Name: Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie lysosomale Alkalisierung im Darm von lebenden Caenorhabditis elegans mit dem pH-sensitiven Farbstoff cDCFDA bewerten. Diese einfache Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der Autophagieforschung.

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Wir möchten danken Caenorhabditis Genetik Zentrum für Stämme, die Naturwissenschaften und Engineering Research Council (NSERC) und Canada Foundation für Innovation (CFI) für die Finanzierung. Wir möchten danken Dr. Lizhen Chen (Abteilung Zellsysteme und Anatomie, UT Gesundheit San Antonio) dafür, dass die uneingeschränkte Nutzung der ihr Laboreinrichtungen für alle C. Elegans Experimente sowie Dr. Exing Wang (Associate Director, Optical Imaging Facility UT Health San Antonio) Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. Wir möchten auch Dr. Myron Ignatius danken für die Unterstützung und Ermutigung für den Videodreh zu erleichtern.

(1) färben und Image-Darm Lysosomen
<ol><li>Samen Nematoden Wachstumsmedien (NGM) Platten mit OP50
	<ol>
<li>NGM Platten nach den empfohlenen Protokoll19 vorzubereiten und die geschlossenen Platten für 2 Tage bei Zimmertemperatur trocknen.</li>
		<li>OP50 Bakterien in sterilen Luria Brühe (LB) Brühe zu impfen und wachsen in einem schütteln Inkubator oder Wasserbad bei 37 ° C für 36 h oder bis die OD zwischen 0,2 und 0,4. Vermeiden Sie die Verwendung einer Bakterienkultur mit OD > 1 oder OD < 0,2.</li>
		<li>Sobald NGM Platten trocken sind, geben Sie einen Tropfen (~ 30 µL) von OP50 Inokulum auf der Mitte der Platte, und breitete sich dann des Tropfens in einen Patch, der etwa 2 cm x 2 cm groß ist. Hinweis: Alle verbleibenden OP50 Inokulum kann bei 4 ° C bis zu einem Monat gespeichert werden.</li>
		<li>Invertieren Sie die OP50-Platten zu, sobald das Inokulum (etwa 10 oder 15 min) getrocknet ist, und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 36 h.</li>
		<li>Entfernen Sie nach 36 h die Platten im Inkubator und Store bei 4 ° C bis zur späteren Verwendung. Hinweis: Die Platten sollte gut für bis zu 1 Monat bei 4 ° c sein.</li>
	</ol></li>
	<li>Ergänzende cDCFDA, OP50
	<ol>
<li>Ergänzend zu cDCFDA auf OP50 Platten bereiten Sie einen arbeiten bestand von 10 mM cDCFDA in Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Halten Sie die cDCFDA-Lösung geschützt vor Licht und bei-20 ° C für die spätere Verwendung speichern.</li>
		<li>Sanft lege 100 µL 10 mM cDCFDA Lösung auf die Oberfläche von 2 cm x 2 cm OP50 Patch, so dass die gesamte Patch gleichmäßig mit cDCFDA bedeckt ist. Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass der gesamte Patch von OP50 mit cDCFDA bedeckt ist. Falls erforderlich, verwenden Sie bis zu 150 µL des cDCFDA für jede Platte. Es ist auch unerlässlich, dass die cDCFDA Lösung nicht über die Grenzen des OP50 Patch, da jede cDCFDA, die aus dem OP50 Patch fließt nicht in der Nahrung aufgenommen werden und zu geringeren Intensität der Färbung führt.</li>
		<li>Die OP50-Platten in einer dunklen Kiste auf den Tisch legen, bis aller die cDCFDA Lösung ist die bakterielle Patch aufgenommen (in der Regel etwa 25 bis 30 min.).</li>
	</ol></li>
	<li>Färbung der Würmer mit cDCFDA
	<ol>
<li>Sobald die cDCFDA den OP50 Patch vollständig durchdrungen hat, platzieren Sie nicht mehr als 20 Würmer pro Platte zu und inkubieren Sie die Platten bei 20 ° C bei einem Mindestaufenthalt von 14 h invertiert. Hinweis: Es wird empfohlen, die cDCFDA Platten in einem undurchsichtigen Lichteinfall minimieren zu platzieren.</li>
