tumorprobe dissoziiert und in einer Zellkulturschale ausgesiedelt. Die nicht adhärenten Zellen werden abgewaschen und die adhärenten Zellen werden vor der FACS-Sortierung auf eine Konfluenz von 80 bis 90 % kultiviert. Als nächstes wird eine FACS-Analyse durchgeführt, um die Population des immunmarkierten lebensfähigen Tumors und der normalen Endothelzellen zu identifizieren.

Zu diesem Zweck wird eine Fluorochrom-gekoppelte Antikörper-spezifische Dreifachmarkierung der normalen und Tumorendothelzellen durchgeführt, die durch FACS sortiert wird. Durchschnittlich 3,6 bzw. 5,6 % der gesamten Zellpopulation sind Tumorzellen bzw. normale Endothelzellen. Um die Expression der Endothelzellmarker zu identifizieren, werden die erhaltenen Normal- und Tumorendothelzellen einer Immunzytochemie unterzogen.

Die Bilder hier zeigen CD31-positive normale und Tumorendothelzellen. Dann wird die RNA aus der CD31-positiven Population von Endothelzellen isoliert und einer RT-qPCR unterzogen, um die anderen endothelzellspezifischen Marker zu identifizieren. Aus dem Diagramm geht auch die Expression von Endothelzellmarkern wie CD105, VE-Cadherin und dem von-Willebrand-Faktor hervor, aber die Expression von Markern aus potenziell kontaminierenden Zellpopulationen fehlt, was auf die Reinheit der isolierten Endothelzellkulturen hinweist.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. In der Regel werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie Erfahrung mit primären Endothelzellkulturen erfordert, um abzuschätzen, wann und in welchem Verhältnis die Zellen gespalten oder für die FACS-Sortieranalyse weiterverarbeitet werden können. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des kolorektalen Karzinoms, da die Zellkulturen verwendet werden können, um Mechanismen der Tumorgenese, des Ansprechens auf die Behandlung oder der Resistenz beim kolorektalen Karzinom zu identifizieren.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir in der Literatur mehrere Berichte lasen, die auf Probleme bei der Etablierung von wirklich reinen und lebensfähigen Endothelzellen aus menschlichen soliden Tumoren hinwiesen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Gewebemikrodissektion oder der Verarbeitung für die FACS-Sortieranalyse oder die weitere Spaltung von Endothelzellen Erfahrung erfordern, um den richtigen Zeitpunkt abzuschätzen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, zunächst ein funktionelles kooperatives Netzwerk mit der Chirurgie, der Pathologie und dem Tumorregister aufzubauen.

Darüber hinaus sollten Sie in Bewegung geschult werden, um mit primären Endothelzellkulturen zu arbeiten, da diese Zellen zerbrechlich sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Endothelzellen aus dem menschlichen kolorektalen Karzinom und dem entsprechenden normalen Dickdarm isoliert werden können.