Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, lokalisierte DNA-Doppelstrangbrüche mit einem allgemein verfügbaren konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop zu erzeugen und automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik von DNA-Reparaturfaktoren an diesen Läsionen bereitzustellen. Diese Methode kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Protein zu doppelsträngigen DNA-Brüchen rekrutiert wird, und um die Signalwege abzugrenzen, die seine Akkumulation an DNA-Läsionen regulieren. Bei der Technik wird ein allgemein verfügbares konfokales Mikroskopsystem verwendet, um DNA-Schäden lokal zu induzieren.

Dies ermöglicht es praktisch jedem Labor, die Kinetik der DNA-Schadensreaktion zu untersuchen. Wenn Sie die Lebendrekrutierung eines fluoreszenzmarkierten Proteins überwachen, führen Sie eine transiente Transfektion oder die Auswahl stabiler Zelllinien durch, die das Protein von Interesse exprimieren und mit einem fluoreszierenden Reporter fusioniert sind. 24 Stunden vor dem Mikrobestrahlungsexperiment säten 40.000 U2OS-Zellen pro Vertiefung in DMEM 1X mit 10 % FBS in Kulturobjektträgern mit acht Vertiefungen und 170 Mikrometer dicken, deckglasartigen Glaspolymerböden aus.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2. Um die Anzahl der doppelsträngigen Brüche zu erhöhen, die durch die Exposition mit dem 405-Nanometer-Laser erzeugt werden, fügen Sie den Zellen BBET in einer Menge von 10 Mikrogramm pro Milliliter im entsprechenden Medium hinzu. Behandeln Sie die Zellen 15 Minuten lang in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Spülen Sie die Zellen vor der Mikrobestrahlung mit einer Mikropipette zweimal mit Medium ohne Phenolrot, um eine maximale Exposition der Zellen gegenüber dem 405-Nanometer-Laser zu gewährleisten. Jedes konfokale Mikroskop, das mit dem 405-Nanometer-Laser ausgestattet ist, kann für diese Methode verwendet werden. Benutzer müssen ihr System sorgfältig kalibrieren, um physiologische Werte für DNA-Schäden zu erreichen.

Wie das geht, beschreiben wir im ausführlichen Protokoll. Wählen Sie ein geeignetes konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem 405-Nanometer-Laser ausgestattet ist. Schalten Sie das Mikroskop und die Klimakammer ein.

Wählen Sie Felder mit gut verteilten Zellen aus, passen Sie den Fokus an und registrieren Sie ihre Position, um die Bildaufnahme nach dem Immunfluoreszenzprotokoll zu erleichtern. Wenn Sie ein fluoreszenzmarkiertes Protein für die Live-Bildgebung verwenden, nehmen Sie mindestens ein Bild auf, das als Referenzpunkt vor der Schädigung dient, um die Kinetik der Proteinrekrutierung nach der Mikrobestrahlung zu überwachen. Bei Immunfluoreszenzexperimenten mit BBET-markierten Zellen wird der Fokus auf die Zellen mit dem 405-Nanometer-Laser bei der geringsten Laserleistung eingestellt, die für die Visualisierung der Zellen ausreicht, um ungerechtfertigte DNA-Schäden zu vermeiden.

Wenn Sie Zellen verwenden, die das fluoreszenzmarkierte Protein von Interesse exprimieren, wählen Sie eine Fokalebene mit repräsentativer Fluoreszenzintensität. Konfigurieren Sie das Mikroskop für den Mikrobestrahlungsschritt mit Hilfe des Fluoreszenz-Rückgewinnungsmoduls nach Photobleaching des Systems. Wählen Sie mit dem FRAP-Modul des Mikroskopsystems die interessierenden Bereiche aus, die mikrobestrahlt werden sollen.