		<li>Zur Steuerung für Aufnahme Unterschiede zwischen Experimenten und cDCFDA Signale zu normalisieren empfohlen () mit 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) (Co Fleck Difluoro) Bor (2,5 µL einer frisch zubereiteten 1 mM-Lösung), ein Acidotropic schwach Amin Farbstoff deren Fluoreszenz weitgehend nicht-Variante im sauren pH-Spektrum ist (siehe Tabelle der Materialien für Trivialnamen von Reagenzien). Hinweis: Flecken Sie Würmer für weniger als 14 h keine, da dies möglicherweise unzureichend cDCFDA Färbung Intensität und eine falsche Interpretation des lysosomalen pH-Wertes geben.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung von Folien für die Mikroskopie
	<ol>
<li>Legen Sie zwei parallele Streifen der Kennzeichnung Band ungefähr 3 Zoll auseinander auf eine glatte, flache Oberfläche wie ein Spiegel (Abbildung 1).</li>
		<li>Beschichten der Oberfläche des Spiegels mit Wasser abweisenden Spray und überschüssige Flüssigkeit abwischen.</li>
		<li>Schmelzen Sie 2 % Agarose (gelöst in destilliertem H2O) in der Mikrowelle bis vollständig verflüssigt, dann Tropfen Sie einen 50 µL Agarose zwischen den beiden Streifen Klebeband und decken Sie schnell den Tropfen mit einem Mikroskop-Objektträger, so dass die Folie senkrecht zu den Streifen des Band. Nachdem die Agarose erstarrt ist, bilden eine kreisförmige Pad unterhalb der Folie umdrehen Sie die Folie und fügen Sie 10 bis 15 µL 5mM Natriumazid (NaN3) auf das Agarose-Pad. Hinweis: NaN3 ist ein Inhibitor der Cytochrom C, die bei in geringen Konzentrationen verwendet, reversibel anesthetizes Würmer, so dass sie nicht während der Aufnahme bewegt.</li>
		<li>Wählen Sie Würmer aus dem OP50-Teller mit cDCFDA ergänzt, und übertragen Sie sie auf einen sauberen Teller der NGM ohne jede OP50. Können Sie die Würmer, sich für einige Sekunden, um die meisten der OP50 erlauben zu bewegen von der Oberfläche der Würmer entfernt werden, und übertragen Sie dann die Würmer auf die Agarose-Pad mit 5 mM Natriumazid.</li>
		<li>Sofort die Agarose-Pad mit einem Deckglas abdecken. Achten Sie darauf, legen Sie das Deckglas vorsichtig ohne zu viel Druck, da diese Würmer platzen führen kann. Hinweis: OP50 Bakterien cDCFDA ¤ nzt fluoreszieren, wenn durch Mikroskopie visualisiert, daher ist es wichtig, die Würmer so gut wie möglich zu reinigen, bevor man sie auf die Agarose-Pad mit Natriumazid. Wenn mehr als 6 Sorten von C. Elegans (einschließlich N2, Wildtyp-Kontrolle) vorbereiten, ist es ratsam, zur Vorbereitung der Proben in Chargen von 6, um sicherzustellen, dass die Würmer auf dem Agarose-Pad nicht austrocknen. In einigen Stämmen beginnt die Vulva zu Bruch nach längere Zeit aufgrund des Drucks durch das Deckglas, so ist es wichtig, entsprechend zu planen.</li>
	</ol></li>
	<li>Konfokale Mikroskopie Hinweis: Einige Mikroskope haben eine eingebaute Funktion, die automatisch erhöht die Fluoreszenzintensität Ausgleich für Variable Ebenen der Fluoreszenz. Diese Mikroskope funktionieren möglicherweise nicht gut für imaging-Würmer gebeizt mit cDCFDA, da sie von Natur aus der Fluoreszenzintensität von Proben zu erhöhen.<ol>
