Name: Analyse der Mineralien von hFOB 1.19 produziert und Saos-2 Zellen mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Mineralisierungsprofilen in menschlichen Knochenzelllinien hFOB 1.19 und Saos-2 mittels Transmissionselektronenmikroskopie und energiedispersiver Röntgenmikroanalyse.

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MK und ASK manuelle Operationen durchgeführt und LB Zeichnungen vorbereitet und den Film gemacht. ASK schrieb das Manuskript LB schrieb das Drehbuch und MK vorbereitet in der Tabelle. SM, RB und SP lesen kritisch der Tabelle, die Schrift und das Manuskript. Die Autoren möchte Hanna Chomontowska für ihre hervorragende Unterstützung mit ultramicrotomy und Szymon Suski sowie Henryk Bilski für ihre hervorragende Unterstützung mit TEM-EDX-Analyse danken. Die Autoren möchte Dr. Patrick Groves für professionelle Englisch Korrektur und Barbara Sobiak zur Erfassung der Anweisungen zu danken.
Diese Arbeit wurde von Grant N N401 140639 aus dem polnischen Ministerium für Wissenschaft und Hochschulwesen, ASK, durch Zuschüsse aus dem National Science Centre, Polen 2016/23/N/NZ4/03313 LB und 2016/23/N/NZ1/02449, MK, EU FP7 Projekt BIOIMAGINE unterstützt. : BIO-IMAGing in Forschung, INnovation und Bildung, GA Nr. 264173, und durch die gesetzlichen Mittel von der Nencki Instituts für Experimentelle Biologie, Polnische Akademie der Wissenschaften.

(1) Zell-Kultur und Behandlung
<ol><li>Setzen Sie alle notwendigen Materialien unter der Laminar-Flow-Haube und unter UV-Licht zu sterilisieren. Die Nährmedien sind: eine 1:1 Mischung von Schinken ist F12 und DMEM Medien mit 2,5 mM L-Glutamin ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin, 0,3 mg/mL G418 und 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) (V/V) für menschlichen Fötus hFOB 1.19 SV40 große T Antigen transfiziert Osteoblasten und McCoys 5A Medium mit 1,5 mM L-Glutamin ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 U/mL Streptomycin und 15 % FBS (V/V) für menschlichen Osteosarkom Saos-2 Zellen.</li>
	<li>Kultur hFOB 1.19 bei 34 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 und Saos-2 Zellen bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2. Zellkulturen, entweder hFOB 1.19 oder Saos-2 Zellen aus dem Inkubator, der Laminar-Flow-Haube zu übertragen und das Medium 10 ml frisches Kulturmedium mit FBS verändern.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen ohne Stimulatoren (ruhende Zellen) oder stimulieren sie mit 50 µg/mL Ascorbinsäure (AA) gefolgt von 7,5 mM β-Glycerophosphat (β-GP), früher in Reinstwasser aufbereitet und durch 0,22 µm Spritze Filter gefiltert. Fügen Sie die Stimulatoren aus Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen auf die Oberfläche des Kulturmediums. Vorsichtig rühren Sie der Kulturschale und inkubieren Sie für 7 Tage.</li>
</ol>2. Nachweis von Mineralien Calcium
<ol><li>Waschen Sie die Zellkulturen mit Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,0).</li>
	<li>Geben Sie 5 mL 2 % (G:100 mL) AR-S mit PBS-Puffer, pH 5,0 und inkubieren Sie die Platten für 30 min, die Mineralien zu beflecken.</li>
	<li>Waschen Sie 3 Mal mit PBS. Vorsichtig die Schale Wand PBS hinzu, versuchen Sie nicht, die Mineralien zu zerstören.</li>
	<li>Beobachten Sie Kalzium-Mineralien unter einem invertierten Lichtmikroskop und nehmen Sie Bilder.</li>
</ol>(3) Visualisierung der Sonden unter UV-Licht
<ol><li>Für Zelle Lysates behandeln Sie Zellkulturen, entweder ruhen oder angeregt für 7 Tage nach der Kollagenase Verdauung Protokoll24.</li>
	<li>Sammeln Sie das Medium aus Zellkulturen und waschen Sie die Zellen mit PBS.</li>
	<li>Die Zellen mit 3 mL 500 U/mL Kollagenase in einer Lösung von 0,25 M Saccharose, 0,12 M NaCl 0,01 M KCl und 0,02 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,45, bei 37 ° C für 3 h zu verdauen.</li>
	<li>Mechanisch kratzen Sie die Zellen, auf Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen übertragen Sie, und geben sie 10-Mal durch eine 1 mL 40 U Spritze mit 0,5 × 16 Nadel.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 500 × g für 5 min.</li>
	<li>Den überstand verwerfen und Aussetzen der Zelle Pellet in 500 µL des synthetischen Knorpel Lymphe (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM Nahco33, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-Glucose, Saccharose 63 mM, 16,5 mM Hepes, pH 7.4).</li>
	<li>Hydroxylapatit (HA), Fluorapatit (FA) und Chlorapatite (CA) Pulver aus den Flaschen auf dem UV-Transilluminator mit einem Spatel zu übertragen und als Steuerelemente verwenden.</li>
	<li>Die Zelle Lysates aus Kunststoffrohren mit Kunststoff-Tipps und sorgfältig auf die UV-Transilluminator.</li>