Sobald dies erledigt ist, bestrahlen Sie die Zellen mit Mikrostrahlung. Typischerweise werden Chromatin-assoziierte Faktoren innerhalb von zwei Minuten zu doppelsträngigen Brüchen rekrutiert. Die Resektion der Brüche durch Nukleasen erzeugt einzelsträngige DNA und fördert die Rekrutierung von homologen Rekombinationsfaktoren, die 10 Minuten nach der Mikrobestrahlung nachweisbar werden.

Stellen Sie die Multi-Well-Slides nach der Mikrobestrahlung für die erforderliche Dauer bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 zurück in den Inkubator, bevor Sie die Proben für die Immunfluoreszenz verarbeiten. Oder fahren Sie sofort mit der Live-Zeitraffer-Bildgebung fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Um mit der Analyse zu beginnen, öffnen Sie die erfassten Bilder in Fidschi.

Wählen Sie den Damage Analyzer aus dem Pulldown-Plug-In-Menü in der Mikroeinstrahlungsanalyse-Suite aus. Definieren Sie die Zeiteinheiten und das Zeitintervall zwischen den Frames und registrieren Sie dann die Bildserie mit dem StackReg-Algorithmus. Befolgen Sie die Anweisungen, um in jeder mikrobestrahlten Zelle einen Bereich of Interest (ROI) für den Hintergrund zu definieren.

Definieren Sie außerdem nicht-bestrahlte und bestrahlte ROIs in jeder mikrobestrahlten Zelle. Nachdem alle ROI-Daten über die gesamte Zeitrafferreihe gesammelt wurden, speichern Sie die vom Plug-In erstellte Datei mit den Ergebnissen als kommagetrennte Datei. Diese Datei enthält Messungen der mittleren Intensität für jeden Zeitpunkt und jeden ROI.

Führen Sie die Analyse mit dem Plug-In für alle mikrobestrahlten Zellen durch, und stellen Sie die relative Anreicherung in mikrobestrahlten Bereichen im Zeitverlauf grafisch dar. Dieser Schritt sollte für mindestens 15 bis 30 Zellen wiederholt werden, und die mittlere Anreicherung und die Standardfehler des Mittelwerts für jeden Datenpunkt sollten berechnet und dargestellt werden. Entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer Mikropipette aus den Vertiefungen der Multiwell-Mikroskopie-Objektträger.

Waschen Sie die Zellen sofort mit 500 Mikrolitern IF-Waschlösung, indem Sie die Lösung zweimal ohne Wartezeit wechseln. Dann fünf Minuten lang auf Eis mit 500 Mikrolitern eiskalter IF-Lösung vor und nach der Extraktion inkubieren. 15 bis 30 Sekunden lang vorsichtig von Hand schwenken, um den Vorextraktionsschritt durchzuführen, der die meisten zytoplasmatischen und nukleoplasmatischen Proteine entfernt und das Signal von Chromatin und DNA-assoziierten Faktoren maximiert.

Waschen Sie anschließend die Zellen zweimal mit 500 Mikrolitern IF-Waschlösung. Fügen Sie dann 500 Mikroliter IF-Fixierlösung hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach zweimaligem Waschen mit 500 Mikrolitern IF-Waschlösung fünf Minuten lang in 500 Mikrolitern eiskalter IF-Waschlösung vor und nach der Extraktion auf Eis inkubieren.

Schwenken Sie den Objektträger vorsichtig mit der Hand, um den Permeabilisierungsschritt durchzuführen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 Mikrolitern IF-Waschlösung. Inkubieren Sie dann mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 500 Mikrolitern IF-Blockierungslösung.

Entfernen Sie die Blockierungslösung mit einer Mikropipette und fügen Sie 250 Mikroliter Primärantikörperlösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 4 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag viermal für fünf Minuten in 500 Mikrolitern IF-Waschlösung unter leichtem Rühren.

Dann inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 250 Mikrolitern Sekundärantikörpern, die in einer befeuchteten Kammer in Blockierungslösung verdünnt sind. Schützen Sie die Proben vor Licht durch Zugabe von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern. Waschen Sie dann die Zellen viermal jeweils fünf Minuten lang in einer 500 Mikroliter IF-Waschlösung unter leichtem Rühren.

Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 500 Mikrolitern 1X PBS, die ein Mikrogramm pro Milliliter DAPI enthalten, um die Zellkerne zu färben. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit 500 Mikrolitern 1X PBS gewaschen haben, lassen Sie die Zellen in 500 Mikrolitern 1X PBS-Lösung für die Bildgebung. Anhand von gerasterten Objektträgern oder registrierten Tischpositionen finden Sie die mikrobestrahlten Zellen mit Hilfe eines gut charakterisierten DNA-Schadensmarkers.

Bilden Sie die Multiwell-Kulturobjektträger in allen relevanten Kanälen mit den entsprechenden Einstellungen an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ab. Die Laser-Mikrobestrahlung von vorsensibilisierten Zellen führt zur Produktion von DNA-Doppelstrangbrüchen, die durch Nukleasen reseziert werden, um einzelsträngige DNA zu erzeugen. Proteine oder Modifikationen, die sich auf große Chromatindomänen ausbreiten, erscheinen innerhalb von zwei Minuten nach der Mikrobestrahlung als breite Streifen.

Ein Beispiel dafür ist das Muster, das bei Antikörpern beobachtet wurde, die auf die phosphorylierte Histonvariante H2A abzielen. X.Die einzelsträngige DNA kann zu späteren Zeitpunkten als punktuierte Herde mit Antikörpern gegen das Replikationsprotein A sichtbar gemacht werden. Mit dieser Methode ist es offensichtlich, dass 53BP1 auf große Chromatindomänen rekrutiert wird, während die PRP19 E3-Ubiquitin-Ligase auf RPA-kodierte einzelsträngige DNA rekrutiert wird. Die Transfektion von Plasmiden, die für Proteine kodieren, die mit fluoreszierenden Reportern markiert sind, gefolgt von Mikrobestrahlung, ermöglicht die Überwachung der Proteinrekrutierung an DNA-Läsionen in Echtzeit.

Die Mikrobestrahlung von BRDU-präsensibilisierten Zellen, die mit Plasmiden transfiziert wurden, die EGFP oder RPA32 exprimieren, das mit GFP fusioniert ist, zeigt, dass RPA32-GFP, aber nicht EGFP allein, schnell an die einzelsträngige DNA rekrutiert wird, die durch Resektion der doppelsträngigen DNA-Brüche erzeugt wird. Diese Grafik zeigt die Quantifizierung der RPA32 GFP-Signalanreicherung über die Zeit an mikrobestrahlten Loci von 15 unabhängigen Zellen, die mit dem Mikrobestrahlungsanalyse-Fiji-Plug-in analysiert wurden. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in etwa vier Stunden für die Live-Bildgebung von 10 bis 15 einzelnen Zellen durchgeführt werden, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren, und innerhalb von zwei Tagen, wenn Immunfluoreszenz zur Überwachung der Proteinrekrutierung an mikrobestrahlten Loci verwendet wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Laser-Scanning-Mikroskop konfigurieren und es zur Mikrobestrahlung von Zellen und zur Überwachung der Rekrutierung von DNA-Reparaturfaktoren an Schadensstellen verwenden, sowohl in Echtzeit als auch in fixierten Zellen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die hier beschriebenen Erkrankungen doppelsträngige Brüche, aber auch andere Arten von Läsionen erzeugen. Der Benutzer kann jedoch Mikrobestrahlungs- und Präsensibilisierungsmethoden ändern, um bestimmte Arten von Läsionen zu erzeugen, die für seine Forschung relevant sind.

Nach diesem Verfahren kann die Depletion etablierter DNA-Schadensreaktionsfaktoren und die Mutation spezifischer Domänen im interessierenden Protein durchgeführt werden, um zusätzliche Einblicke in den Rekrutierungsmechanismus dieser Faktoren bei DNA-Brüchen zu erhalten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern und Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und das Arbeiten in einer chemischen Haube getroffen werden sollten.