<li>Führen Bildgebung auf einem standard confocal Mikroskop mit Erregung/Emission Wellenlängen eingestellt auf 488/530 nm für cDCFDA. Nehmen Sie einziges Flugzeug Bilder (nicht Z-Stapel) der Darm Lysosomen und verwenden Sie nur Lysosomen, die im Fokus (maximale Signalstärke) zur Quantifizierung der Intensität sind. Hinweis: Vielleicht wegen der Unterschiede in der Verfügbarkeit von Farbstoff, Lysosomen die Darmzellen direkt posterior, den Pharynx pflegen cDCFDA Färbung Intensität unabhängig von Genotyp oder Alter, daher sollte darauf geachtet werden, imaging Lysosomen in diesen Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>Bild der Folie, die 2 Tage alten Wildtyp, die N2 zuerst Würmer enthalten. Passen Sie dabei die konfokale bildgebenden Parameter wie Laserleistung, Lochkamera und Blende, um sicherzustellen, dass die cDCFDA Färbung Intensität nicht übersättigt ist. Hinweis: Sobald diese Einstellungen festgelegt sind, ändern sie für die gesamte Dauer der Bildgebung für diesen Tag.</li>
		<li>1024 x 1024 Pixel Aufnahmen von einer Ebene des Darmes (3 bis 4 Bilder pro Wurm) mit einem 60 X vergrößerungslinse. Hinweis: Das cDCFDA Emissionsspektrum Worms erbringt eine einzelne markante Gipfel bei 520 nm zeitgleich mit seiner gemeldeten Fluoreszenz Spektrum20, bietet eine spezifisches Signal-Anzeige, die sich vom Darm Autofluoreszenz (Abbildung 3) unterscheidet.</li>
		<li>Exportieren Sie konfokale Rohbild (.lsm Dateien) als TIFF-Dateien für jeden Kanal.</li>
		<li>Als nächstes öffnen Sie ImageJ und klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie , öffnen Sie die Bilddatei quantifiziert werden. Nachdem das Bild geladen wurde, verwenden Sie die ovale Form-Auswahl-Werkzeug in ImageJ, um einer Region of Interest (ROI) auszuwählen.</li>
		<li>Klicken Sie danach auf analysieren | Maßnahme , Fluoreszenzintensität für diese Rendite zu quantifizieren. Wählen Sie 4 – 5 verschiedene in-Fokus Lysosomen pro Bild und Berechnung der durchschnittlichen relativen Fluoreszenzintensität der jeweiligen Region of Interest (ROI).</li>
		<li>Für jedes Bild Messen der Fluoreszenzintensität Hintergrund in einer Region des Darms zwischen Lysosomen. Subtrahieren Sie die Hintergrundwerte Fluoreszenz Intensität von den lysosomalen Fluoreszenz-Intensität-Werten.</li>
		<li>Sammeln Sie insgesamt rund 30 bis 50 einzelne normalisierte Werte für cDCFDA Intensität (6 bis 10 Tiere) für jede Belastung getestet. Verwenden Sie diese Werte, um eine Box und Whisker Plot, die Verwendung von geeigneten statistischen Software zu zeichnen. Hinweis: Färbung kann abhängig von Faktoren wie Temperatur, Inkubationszeit und die allgemeine Gesundheit/Alter der Tiere unterschiedlich so dass Fluoreszenz Intensität Vergleiche nur Proben Prozess im gleichen Färbung Experiment relevant sind. Es ist daher wichtig, Kontrollen in jeder Färbung Experiment zu verarbeiten. Statistische Unterschiede berechnen (t-Tests) Verwendung von geeigneten statistischen Software.</li>
		<li>Bild alle Stämme aus dem gleichen Experiment (gebeizt am selben Tag) nacheinander, kümmert sich nicht um die bildgebenden Parameter ändern.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Eine Vielzahl von zellulären und molekularen Ereignissen trägt zum Altern, von Lebensgeschichte Merkmale und genetische Faktoren beeinflusst. Unsere aktuelle Studie22 legt nahe, dass die reproduktive Zyklus eine wichtige Rolle spielt bei der Kontrolle der Fitness von Soma durch die Regulierung der lysosomalen pH Dynamik. Wir zeigten, dass dieser lysosomalen vermittelte Proteolyse gefördert wird, während Tiere aktiv reproduzieren durch Hochregulation von V-ATPase Transkription, sorgt wiederum für s...

