Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

Das übergeordnete Ziel dieser Analysetechnik ist es, das Anti-Tuberkulose-Medikament Ethambutol in den Gewebekompartimenten der Lungenläsionen der Tuberkulose zu quantifizieren, um festzustellen, ob die bakteriziden Wirkstoffkonzentrationen erreicht werden. Diese Methode kann Fragen im Bereich der Erforschung und Entwicklung von Tuberkulosemedikamenten beantworten, indem sie bestimmt, ob verabreichte Medikamente Bakterienpopulationen in sterilisierenden Konzentrationen in allen Granulomgewebekompartimenten erreichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine vollständige Quantifizierung der Wirkstoffkonzentrationen bei hoher räumlicher Detailgenauigkeit innerhalb spezifischer Gewebestrukturen und Zellpopulationen ermöglicht.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zum Schneiden und Einbinden des Gewebes aufgrund des Potenzials einer Gewebekontamination und der Zerbrechlichkeit der Membranobjektträger schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Gewebeentnahme, wie im Textprotokoll beschrieben. Um einen Gewebeschnitt durchzuführen, stellen Sie den Kryostaten zunächst auf die gewünschte Schnitttemperatur ein.

Übertragen Sie die gammabestrahlte Lungenbiopsie aus dem bei minus 80 Grad Celsius warmen Lager in den Kryostaten und lassen Sie sie 30 Minuten lang einwirken, um die Gewebetemperatur auszugleichen. Befestigen Sie die Biopsie mit einer Pinzette auf dem Kryostat-Futter mit einer kleinen Menge Klebstoff mit optimaler Schnitttemperatur, um die Basis des Gewebes auf dem Futter zu befestigen. Richten Sie das Gewebe so aus, dass die flache Oberfläche die freiliegende Oberfläche zum Schneiden ist.

Stellen Sie sicher, dass das OCT die Gewebeoberfläche nicht kontaminiert, da dies die anschließende massenspektrometrische Analyse beeinträchtigen kann. Schneiden Sie drei Gewebeschnitte mit einer Dicke von 25 Mikrometern und montieren Sie sie auf PET-Objektträger. Berühren Sie die Membran vorsichtig mit dem Gewebeabschnitt und entfernen Sie den Abschnitt.

Wenn zu viel Druck ausgeübt wird, kann die dünne Membran reißen. Vermeiden Sie eine übermäßige Handhabung des Objektträgers vor der Montage, um die PET-Membran nicht aufzuladen und die Haftung des Gewebeschnitts zu verringern. Halten Sie den Membranobjektträger bei Raumtemperatur, um eine Auftaumontage und eine erfolgreiche Haftung des Gewebes an der Membran zu ermöglichen.

Nehmen Sie den Objektträger aus dem Kryostaten und lassen Sie den Objektträger drei Minuten lang an der Luft trocknen. Wenn die LCM-LC-MS/MS nicht sofort durchgeführt wird, verschließen Sie den Objektträger in einem kleinen, luftdicht verschließbaren Beutel und stellen Sie ihn in die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius, bis er für die Dissektion benötigt wird. Schneiden Sie einen angrenzenden Abschnitt bei 10 bis 12 Mikrometern und tauen Sie ihn für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung auf einen Standard-Objektträger auf.

Zu diesem Zeitpunkt können zusätzliche Abschnitte für andere gewünschte histochemische Färbungen geschnitten werden. Nehmen Sie den versiegelten Beutel mit dem Objektträger aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius und lassen Sie ihn fünf Minuten lang Raumtemperatur erreichen. Wenn der kalte Objektträger sofort der Laboratmosphäre ausgesetzt wird, wird das Gewebe mit Kondenswasser überzogen und die räumliche Integrität des Arzneimittels kann beeinträchtigt werden.

Schalten Sie das Mikroskop und den Laser ein. Der Laser benötigt fünf bis 10 Minuten, um sich aufzuwärmen, bevor mit dem Schneiden begonnen werden kann. Legen Sie 0,20-Milliliter-PCR-Röhrchen mit flachem Verschluss in den Halter.

Nachdem Sie den Objektträger aus dem Beutel entnommen haben, nehmen Sie mit einem Flachbettscanner ein optisches Bild des Gewebeschnitts auf dem PET-Objektträger auf. Legen Sie den Objektträger mit der Taschentuchseite nach unten in den Objektträgerhalter. Weisen Sie mit der Mikroskopsoftware separate Entnahmeröhrchen bestimmten Granulomregionen von Interesse zu.

Typischerweise handelt es sich dabei um unbeteiligte Lungen-, zelluläre Granulome und Caseum, können aber je nach spezifischer Pathologie der Granulombiopsie variieren. Fokussieren Sie das Gewebe mit dem 5X-Mikroskopobjektiv. Diese Vergrößerung sollte einen guten Überblick über das Gewebe geben, das sowohl zelluläre als auch nekrotische Granulombereiche enthält.

Wählen Sie in der Software das für das Caseum vorgesehene Röhrchen aus, um es unter dem Gewebe in Position zu bringen. Geben Sie die gewünschten Dissektionsparameter ein. Typische Einstellungen für einen 25 Mikrometer dicken Lungenschnitt sind die Laserleistung 30, die Geschwindigkeit 15 und die Apertur 35.

Diese unterscheiden sich jedoch je nach verwendetem Mikroskop und möglicherweise abnehmender Leistung aufgrund des Alters des Lasers. Wählen Sie das Werkzeug "Frei zeichnen" aus und skizzieren Sie mit einer Maus oder einem Touchscreen-Stift den gewünschten Bereich zum Sezieren. Die Oberfläche des Bereichs wird in der Software angezeigt.