	<li>Bilder unter sichtbar und UV-Licht zu nehmen.</li>
</ol>4. Vorbereitung von Proben für TEM-EDX
<ol><li>Vorbereitung von Mineralien für negative Färbung<ol>
<li>Synthetisch hergestellte HA, CA und FA Mineralien25 2,5 mg in 500 µL deionisiertes Wasser auszusetzen und Inkubation bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 für 1 h.</li>
		<li>Antistatische Pinzetten nehmen Sie Formvar/Carbon 300 Mesh Ni Raster aus der Box mit, auf eine Porzellan-Multi-well-Platte und fallen Sie 10 µL HA, CA und FA Suspensionen auf den Gittern.</li>
		<li>Trocknen Sie die Proben für 30 min. bei Zimmertemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung des Ausruhens und stimuliert die Zellen für die Einbettung von 26<ol>
<li>Sammeln Sie Medium aus der Zellkulturen zu und waschen Sie die Zellen mit physiologischen Desensibilisierung (PD) Medium (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM Nahco33, 1 mM KH2PO4, 10 mM Glukose, 20 mM HEPES, pH 7.4).</li>
		<li>Befestigen Sie die Zellen mit 5 mL einer Mischung von 3 % (G:100 mL) paraformaldehyde/1% (G:100 mL) Glutaraldehyd in 100 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7,2, 1 h bei Raumtemperatur unter dem Abzug.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit 5 mL 100 mM Natriumphosphat Puffer und entfernen Sie vorsichtig den Puffer nach dem Waschen.</li>
		<li>In den dunklen Raum postfix die Proben mit 2 mL von 1 % (G:100 mL) Osmium ausgefällt in 100 mM Natrium Phosphatpuffer pH 7,2, für 20 min bei Raumtemperatur unter dem Abzug.</li>
		<li>Entfernen Sie Osmium ausgefällt und nutzen Sie es.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit 5 mL 100 mM Natriumphosphat Puffer.</li>
		<li>Dann pausiert die Proben in 5 mL Aliquots einer abgestuften Ethanol-Lösung-Serie bei Raumtemperatur: 25 % (Vol.) für 5 min, 50 % (Vol.-%) für 10 min, 75 % (Vol.-%) für 15 min, 90 % (Vol.-%) für 20 Minuten. Schließlich verwenden Sie absolute Ethanol zweimal und inkubieren Sie für 30 min. und 12 h.</li>
		<li>Mechanisch kratzen Sie die Zellen aus dem Kunststoff Petrischalen Kultur, in Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen sammeln Sie und Zentrifugieren Sie die Proben bei 130 X g für 1 min.</li>
		<li>Entfernen Sie die Überstände und hängen Sie die Zellen in 1 mL einer Mischung aus LR White Harz und absoluten Ethanol ein Volumenverhältnis von 1:2.</li>
		<li>Den Inhalt der Glasröhren vor Gebrauch gut mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 130 X g für 1 min.</li>
		<li>Entfernen Sie die Überstände und wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit 1 mL einer 1:1 Mischung von LR White Harz und absoluten Ethanol.</li>
		<li>Gut mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 130 X g für 1 min.</li>
		<li>Entfernen Sie die Überstände.</li>
		<li>Schließlich, zweimal den Proben 1 mL reines LR White Harz hinzugefügt und inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur in Kunststoffrohren.</li>
		<li>Legen Sie 500 µL jeder Probe in Gelatinekapseln. Hinweis: Die Proben sind beschriftet mit ein kleines Blatt Papier und einen Stift, damit das Harz nicht die Etiketten zerstört.</li>
		<li>Schließen Sie die Gelatinekapseln, in Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen umzusetzen und Zentrifugieren bei 130 X g für 1 min in ein Ausschwenkbares Rotor.</li>
		<li>Entfernen Sie die Kapseln aus Kunststoff-Rohre mit Hilfe einer Vakuumpumpe.</li>
		<li>Bewegen Sie die Proben in den Ofen und bei 56 ° C für 48 h polymerisieren.</li>
		<li>Bereiten Sie die Blöcke durch Montage in die Halterung und Zuschneiden auf die Pyramide.</li>
		<li>Den Inhaber in der regungsloses, befestigen Sie das Diamond Ultra 45° Messer und mit entionisiertem Wasser füllen; Denken Sie daran, die Klinge aus zufälligen Luftblasen zu reinigen.</li>
		<li>Dann schneiden Sie Abschnitte (700 Å) mit dem Diamant-Messer auf die deionisiertes Wasserbad.</li>
		<li>Legen Sie die Reste mit bovine Wimpern und Ort, wo sie auf die glänzende Seite des Formvar/Carbon 300 mesh Ni Raster und trocknen.</li>
		<li>Bereiten Sie 2,5 % (Vol.-%) Uranyl Acetat in absoluten Ethanol im Dunkeln unter einer Abzugshaube. Halten Sie das Uranyl-Acetat in einem Lead-Container und erinnere mich nicht, das Sediment abholen.</li>
		<li>In den dunklen Raum counterstain die Netze der synthetischen Apatite und Zellproben mit 2,5 % (Vol.-%) Uranyl Acetat in Ethanol für 20 min bei Raumtemperatur unter dem Abzug.</li>
		<li>Die Raster in 50 % igem Ethanol (Vol.-%), dann in entionisiertem Wasser waschen und Trocknen bei Raumtemperatur für 24 h. Schließlich legte die Gitter in das Feld ein.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) TEM-EDX-Analyse