Das Erscheinungsbild von proteinaggregaten ist weithin anerkannt, zu einem Markenzeichen des Alterns in eukaryotischen Zellen1,2,3, und die Bildung von denen angenommen wird, unter den Fahrern Prinzip der zellulären Seneszenz4 , 5 , 6 , 7. es gibt zunehmend Beweise wie Alter Zellen, PROTEINKATABOLISMUS, führt zu einem Anstieg der Proteinaggregation vorliegt. Der Zusammenbruch der Proteolyse in alternden Zellen beinhaltet eine Beeinträchtigung der Autophagie8 sowie Proteasom-vermittelten Protein Degradation9. Schließlich wird irreversibel Protein Oxidation in alten Zellen erhöht Protein Katabolismus10weiter zu beeinträchtigen.
Autophagie wurde ursprünglich gedacht, um ein nicht-selektiven Verfahren zur Masse Abbau von beschädigten Proteinen, aber neuere Studien haben gezeigt, dass Autophagie ist sehr selektiv zu den Katabolismus von Protein-Aggregate und dysfunktionalen Organellen, die nicht Abbau über andere Protein-Clearance Mechanismen11zugänglich. Während des Prozesses der Autophagie sind beschädigt und aggregierte Proteine in einer Doppel-Membran Vesikel genannt die Autophagosome abgesondert. Dieser Autophagosome verschmilzt dann mit der sauren Organellen genannt Lysosomen, die führt zu einer Verschlechterung der Autophagosome Ladung12. Lysosomen repräsentieren den Endpunkt des selbstverdauende Weges und verschiedene zelluläre Prozesse wie Membran Reparatur, transcriptional Control und Nährstoff sensing beteiligt; Hervorhebung ihrer zentralen Rolle in zelluläre Homöostase (überarbeitet in Nr. 13). Mehrere Studien haben einen Zusammenhang zwischen einer altersabhängige Rückgang der lysosomalen Funktion und verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen13gezeigt. Konsequent, kann Wiederherstellung der lysosomalen Funktion in älteren Zellen alterungsbedingte Phänotypen14,15verzögern. Studien der Komposition des Intralumen Milieus deuten darauf hin, dass der Zusammenbruch der lysosomalen Funktion in älteren Zellen nicht durch einen Rückgang der Produktion von lysosomale Proteasen16. Alternativ wurde vorgeschlagen, dass Verlust der Intralysosomal Säure, eine entscheidende Voraussetzung für seine enzymatische Aktivität, den Rückgang der Lysosomen-vermittelten Proteolyse17zugrunde liegen kann. Um diese Hypothese zu erkunden zu können, ist es entscheidend für die Entwicklung von Reagenzien und Protokolle, dynamische Veränderung des lysosomalen pH-Wertes in lebenden Zellen in eine reproduzierbare und konsistente Weise zu erforschen.
Der Darm von C. Elegans ist das große metabolische Gewebe in Worms und es ist eine kritische Regulator des systemischen Homöostase und Lebensdauer. Haben wir Tests zur Beurteilung von Veränderungen in der Säure des Lumens der intestinalen Lysosomen von Worms um festzustellen, wie Lysosomen-vermittelten Proteolyse trägt zur Alterung. Wenn pH-Sensitive Fluorophore zuvor in C. Elegans verwendet wurden, um intestinale Lysosomen zu markieren, wurde es noch keinem bemühen, eine erfolgreiche Protokoll zu etablieren, die kleine Erhöhungen in lysosomalen pH-Wert in Vivo18. erkennen kann Hier bieten wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, um Verlust der lysosomalen Säure in die Darmzellen von C. Elegans zu erkennen, über eine einfache und bequeme Fütterung Protokoll, die einen pH-Sensitive Fluorophor (cDCFDA) enthält in OP50 Nahrung.

