Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

Hier beschreiben wir ein hohe Auflösung vollständig-hängen bildgebende Verfahren in der gesamten erwachsenen Maus Ohr Haut, die was uns ermöglicht, verzweigte Morphogenese und Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie Immunzelle Verteilung zu visualisieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die verzweigte Morphogenese und die Musterung peripherer Nerven und Blutgefäße sowie die Verteilung der Immunzellen sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Neurobiologie, Gefäßbiologie und Immunologie zu beantworten, indem sie morphologische Anomalien in peripheren Nerven und Blutgefäßen sowie Entzündungen beleuchtet. Die Hauptstärke dieser Technik besteht darin, dass wir die zellulären Bestandteile der peripheren Nerven, Blutgefäße und Immunzellen in der Haut über ihre gesamte Tiefe sichtbar machen und die dreidimensionale Architektur des Nerven- und Gefäßsystems vergleichen können.

Diese Methode kann Einblicke in die Strukturen der Neurovaskulatur und die Immunzellverteilung von juvenilen bis adulten Mäusen unter normalen und pathologischen Bedingungen geben. Nachdem Sie erwachsene Mäuse gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert haben, präparieren Sie das Ohr von der Basis und legen Sie es in eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale, die zwei Milliliter HBSS enthält. Schneide dann mit einer Schere die Haare kurz ab.

Ziehen Sie die hintere und vordere Haut vorsichtig vom dazwischenliegenden Knorpel ab. Übertragen Sie jeden Hautabschnitt separat auf eine 24-Well-Platte, die einen Milliliter eiskaltes, frisches 4 %PFA in PBS pro Well enthält. Glätten Sie dann die Haut im PFA.

Fixieren Sie anschließend die hintere und vordere Haut eine Stunde lang mit Knorpel bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie dann einen Milliliter PBS, um die Haut dreimal fünf Minuten lang unter sanftem Mischen bei Raumtemperatur zu waschen. Übertragen Sie die Haut mit Knorpel auf den Boden einer 35 x 10 Millimeter großen Petrischale.

Verwenden Sie eine feine gebogene Pinzette, um den Knorpel von der Vorderhaut abzuziehen. Schneiden Sie dann die Basisregion ab, die gefaltet ist und Fett- und Bindegewebe aufweist. Entfernen Sie mit derselben Pinzette vorsichtig die Haare, das Fettgewebe und das Bindegewebe von der Innenseite der hinteren Haut.

Verwenden Sie PBS, um die Haut feucht zu halten. Um eine immunhistochemische Färbung für den gesamten Mount durchzuführen, übertragen Sie die hintere und vordere Haut auf eine 24-Well-Platte, die einen Milliliter 10 % hitzeinaktivierten Serumblockierungspuffer pro Well enthält. Inkubieren Sie die Haut unter sanftem Mischen bei Raumtemperatur für 30 Minuten.

Verdünnen Sie die Primärantikörper im Blockierungspuffer, wie im Textprotokoll beschrieben, und geben Sie 150 Mikroliter Primärantikörper im Blockierungspuffer in die Vertiefung. Übertragen Sie dann die hintere und vordere Haut in neue Vertiefungen, die Primärantikörper enthalten. Inkubieren Sie die Haut mit sanftem Mischen bei vier Grad Celsius über Nacht.

Am nächsten Tag, nachdem Sie die Haut in neue Vertiefungen übertragen oder die primären Antikörper aspiriert haben, fügen Sie einen Milliliter 2%Serum in PBS mit 0,2%Triton X-100 hinzu. Waschen Sie die Proben unter schonendem Mischen bei Raumtemperatur 15 Minuten lang. Wiederholen Sie den Waschgang noch zwei Mal.

In der Zwischenzeit bereiten Sie Sekundärantikörper in einem 10%igen Blockierungspuffer vor und filtrieren Sie die Antikörperlösungen durch einen 0,22-Mikrometer-PVDF-Membranspritzenfilter, der mit einer Ein-Milliliter-Spritze verbunden ist. Die Lösung wird 10 Minuten lang bei 13.000-facher Schwerkraft zentrifugiert, um aggregierte Partikel der Sekundärantikörper aus dem Blockierungspuffer zu entfernen, und 150 Mikroliter Sekundärantikörper im Blockierungspuffer in die neue Vertiefung gegeben. Übertragen Sie die Haut in die Vertiefung mit den Sekundärantikörpern.

Wickeln Sie die 24-Well-Platte in Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie die Haut unter sanftem Mischen bei Raumtemperatur eine Stunde lang. Fügen Sie einen Milliliter 2%Serum-Waschpuffer hinzu. Übertragen Sie dann die hintere und vordere Haut in die Vertiefungen mit dem Waschpuffer.

Wickeln Sie die Platte ein und waschen Sie die Proben unter leichtem Mischen bei Raumtemperatur 15 Minuten lang. Wiederholen Sie den Waschgang noch zwei Mal. Lege die Haut auf den Boden einer 35 x 10 Millimeter großen Petrischale.

Verwenden Sie dann unter einem Stereomikroskop mit geringer Beleuchtung, um das Photobleichen zu minimieren, eine feine gebogene Pinzette, um die Haare, das Fettgewebe, das Bindegewebe, den Staub und die Fasern vorsichtig von der Innenseite der Haut zu entfernen. Verwenden Sie PBS, um die Haut feucht zu halten. Übertragen Sie mit einer Pinzette die hintere und vordere Haut mit der Innenseite nach oben auf einen selbstklebenden Objektträger.

Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut zu glätten. Montieren Sie die Haut in einem flüssigen Anti-Fade-Eindeckmedium, um Lichtbleiche zu vermeiden und Fluoreszenzsignale zu erhalten. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen auf oder um die Haut herum befinden.

Lagern Sie die verfärbten Hautprobenobjektträger über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur, damit das Einbettmedium fest werden kann. Verwenden Sie dann Nagellack, um das Deckglas auf dem Objektträger zu versiegeln, und lagern Sie es für die Langzeitlagerung bei vier Grad Celsius. Um die konfokale Mikroskopie durchzuführen, stellen Sie geeignete Laser für Fluorophore auf.

In diesem Experiment wird ein konfokales Mikroskop mit drei Laserquellen verwendet. Bilden Sie die Proben unter einem 10-fachen Objektiv ab und verwenden Sie das sequentielle Scan-Werkzeug, das gleichzeitig dreifach gefärbte Proben anregt, um Überlappungen zu vermeiden und zu reduzieren. In diesem Experiment wurden die hintere Ohrhaut und die vordere Ohrhaut von adulten Mäusen mit Antikörpern gegen alpha-SMA, Tuj1 und PECAM-1 immungefärbt.

Die hintere Haut wurde immungefärbt, um die Neuroimmunverteilung unter Verwendung von Antikörpern gegen CD11b und MBP zusammen mit Tuj1 zu untersuchen. Schließlich wurde, wie hier gezeigt, die Verteilung von CD11b-positiven Entzündungszellen, einschließlich Makrophagen, mit einer Einzelzellauflösung nachgewiesen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Haut vorsichtig zu behandeln und die Haare, das Fettgewebe und das Bindegewebe vorsichtig und langsam von der Innenseite der Ohrhaut zu entfernen, bevor Sie es montieren.

Diese Technik wird den Forschern den Weg ebnen, die verzweigte Morphogenese und die Musterbildung peripherer Nerven und Blutgefäße sowie die dreidimensionale Verteilung von Hautbestandteilen, einschließlich Immunzellen, in juvenilen bis erwachsenen Mausmodellen zu untersuchen. Danke fürs Zuschauen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.