<ol><li>TEM Bildgebung durch ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) ausgestattet mit Vollsortiment Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse (EDX) System und 11-Megapixel-Kamera<ol>
<li>Bereiten Sie einen Beryllium-Halter für die Beobachtung von Mineralien und Zellen. Verwenden Sie antistatische Werkzeuge.</li>
		<li>Entfernen Sie die beiden Schrauben und heben Sie die Beryllium-Platte und Beryllium Scheibe Weg vom Rest der Halterung.</li>
		<li>Raster, glänzende Seite oben, an der Halterung anbringen.</li>
		<li>Setzen Sie die Beryllium Waschmaschine und Beryllium Platte vorsichtig und Schrauben Sie die Befestigungsschrauben fest.</li>
		<li>Setzen Sie den Halter in die Vakuumkammer und schalten Sie die Vakuumpumpe.</li>
		<li>Sobald ein Vakuum erreicht ist, sanft legen Sie den Halter in der bildgebenden Kammer und schalten Sie den Strahl.</li>
		<li>Stellen Sie auf dem fluoreszierenden Monitor die Blende-Parameter des Mikroskops. Durchführen Sie Astigmatismus Bildkorrektur; Stellen Sie den Zoom, Fokus und Rahmen; und nehmen TEM Bilder bei einer Vergrößerung von 50, 000 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>STEM Bildgebung und Röntgen-Mikroanalyse für die Spektral und kompositorische Analyse<ol>
<li>Der Scan Elektronenmikroskopie (STEM) bildgebende transmissionskammer Energy dispersive x-ray (EDX) Detektor einfügen.</li>
		<li>Stellen Sie die Schärfe des Bildes in den Fokus-Modus.</li>
		<li>Nehmen Sie Stamm Bilder bei einer Vergrößerung von 15, 000 X.</li>
		<li>Wählen Sie einen Punkt in der Probe für die Röntgen-Mikroanalyse und sammeln Sie Spektren zu.</li>
		<li>Daten zu erhalten, durch die Zusammenfassung aller Atomgewichte für alle Elemente des Periodensystems in der Probe (als 100 %) und den Inhalt der ausgewählten Elemente anzeigt: Ca, Cl, F und P (als Atom-%). Berechnen Sie das Verhältnis von Ca, F oder Cl p für jede Probe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ionen-Zuordnung<ol>
<li>Wählen Sie Elemente wie Calcium, Fluor, Chlor und Phosphor Ionen-Mapping und durchführen EDX-Karten der ausgewählten Elemente in den Proben.</li>
		<li>Daten zu erhalten, indem Sie die Lokalisierung der analysierten Elemente angeben: Ca, Cl, F und P (als Atom-%) und die Co Lokalisierung (in %) von Ca, F oder Cl mit P für jede Probe zu berechnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenskonflikt.

In der aktuellen Zeitung beschrieben wir die Protokolle für AR-S Färbung, UV Licht Identifizierung von Fluorapatit und TEM-EDX in Vitro Imaging von MVs durch Mineralisierung Zellen freigesetzt und Mineralien produziert von MVs. Es ist möglich, alle Methoden, die oben genannten folgen einige allgemeine Schritte zur Problembehandlung. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten mehrere kritische Schritte sorgfältig durchgeführt werden. Erstens ist es besser, hinzuzufügen, dass AA (das saure) gefolgt von β...

Knochen ist eine Art von Bindegewebe besteht aus zwei Teilen: Bio (Zellen und Kollagenfasern) und Mineralien (Calcium und Phosphat-Verbindungen). Die mineralischen Hauptbestandteile in den Knochen sind Apatite1. Verschiedene Arten von Mineralisierung-kompetente Zellen in Knochen (Osteoblasten), Zähne (Odontoblasts) und im Knorpel (Chondrozyten) regulieren die ersten Schritte der Mineralisierung durch Produktion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) und loslassen matrix Vesikel (MVs) (Abbildung 1). MVs sind 100-300 nm Durchmesser Vesikel, die Calcium- und Phosphatspiegel, die Erleichterung der Apatit Keimbildung zu sammeln und anschließend binden an Kollagen2,3. Dann zerfallen MVs Apatite auf das extrazelluläre Medium lösen. Die Apatite weiterhin in Kontakt mit Kollagenfasern wachsen und bilden der Knochenmatrix. Die Mineralisierung wird durch die konstante Versorgung mit Pich und Ca2 + im extrazellulären Medium getragen. Einige kürzlich veröffentlichten Daten unterstützen unsere Modell-4,-5. Weichteile nicht unter physiologischen Bedingungen mineralisieren. Ektopische Verkalkung kann jedoch unter pathologischen Bedingungen wie Gefäßverkalkung3auftreten. Vaskuläre Zellen, die Osteoblasten Phänotyp erwerben können MVs produzieren, die Keimbildung von Apatite zu induzieren und Mineralisierung in den medialen und Intima Schichten der Wand der Blutgefäße zu initiieren. Seit ektopische Verkalkung ähneln normalen Endochondral Mineralisierung3, Verständnis der molekularen Mechanismen der Mineralisierung der Knochen Zellen und Chondrozyten sollen einige Hinweise auf ektopische Verkalkung der Weichteile, die gebildet.