<table><tbody><tr><td>OP50 (E. coli)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Online bestellen bei https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-2',7'-dichlorfluoresceindiacetat&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Allgemein bekannt als cDCFDA</td></tr><tr><td>9-Diethamino-5H-benzo(a)phenoxazin-5-on und (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methyliden]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluor)bor</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Allgemein bekannt als Lysotracker Rotes</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop (z. B. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Kostenloser Download von https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Pulver ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>Fisher</td><td>Scientific S71604</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin Pulver</td><td>Sigma</td><td>C3045&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spiegel oder andere glatte flache Oberfläche</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beurteilung der lysosomalen alkalisierung in den darm von leben caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) ist ein Modell, das häufig verwendet wird, um Langlebigkeit und Entwicklungsstörungen Wege zu studieren. Solche Studien werden erleichtert durch die Transparenz des Tieres, die Fähigkeit, weiterleiten und umkehren, genetische Tests, die relative Leichtigkeit der Generierung von eindringmittel markierte Proteine und die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die entweder in den frühen mikroinjiziert werden können Embryo oder integriert in seine Nahrung (E. Coli -Stamm OP50) zellulare Organellen (z.B. 9-Diethylamino-5 H-Benzo (a) Phenoxazine-5-1 und (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) Methylidene]-2 H-Pyrrol-5-Yl-KappaN} - N - beschriften [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Hier präsentieren wir Ihnen die Verwendung von einem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff, der Darm Lysosomen Flecken bietet eine visuelle Auslesen der dynamischen, physiologische Veränderungen in lysosomalen Säure im Leben Würmer. Dieses Protokoll misst nicht lysosomale pH-Wert, sondern vielmehr soll eine zuverlässige Methode zur Beurteilung relevanten physiologischen Variationen in lysosomalen Säure. cDCFDA ist eine Zelle-permeationsfähigen Substanz, die in den fluoreszierenden Fluorophor 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) nach Hydrolyse von intrazellulären Esterasen umgewandelt wird. Protonierung in Lysosomen fallen cDCF in diese Organellen, wo es sich ansammelt. Aufgrund seiner niedrigen pKa von 4,8 wurde dieser Farbstoff als pH-Sensor in der Hefe verwendet. Hier beschreiben wir die Verwendung von cDCFDA als Nahrungsergänzungsmittel zu beurteilen, den Säuregehalt des intestinalen Lysosomen in C. Elegans. Diese Technik ermöglicht die Erkennung von alkalisierenden Lysosomen mit lebenden Tieren, und hat ein breites Anwendungsspektrum experimentelle Studien über das Altern, Autophagie und lysosomale Biogenese einschließlich.