Halten Sie ausgewählte Bereiche unter 500.000 Quadratmikrometern, um das Sezieren zu erleichtern. Wiederholen Sie die Dissektion, bis insgesamt drei Millionen Quadratmikrometer in der Röhrchenkappe gesammelt wurden. Gelegentlich kann es vorkommen, dass der präparierte Bereich an der umgebenden Membran haften bleibt und nicht in die Auffangkappe fällt.

Entfernen Sie diese Bereiche aus der kumulierten Gesamtfläche, indem Sie sie in der Software manuell auswählen und entfernen. Wählen Sie als Nächstes die Kappe für zelluläre Läsionen aus und sammeln Sie mit dem gleichen Verfahren drei Millionen Quadratmikrometer Gewebe. Wählen Sie die Kappe für die unbeteiligte Lunge und sammeln Sie mit dem gleichen Verfahren drei Millionen Quadratmikrometer Gewebe.

Beachten Sie, dass unbeteiligtes Lungengewebe viele Bronchiolen und Alveolarräume enthält. Achten Sie sorgfältig darauf, diese aus den definierten Geweberegionen für die Dissektion auszuschließen. Entfernen Sie den Kappenhalter und lösen, versiegeln und beschriften Sie jedes Röhrchen vorsichtig.

Schützen Sie das präparierte Gewebe vor Störungen der Umgebungsluft. Analysieren Sie das präparierte Gewebe sofort oder lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius und tauen Sie es vor der Verarbeitung und LC/MS-Analyse auf. Unter der Annahme einer Gewebedichte von einem Gramm pro Milliliter bereiten Sie den Homogenatbestand vor, indem Sie 50 Milligramm Kontrollgewebe wiegen und PBS-Puffer zur Verdünnung hinzufügen.

Homogenisieren Sie das Gewebe, indem Sie das Lungengewebe und den PBS-Puffer fünf Minuten lang bei 1750 U/min auf einem Bead-Homogenisator mit Kügelchen schlagen. Verdünnen Sie als Nächstes ein Milligramm pro Milliliter Arzneimittel in Eins-zu-Eins-Acetonitril/Wasser, um Standard-Kurven-Spiking-Lösungen herzustellen. Bestimmen Sie die Spike-Standardkonzentrationen basierend auf dem Spike-Volumen und dem Zielgewebevolumen.

Das illustrierte Beispiel bezieht sich auf einen Standard von 100 Nanogramm pro Milliliter unter Verwendung eines Spike-Volumens von 10 Mikrolitern. Nehmen Sie die Röhrchen mit dem mikropräparierten Gewebe aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius und lassen Sie sie fünf Minuten lang Raumtemperatur erreichen. Geben Sie 10 Mikroliter Eins-zu-Eins-Lösung Acetonitril/Wasser und zwei Mikroliter PBS-Puffer in die Röhrchen mit dem mikropräparierten Gewebe.

Für Standardkurven- und Qualitätskontrollröhrchen fügen Sie 10 Mikroliter Spike-Lösung zu zwei Mikrolitern Kontrolllungenhomogenat hinzu. Geben Sie 50 Mikroliter Extraktionslösung in jedes Röhrchen. Wirbeln Sie jedes Rohr fünf Minuten lang durch.

Beschallen Sie sie dann fünf Minuten lang. Zentrifugieren Sie anschließend die Röhrchen fünf Minuten lang bei 5.000 U/min, um in jedem Röhrchen ein Pellet aus Folie und Gewebe zu bilden. Nach der Zentrifugation werden 50 Mikroliter Überstand in eine 96-Well-Tiefenplatte überführt und mit weiteren 50 Mikrolitern deionisiertem Wasser in jeder Vertiefung verdünnt.

Führen Sie abschließend die LC-MS/MS-Analyse und Methodenvalidierung durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Die LCM-LC/MS-Methode wurde zunächst durch die Analyse von lasermikropräparierten Regionen aus Ethambutol-dotiertem Gewebehomogenat validiert. Wie hier gezeigt, war die Methode hochgradig reproduzierbar und zeigte eine hervorragende Wirkstoffrückgewinnung.

Die mittels LCM-LC/MS gemessenen Ethambutol-Konzentrationen in mehreren Lungengeweben wurden durch direkten Vergleich mit Konzentrationen, die durch einen etablierten LC/MS-Ansatz bestimmt wurden, weiter validiert. Äquivalente Konzentrationen wurden mit beiden Techniken nachgewiesen. Die absoluten Ethambutol-Konzentrationen im unbeteiligten Lungenparenchym, im zellulären Läsionsrand und im nekrotischen Caseum wurden mittels LCM-LC/MS bestimmt.

Mycobacterium tuberculosis-Sterilisationswerte wurden in allen Läsionskompartimenten erreicht. Die Mindestkonzentrationen, die erforderlich sind, um 99 % der extrazellulären replizierenden Bazillen und 99 % der intrazellulären Bazillen in Makrophagen abzutöten, sind angegeben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gewebe mikrodispariert und die Wirkstoffspiegel innerhalb definierter pulmonaler Granulomstrukturen quantifiziert

Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der antimikrobiellen Wirkstoffforschung, genau und quantitativ zu beurteilen, ob verabreichte Medikamente bei sterilisierenden Konzentrationen die Zielerregerpopulationen erreichen. Dieser Ansatz ist auf viele verschiedene Gewebe und Krankheitszustände anwendbar.