Die Entwicklung des skelettartigen Gewebe wird durch verschiedene Enzyme, Wachstumsfaktoren und Promotoren oder Inhibitoren der Mineralisierung geregelt. Die Antagonistische Wirkung der Gewebe-unspezifische alkalische Phosphatase (TNAP) (Abbildung 1) und Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase kontrolliert ich (NPP1), zusammen mit Ankyrin (ANK), anorganisches Pyrophosphat (PPich) Konzentration 6. PPich, ein potenter Inhibitor der HA-Formation ist hydrolysiert durch TNAP; NPP1 hydrolysiert Nukleotid Triphosphate um PPich zu bilden, während ANK PPich in das ECM aus der Zelle exportiert. Das Verhältnis von Pi/PPi kann Apatit Bildung7,8 mit möglichen pathologischen folgen9regulieren.
Die MV-Membran ist in Ionen-Transport-Proteine angereichert, die die erste Ausfällung von Kalzium und Phosphat im Inneren der MVs bei der Keimbildung (Abbildung 1) zu erleichtern. Die Phosphat-Transporter 1 (PiT) hilft, um Pich erzeugt im Perivesicular Raum in der MVs10,11zu integrieren. Polymerasen können beteiligt sein, in die Bindung und den Transport von Ca2 + und in den biophysikalischen Prozess, der Mineralisierung in der MV Lumen12,13initiiert. Wir favorisieren die Hypothese vorgeschlagen, für die Mineralisierung innerhalb Intrazytoplasmatische Vesikel des internen Keimbildung von Apatit innerhalb der MV vor ihrer Ausbreitung in der ECM-14,-15. In-vitro- Modellierung bestätigt die Induktion von Ca2 +/ pich komplexe Bildung in Proteoliposomes aus PS und AnxA516hergestellt. Dies kann darauf hindeuten, dass Akkumulation von Ca2 +, Pich, AnxA5 und PS-komplexe in Lipid Rafts der Mikrovilli-wie Membranesrepresent der Keimbildung Kern (NC) Apatit innerhalb MVs. Polymerasen und TNAP besitzen auch Kollagen-Bindung Kapazitäten, die möglicherweise hilfreich bei der Platzierung von MVs entlang Kollagenfasern und bei der Förderung der Ausbreitung von Mineralisierung in der ECM. Fetuin-A und Osteopontin (OPN)17, sind bekannt als Inhibitoren der Apatit-Formation, die die Ausbreitung der Mineralisierung auf dem kollagenen Gerüst verlangsamen kann. Keimbildung und Vermehrung sind unterschiedliche Veranstaltungen, erstere vor dem letzteren, und sowohl für den Prozess der pathologischen Mineralisierung relevant sein können.
Um herauszufinden, wie die Chemie des Calcium-Phosphat-komplexen physiologischen Mineralisierung und ektopische Verkalkung ändern kann, ist es notwendig, die Mineralien produziert von Zellen zu identifizieren. Apatite sind eine Gruppe von Kalzium und Phosphat enthalten Mineralien mit dem allgemeinen Kristall Zelle Formel Ca10(PO4)6X2, wobei X = Cl, F, OH. Sie gelten als18folgt: Fluorapatit (FA) Ca10(PO4)6F2, Chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 und Hydroxylapatit (HA) Ca10(PO4 ),6(OH)2.