cDCFDA Flecken Lysosomen in einem pH-abhängigen Weise, und seine niedrige pKa und bereit Aufnahme in Lysosomen macht es eine ideale pH-Sensor-21. cDCFDA Färbung Intensität ist umgekehrt proportional zur lysosomalen pH-Wert (d. h. Färbung Intensität erhöht als pH-Wert sinkt)18,22. cDCFDA Signale sind durchweg schwach in Lysosomen von Tieren behandelt mit 20 mM von Chloroquin, ein Inhibitor der lysos...

Eine schrittweise Anleitung zum Verlust der lysosomalen Säure im Darm von C. Elegans mit der pH-Sensitive vital Farbstoff 6 - Carboxy - 2', 7'-dichlorofluoresceins Diacetat (cDCFDA) Sonde

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen relativen Verlust an lysosomaler Säure in den intestinalen Lysosomen von C.elegans zu beurteilen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Autophagie zu beantworten, indem sie indirekt Informationen über die lysosomale Funktion und den Proteinabbau liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach, kostengünstig, bequem und reproduzierbar ist.Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir beobachteten, wie die Färbetechnik zur Beurteilung der vakuolären Alkalisierung in Hefe eingesetzt wird. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da bestimmte Schritte, wie z. B. die Zugabe von cDCFDA zu OP50-Lebensmitteln und die bildgebende Kontrolle von zwei Tage alten Wildtyp-Würmern, von entscheidender Bedeutung sind. Lassen Sie die Platten nach der Vorbereitung der NGM-Platten zwei Tage lang bei geschlossenem Deckel bei Raumtemperatur trocknen.Dann inokulieren Sie die OP50-Bakterien in der sterilen Luria-Brühe. Lassen Sie das Impfmittel nach der Impfung im Inkubator, bis der OD zwischen 0,2 und 0,4 liegt. Geben Sie dann einen Tropfen des OP50-Impfmittels in die Mitte der trockenen NGM-Platte.Verwenden Sie dann einen Spreizer, um das Impfmittel in einem Fleck von etwa zwei mal zwei Zentimetern zu verteilen. Drehen Sie die OP50-Platte etwa nach 15 Minuten um, nachdem das Impfmittel ausgetrocknet ist. Inkubieren Sie die Platte dann 36 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.Sobald die Inkubation beendet ist, übertragen Sie die Platte bei vier Grad Celsius, bis sie verwendet wird. Bereiten Sie dann einen Arbeitsbestand von 10 Millimolar cDCFDA in M9-Puffer vor. Lagern Sie die cDCFDA-Lösung lichtgeschützt bei minus 20 Grad Celsius.Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter 10 millimolare cDCFDA, um das gesamte OP50-Pflaster gleichmäßig auf der Platte abzudecken. Lassen Sie die cDCFDA-Platten in einer dunklen Box etwa 30 Minuten lang auf der Arbeitsplatte. Nachdem die cDCFDA das OP50-Pflaster vollständig durchdrungen hat, übertragen Sie 20 Würmer auf die Platte und lassen Sie die Platte dann etwa 14 Stunden lang bei 20 Grad Celsius in umgekehrtem Zustand.Nehmen Sie als Nächstes zwei Streifen Beschriftungsbänder und legen Sie sie im Abstand von 1,5 Zoll auf eine glatte, ebene Spiegelfläche. Bestreichen Sie dann die Oberfläche des Spiegels mit wasserabweisendem Spray und entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit. Als nächstes schmelzen Sie 2%Agarose in destilliertem Wasser in der Mikrowelle.Nachdem sich die Agarose verflüssigt hat, geben Sie einen Tropfen Agarose zwischen die beiden Streifen der Bänder und bedecken Sie den Tropfen mit dem Objektträger. Nachdem sich die Agarose in Form eines kreisförmigen Polsters unter der Folie verfestigt hat, drehen Sie die Folie um. Geben Sie dann 10 bis 15 Mikroliter fünf Millimolare Natriumazid auf das Agarose-Pad.Übertragen Sie nun die Würmer von der cDCFDA-ergänzten Platte auf eine saubere NGM-Platte ohne OP50. Lassen Sie die Würmer einige Sekunden lang wandern, bis der OP50 von ihrer Oberfläche entfernt wird. Übertragen Sie dann den Wurm auf das Agarose-Pad, das fünf Millimolare Natriumazid enthält.Decken Sie das Agarose-Pad schnell mit einem Deckglas ab. Verwenden Sie als Nächstes ein Objektiv mit 60-facher Vergrößerung und nehmen Sie Bilder in einer einzigen Ebene des Darms von zwei Tage alten Wildtyp- und mutierten Würmern auf. Öffnen Sie dann ImageJ und klicken Sie auf die Datei.Klicken Sie dann auf Öffnen, um die Datei zu öffnen, die quantifiziert werden muss. Nachdem das Bild geladen wurde, verwenden Sie das ovale Auswahlwerkzeug, um den interessierenden Bereich auszuwählen. Klicken Sie dann auf Analysieren und schließlich auf Messen, um die Fluoreszenzintensität des interessierenden Bereichs zu quantifizieren.Um die lysosomale funktionelle Aktivität zu untersuchen, wird die cDCFDA-Färbeintensität mittels konfokaler Bildgebung quantifiziert. In diesem Bild zeigt sich eine robuste cDCFDA-Fluoreszenzsignalintensität in den intestinalen Lysosomen von Wildtyp-C.Elegans am zweiten Tag. Dies deutet auf ein funktionell kompetentes saures Lysosom hin.Im Gegenteil, die Fluoreszenzintensität ist in den intestinalen Lysosomen von Wildtyp-Würmern am achten Tag deutlich unterdrückt. Dies ist im Vergleich zu den Darmlysosomen von Würmern am zweiten Tag. Das Ergebnis deutete auf das Vorhandensein von funktionell inkompetentem alkalischem Lysosom bei alten Würmern am achten Tag hin.Interessanterweise ist die Intensität der cDCFDA-Fluoreszenz im Vergleich zum Wildtyp-Wurm sowohl bei den RNAi-Würmern am zweiten Tag als auch bei acht alten RNAi-Würmern deutlich reduziert. Hier wurde das vha-Gen, das für die vakuolären ATPase-Untereinheiten in der lysosomalen Auskleidung kodiert, bei den alten Würmern am zweiten und achten Tag ausgeschaltet. Einmal gemeistert, kann dieses gesamte Färbe- und Mikroskopieprogramm in weniger als 18 Stunden abgeschlossen werden, wenn es richtig durchgeführt wird.Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Würmer in cDCFDA-Ergänzungsmitteln in OP50-Lebensmitteln mindestens 14 Stunden lang zu inkubieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Verlust der lysosomalen Säure in den Darmlysosomen von lebenden C.elegans beurteilen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Quelle: Le, T. A. N. et al., Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert einen fluoreszenzbasierten Test zur Quantifizierung der Darmpermeabilität von C. elegans, der Pseudomonas aeruginosa ausgesetzt ist. Im Vergleich zu Kontrollen, die mit Escherichia coli gefüttert wurden, zeigen pathogen-behandelte Würmer eine erhöhte Fluorophor-Leckage in die Körperhöhle, was auf Schäden an der...