Die Wahl der Osteoblasten Zelllinien induzieren MINERALBILDUNG ist entscheidend, denn jede Zelllinie ein klares Profil der Mineralisierung zeigt. In diesem Bericht verglichen wir die Keimbildung der Mineralien von zwei ausgewählten menschlichen zellmodelle Mineralisierung: osteoblastischen hFOB 1.19 und Osteosarkom Saos-2 Zellen. Osteosarkom-abgeleitete Zellen werden häufig als osteoblastischen Modelle verwendet und Saos-2 Zellen haben die reifsten osteoblastischen Charakter19 beibehalten, während undifferenzierte menschlichen fetalen hFOB Zellen häufig als Modell für normale osteoblastischen verwendet werden Differenzierung-20. Ihre Mineralisierung Profile wurden mit verschiedenen Methoden analysiert: Alizarin rot-S (AR-S) Färbung, ultravioletten (UV) Licht Visualisierung Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung, Energy dispersive x-ray Mikroanalyse (EDX) Quantifizierung und Ion Mapping. Der Vorteil von TEM-EDX über alternative Techniken verwendet in früheren Studien ist, dass es quantitative und qualitative Ergebnisse der Ionen-Austausch in Apatit Kristalle4,5,21 gibt. Das übergeordnete Ziel der Verwendung von TEM-EDX war, eine einfache Methode für Bildgebung und Quantifizierung der Verteilung von Ca, F und Cl-Ionen in verschiedenen Mineralien aus verschiedenen Arten von Zellen während der Phasen des Prozesses Mineralisierung zu finden. Diese Methode erfolgreich, zum Beispiel dient zur Überwachung der Wechselwirkung von Zink-Nanopartikel mit verschiedenen Chemikalien und ihre kombinierte Wirkung auf Wasserorganismen22. In einer weiteren Studie, ein Kupfer Photocatalyst auf Titan-Materialien in wässriger Lösung ausführlich zeichnete sich durch optische emissionsspektrometrie induktiv gekoppelte Plasma (ICP-OES), N2 Physisorption (BET), XRD, UV-Vis-DRS, FT-IR, Raman Spektroskopie, TEM-EDX und photoelektrochemische Messungen23. Unser Ziel war es, die Herkunft und Eigenschaften der Vesikel und Mineralien in beiden Zelllinien, den Mechanismus zu verstehen, der Mineralisierung im knöchernen Differenzierung steuert zu vergleichen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57423/57423fig1.jpg"> Abbildung 1 . Schema der ersten Schritte der Mineralisierung im knöchernen Zellen mit der Synthese von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) und Freisetzung von Matrix Vesikel (MVs) aus der Membran. MVs akkumulieren Kalzium durch die Einwirkung von Kalzium-bindende Proteine, Polymerasen und Phosphat, durch das Wirken des ein anorganisches Phosphat-Transporter (PiT) gefolgt von der Aktivität der Gewebe-unspezifische alkalische Phosphatase (TNAP), dem dephosphorylates PPich Pich, wodurch Apatit Keimbildung. Dann MVs zerfallen und freigeben Apatite auf das extrazelluläre Medium. Die Mineralisierung wird durch die konstante Versorgung mit Pich und Ca2 + in der extrazellulären mittlere4,5getragen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57423/57423fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>Reagenz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ham' s DMEM/F12 Mediengemisch</td><td>PAA</td><td>E15-813</td><td>1:1, für humane Fötus hFOB 1.19 SV40 große T-Antigen transfizierte Osteoblasten (ATCC CRL-11372)</td></tr><tr><td>McCoy' s 5A Medium</td><td>PAA</td><td>E82312-0025</td><td>für humane Osteosarkom-Saos-2-Zellen (ATCC HTB-85)</td></tr><tr><td>Antibiotika-Gemisch (Penicillin/Streptomycin)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td>je 100 U/ml</td></tr><tr><td>G-418</td><td>Sigma</td><td>68168</td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>10% für hFOB 1,19 und 15% für Saos-2</td></tr><tr><td>AA</td><td>Sigma</td><td>A-5960</td><td>50 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>&szlig;-GP</td><td>Sigma</td><td>G9422-100G</td><td>7,5 mM</td></tr><tr><td>Bio-Gel HTP Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>130-0420</td><td>für HA</td></tr><tr><td>FA</td><td></td><td></td><td>von uns synthetisiert</td></tr><tr>CA <td>von uns synthetisiert</td><td>Natriumphosphatpuffer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4/NaH2PO4 Mischung</td><td>Sigma</td><td>S7907/S8282</td><td>0,1 M, pH 7,2</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7,0, hergestellt von uns</td></tr><tr><td>AR-S in PBS</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>0,5 g/100 mL, pH 5,0</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IA</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>500 U/mL</td></tr><tr><td>SCL Puffer</td><td></td><td></td><td>von uns hergestellt</td></tr><tr><td>Deionisiertes Wasser</td><td></td><td></td><td>von uns</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>POCh</td><td>BA6480111</td><td>absolut 99,8% und Lösungen 25, 50, 75, 90%</td></tr> <tr><td>Uranylacetat in 50% Ethanol</td><td>Polysciences Inc.</td><td>21447-25</td><td>0,25 g/10 mL</td></tr><tr><td>PD Medium</td><td></td><td></td><td>pH 7,4, hergestellt von uns</td></tr><tr><td>Fixiermischung (Paraformaldehyd/Glutaraldehyd)</td><td>Sigma</td><td>158127/G-6257</td><td>3%:1%</td></tr><tr><td>Nachfixierung OsO4</td><td>Sigma</td><td>75633</td><td>1%</td></tr><tr><td>LR Weißes Harz in Ethanol</td><td>Polysciences Inc.</td><td>17411-MUNC 500g</td><td>1:2, 1:1, 100%</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>CHEMPUR</td><td>111024800</td><td>rein</td></tr><tr><td><stark>Werkzeug</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen</td><td>Corning Inc.</td><td>430487</td><td>1,2 mL</td></tr><tr><td>Petrikulturschalen aus Kunststoff</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Kunststoffröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352096 und 352070</td> Serologische Pipetten <td>15 und 50 mL</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>Falcon und VWR</td><td>357521 und 612-3700</td><td>1 und 10 mL</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff</td><td>Sigma</td><td>Z688312 und Z628034</td><td>1,5 mL schwarz und 2 mL transparent</td></tr><tr><td>Kunststoffspitzen</td><td>VWR</td><td>613-0364, 613-0239 und 613-1050</td><td>0.1-10 &micro; L natur, 1-200 & Mikro; L gelb und 200-1000 &micro; L blau</td></tr><tr><td>Kunststoff-Racks</td><td>Light Labs</td><td>A-7055-Z, A-7053-C</td><td>grün für Röhrchen, orange für Mikroröhrchen und blau für TEM-Sonden</td></tr><tr><td>Laminar Hera Save</td><td>Thermo Scientific Co.</td><td>KS12</td><td>HEPA-Filter (H14 nach DIN EN 1822)</td></tr><tr><td>Brutschränke Hera Cell</td><td>Thermo Scientific Co.</td> KG<td>150</td><td>34°; C für hFOB 1,19 und 37°; C für Saos-2</td></tr><tr><td>Abzug</td><td>POLON</td><td>WCS-2</td><td>für TEM-Färbemittel</td></tr><tr><td>Glasflaschen</td><td>SIMAX</td><td>1632414501050 und 1632414501100</td><td>50 und 100 mL</td></tr><tr><td>Quarzglasrohre</td><td>SIMAX</td><td>638422010100</td><td>&Oslash; 10 mm, L 100</td></tr><tr><td>mm Pumpe</td><td>IBS Integra Biosciences</td><td>VACUSAFE comfort</td><td>für</td></tr><tr><td>Vakuumofen</td><td>Memmert</td><td>UNE 400</td><td>56&deg; C</td></tr><tr><td>Porzellan-Multiwell-Platte</td><td>Rosenthal technik</td><td>229/12</td><td>12 Wells</td></tr><tr><td>Glasbecher</td><td>SIMAX</td><td>632417010025</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Glasflaschen</td><td>Pocord</td><td>DIN22</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Kunststoffbox</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td></td><td>für die Dunkelheit</td></tr><tr><td>Snap Fit Gelatine Kapseln</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>G3741</td><td>Größe 1</td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 300 Mesh Ni Gitter in Box</td><td>Agar Scientific Ltd.</td><td>S162N3</td><td>Folie auf der glänzenden Seite</td></tr><tr><td>Silikon-Zellschaber</td><td>Sigma</td><td>SIAL0010-100EA</td><td>Größe 1,8/25 cm</td></tr><tr><td>Spritze mit Nadel</td><td>BogMark</td><td>007</td><td>Spritze 1 mL 40 U, Nadel 0,5 x 16</td></tr><tr><td></td><td>Spritze Chirana</td><td>CH005L</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>MPW Medical Instruments</td><td>MPW-350R</td><td>130 x g und 500 x g</td></tr><tr><td>UV-Transluminator</td><td>UVP</td><td>M-20</td><td>für sichtbares und UV-Licht</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>LKB</td><td>NOVA</td><td>700&Aring; Profile</td></tr><tr><td>Blockhalter</td><td>LKB</td><td>E6711</td><td>runde</td></tr><tr><td>Form Diamantmesser</td><td>DiATOME</td><td>Ultra 45&deg;</td><td>Größe 3</td></tr><tr><td>Wimpernhalter</td><td></td><td></td><td>Rind, von uns präpariert</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>ROTH</td><td>2855.1</td><td>antistatisch für Gitter</td></tr><tr><td>Spatenset</td><td>ROTH</td><td>E286.1</td><td>antistatisch für Pulver</td></tr><tr><td>ImagingInverses</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Zeiss mit Canon</td><td>AxioObserver Z1 ausgestattet mit PowerShot G9</td><td>Phasenkontrast, Durchlicht, 20 x Objektiv, RGB-Filter</td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>TEM Jeol Co. mit Oxford Instruments und SiS-Olympus</td><td>JEM-1400 TEM ausgestattet mit INCA Energy Dispersive Röntgenmikroanalyse (EDX) System und 11 Megapixel MORADA G2</td><td>Kameravergrößerung 50.000x für TEM und 15.000x für STEM und EDX</td></tr><tr><td>Kameragehäuse und Objektive</td><td>Nikon</td><td>Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D </td><td>für Filmaufnahmen</td></tr><tr><td>Mikrofon</td><td>MXL Mics</td><td>Tempo</td><td>für Sprachaufnahmen</td></tr></tbody></table>

analyse der mineralien von hfob 1.19 produziert und saos-2 zellen mittels transmissions-elektronenmikroskopie mit energy dispersive x-ray mikroanalyse

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Dieses Video zeigt die Verwendung von Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy dispersive x-ray Mikroanalyse (TEM-EDX), den Zustand der Mineralien in Vesikeln veröffentlicht von zwei menschlichen Knochen Zelllinien zu vergleichen: hFOB 1,19 und Saos-2. Diese Zell-Linien, nach der Behandlung mit Ascorbinsäure (AA) und β-glycerophosphat (β-GP), komplette osteogene Transdifferenzierung von Verbreitung, Mineralisierung zu unterziehen und produzieren Matrix Vesikel (MVs), die Apatit Keimbildung bei Auslösen der extrazelluläre Matrix (ECM).