Beurteilung der Darmpermeabilität bei C. elegans nach bakterieller Exposition

Dieses Video beschreibt einen kolorimetrischen Assay zur Laktatmessung in Zelllysaten unter Verwendung des Enzyms Laktatdehydrogenase. Dieses Enzym wandelt Laktat in Pyruvat um, zusammen mit der Umwandlung von NAD in NADH, das mit Tetrazoliumfarbstoffen reagiert und ein farbiges Produkt ergibt, das spektrophotometrisch gemessen werden kann, um das Laktat zu quantifizieren.

Kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung von Laktat in Testproben

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Um die Beziehung zwischen Proteinhomöostase, Stress und Alterung zu untersuchen, haben wir Veränderungen in der Proteinfaltung beobachtet, indem wir die Proteindysfunktion, die Proteinlokalisierung in der Zelle und die Proteinstabilität auf organismischer, zellulärer und Proteinebene verfolgt haben, wobei wir das genetisch manipulierbare Metazoon Caenorhabditis elegans als Modellsystem verwendet haben.

Verwendung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Untersuchung der Proteinhomöostase in einem mehrzelligen Organismus

Die transparente C. Elegans Darm kann als eine"in-Vivo Gewebe Kammer" für das Studium Apicobasal Membran und Lumen Biogenese einzellige und subzellulärer Ebene bei mehrzelligen Tubulogenesis dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Standardbeschriftung kombinieren, Verlust der Funktion genetische/RNAi und mikroskopische Ansätze, diese Prozesse auf molekularer Ebene zu zergliedern.

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Der C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanal ist ein einzigartiges einzellige Modell für die optische in-Vivo -Analyse der de Novo polarisiert Membran Biogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine Kombination aus standard genetische/RNAi und imaging-Ansätze, zur Identifizierung und Charakterisierung von Molekülen Regie einzelligen Tubulogenesis und apikale Membran und Lumen Biogenese anpassungsfähig.

C. Elegans Excretory Kanal als Modell für die intrazelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis in einer einzelnen Zelle: Kennzeichnung von GFP-Fusionen, RNAi Interaktion Bildschirm und Imaging

Wir beschreiben eine modifizierte kleine Extraktion und Farbmetrische Assays von Laktat und Pyruvat in die Nematoden C. Elegans. Bei der Verwendung von kommerziellen Assay Kits ist die technische Entwicklung ihrer Empfindlichkeit und Genauigkeit wichtig. Proteinfällung Extraktion ist der wichtigste Schritt zur quantitativen Bestimmung von intrazellulären Metaboliten.

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegansgemessen wird. Diese Methode ist hilfreich für die biologische Grundlagenforschung zur Darmgesundheit im Zusammenhang mit der Wechselwirkung zwischen Darmbakterien und ihrem Wirt und für das Screening, um probiotische und chemische Wirkstoffe zu identifizieren, um leckartigedarme Syndrome und entzündliche Darmerkrankungen zu heilen.

Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans

Der proteostatische Rückgang ist ein Kennzeichen des Alterns und erleichtert das Auftreten neurodegenerativer Erkrankungen. Wir skizzieren ein Protokoll zur quantifizierbaren Messung der Proteostase in zwei verschiedenen Caenorhabditis elegans-Geweben durch heterologe Expression von Polyglutamin-Wiederholungen, die mit einem fluoreszierenden Reporter verschmolzen sind. Dieses Modell ermöglicht eine schnelle genetische In-vivo-Analyse der Proteostase.

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

Die stimulierte Raman-Streumikroskopie (SRS) ermöglicht eine selektive, markierungsfreie Abbildung bestimmter chemischer Bestandteile und wurde effektiv zur Abbildung von Lipidmolekülen in vivo eingesetzt. Hier geben wir eine kurze Einführung in das Prinzip der SRS-Mikroskopie und beschreiben Methoden zu deren Einsatz bei der bildgebenden Lipidspeicherung bei Caenorhabditis elegans.

Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Der Unterricht in den Biowissenschaften kann für die Studierenden durch Experimente anregender gestaltet werden. Dieses Manuskript stellt zwei verschiedene, aber sich ergänzende Protokolle vor, die im Unterricht verwendet werden können, um die Schüler zu ermutigen, Hypothesen in Bezug auf kalorienreiche Ernährung, Hunger und Altern zu formulieren und zu testen.

Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie, wie Sie lysosomale Alkalisierung im Darm von lebenden Caenorhabditis elegans mit dem pH-sensitiven Farbstoff cDCFDA bewerten. Diese einfache Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der Autophagieforschung.

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

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