Basierend auf Alizarin rot-S (AR-S) Färbung und Analyse der Zusammensetzung von Mineralien in Zelle Lysates mit ultraviolettem (UV) Licht oder in Vesikeln TEM Bildgebung gefolgt von EDX-Quantifizierung und Ionen-Mapping verwenden, können wir daraus schließen, dass Osteosarkom Saos-2 und osteoblastischen hFOB 1.19 Zellen zeigen unterschiedliche Mineralisierung Profile. Saos-2 Zellen effizienter als hFOB 1.19 Zellen mineralisieren und produzieren größere mineralische Ablagerungen, die nicht unter UV-Licht sichtbar, aber ähneln Hydroxylapatit (HA), dass sie mehr Ca und F Vertretungen haben.
Die erzielten Ergebnisse mit diesen Techniken ermöglichen uns zu dem Schluss, dass der Prozess der Mineralisierung unterscheidet sich je nach Zelltyp. Wir schlagen vor, dass auf zellulärer Ebene, die Herkunft und die Eigenschaften von Vesikeln die Art der Mineralien bestimmen.

TEM-EDX erlaubt, für die in-vitro- Bildgebung der Matrix Vesikel (MVs) durch Mineralisierung Zellen freigesetzt und Mineralien produziert von MVs. die Ergebnisse mit diesem Verfahren zeigen, dass der Prozess der Mineralisierung kann abgewichen in verschiedenen Arten von Zellen. Die beiden Zelllinien erhielt die gleiche osteoblastischen Transdifferenzierung Behandlung, noch stimulierte Saos-2 Zellen mineralisierten effizienter als hFOB 1,19 Osteoblasten, wie AR-S belegt F...

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um den Zustand der Mineralien in Vesikeln veröffentlicht von zwei menschlichen Knochen Zelllinien zu vergleichen: hFOB 1,19 und Saos-2. Ihre Mineralisierung Profile wurden von Alizarin rot-S (AR-S) Färbung, ultravioletten (UV) Licht Visualisierung, Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung und Energie dispersiven Röntgen-Mikroanalyse (EDX) analysiert.

Analyse der Mineralien von hFOB 1.19 produziert und Saos-2 Zellen mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Während der ersten Schritte der Mineralisierung produzieren die Zellen extrazelluläre Matrixproteine und setzen Matrixvesikel frei, die Kalzium und Phosphat ansammeln, um die Keimbildung von Apatiten zu erleichtern. In diesem Bericht vergleichen wir die Keimbildung von Mineralien anhand von zwei ausgewählten humanen Zellmodellen, osteoblastischen hFOB 1.19- und osteosarkomischen Saos-2-Zellen. Ihre Mineralisierungsprofile wurden mit verschiedenen Methoden analysiert.Legen Sie alle Materialien unter die Lamelle und sterilisieren Sie sie unter UV-Licht. Wechseln Sie das Medium auf 10 Milliliter frisches Kulturmedium mit fötalem Rinderserum. Ruhezellen werden ohne Stimulatoren inkubiert, während stimulierte Zellen sowohl mit Ascorbinsäure als auch mit Beta-Glycerophosphat behandelt werden.Lassen Sie zunächst Ascorbinsäure vorsichtig bis zu einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter auf die Oberfläche des Kulturmediums fallen, um die Zellen zu stimulieren. Als nächstes fügen Sie Beta-Glycerophosphat in einer Endkonzentration von 7,5 Millimolar in Kulturmedium hinzu, um die Zellen zu stimulieren. Rühren Sie die Kulturschale vorsichtig um und stellen Sie sie für sieben Tage in den Inkubator.Waschen Sie die Zellkulturen nach siebentägiger Inkubation mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS. Fügen Sie fünf Milliliter 2% Alizarinrot hinzu und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang, um die Mineralien zu färben. Dreimal mit PBS waschen.Geben Sie vorsichtig PBS an die Schalenwand. Versuchen Sie, die Mineralien nicht zu zerstören. Beobachten Sie die Mineralien unter einem inversen Lichtmikroskop.Sammeln Sie das Medium aus Zellkulturen und waschen Sie die Zellen mit PBS. Verdauen Sie entweder ruhende oder siebentägige stimulierte Zellen mit 500 Einheiten pro Milliliter Kollagenaselösung bei 37 Grad für drei Stunden. Kratzen Sie dann die Zellen mechanisch ab.Übertragen Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff. Führen Sie sie 10 Mal durch eine Spritze. Zentrifugieren Sie die Proben bei 500 g für fünf Minuten.Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern synthetischer Knorpellymphe. Übertragen Sie die Hydroxylapatit-, Fluorapatit- und Chlorapatit-Pulver aus den Flaschen mit einem Spatel auf den UV-Transilluminator und verwenden Sie sie als Kontrollen. Übertragen Sie die Zelllysate mit Kunststoffspitzen aus den Kunststoffröhrchen und legen Sie sie vorsichtig auf den UV-Transilluminator.Suspendieren Sie 2,5 Milligramm Hydroxylapatit-, Fluorapatit- und Chlorapatit-Pulver in 500 Mikrolitern deionisiertem Wasser. Eine Stunde lang bei 37 Grad inkubieren. Nehmen Sie Formvar/Kohlenstoff-Nickel-Gitter aus der Schachtel mit antistatischer Pinzette und legen Sie sie auf eine Porzellanplatte mit mehreren Vertiefungen.Lassen Sie 10 Mikroliter der Hydroxylapatit-Suspension auf die Gitter fallen. Machen Sie dasselbe für Chlorapatit und Fluorapatit. Trocknen Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.Bereiten Sie ruhende und stimulierte Zellen für die Einbettung vor. Sammeln Sie Medium aus den Zellkulturen. Waschen Sie die Zellen in physiologischem Desensibilisierungsmedium.Fixieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern eines Gemischs aus 3 % Paraformaldehyd und 1 % Glutaraldehyd in 100 millimolarem Natriumphosphatpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur unter dem Abzug. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern 100 Millimolar Natriumphosphatpuffer. Entfernen Sie den Puffer nach dem Waschen vorsichtig.In der Dunkelkammer werden die Proben mit zwei Millilitern 1%Osmiumtetroxid in 100 Millimolar Natriumphosphatpuffer nachfixiert. Die Proben werden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur unter dem Abzug inkubiert. Entfernen Sie Osmiumtetroxid und verwenden Sie es.Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern 100 Millimolar Natriumphosphatpuffer. Dehydrieren Sie dann die Proben in fünf Milliliter-Aliquoten einer abgestuften Ethanollösungsreihe bei Raumtemperatur, 25, 50, 75 und 90 % Ethanol. Zum Schluss zweimal absolutes Ethanol verwenden und 30 Minuten und 12 Stunden inkubieren.Kratzen Sie die Zellen mechanisch aus den Kulturschalen. Sammeln Sie die Zellen in Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff. Die Proben werden eine Minute lang bei 130 g zentrifugiert.Entfernen Sie die Überstände. Suspendieren Sie die Zellen in einer Mischung aus LR White Harz und absolutem Ethanol in einem Volumenverhältnis von eins zu zwei. Gut mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Die Proben werden eine Minute lang bei 130 g zentrifugiert. Entfernen Sie die Überstände. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mit einer Eins-zu-Eins-Mischung aus LR White Harz und absolutem Ethanol.Gut mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Proben werden eine Minute lang bei 130 g zentrifugiert. Entfernen Sie die Überstände.Geben Sie reines LR White Harz zu den Proben und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur in Kunststoffröhrchen. Die Proben werden eine Minute lang bei 130 g zentrifugiert. Entfernen Sie die Überstände.Geben Sie erneut reines LR White Harz hinzu. Geben Sie 500 Mikroliter jeder Probe in Gelatinekapseln. Beachten Sie, dass die Proben mit einem kleinen Blatt Papier und einem Bleistift beschriftet werden, damit das Harz die Etiketten nicht zerstört.Verschließen Sie die Gelatinekapseln. Legen Sie die Kapseln in Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff. Eine Minute lang bei 130 g in einem Ausschwingrotor zentrifugieren.Entfernen Sie die Kapseln mit einer Vakuumpumpe aus den Kunststoffröhrchen. Bringen Sie die Proben in den Ofen und polymerisieren Sie 48 Stunden lang bei 56 Grad. Bereiten Sie die Blöcke vor, indem Sie sie in die Halterung montieren.Setzen Sie den Halter in das Ultramikrotom ein. Befestigen Sie das Diamantmesser. Füllen Sie es mit entionisiertem Wasser.Denken Sie daran, die Klinge von den zufälligen Luftblasen zu reinigen. Schneiden Sie dann mit einem Diamantmesser auf dem entionisierten Wasserbad Abschnitte. Fixieren Sie die Reste mit Rinderwimpern.Legen Sie sie dann auf die glänzende Seite des Formvar/Kohlenstoff-Nickel-Gitters und trocknen Sie sie. In der Dunkelkammer die Gitter aus synthetischen Apatiten und Zellproben mit 2,5 % Uranylacetat in Ethanol 20 Minuten lang bei Raumtemperatur unter dem Abzug gegenfärben. Waschen Sie die Gitter in 50% Ethanol, dann in entionisiertem Wasser und trocknen Sie sie 24 Stunden lang bei Raumtemperatur.Zum Schluss legst du die Gitter in die Box. Bereiten Sie den Berylliumhalter für die Beobachtung von Mineralien und Zellen vor. Verwenden Sie antistatische Werkzeuge.Entfernen Sie das Schraubenpaar. Heben Sie die Berylliumplatte und die Berylliumscheibe vom Rest der Halterung ab. Montieren Sie das Gitter mit der glänzenden Seite nach oben auf der Halterung.Setzen Sie die Berylliumscheibe und die Berylliumplatte vorsichtig ein. Schrauben Sie die Befestigungsschrauben fest. Setzen Sie den Halter in die Vakuumkammer ein und schalten Sie die Vakuumpumpe ein.Sobald ein Vakuum erreicht ist, setzen Sie den Halter vorsichtig in die Bildgebungskammer ein und schalten Sie den Strahl ein. Stellen Sie auf dem Fluoreszenzmonitor die Aperturparameter des Mikroskops ein. Führen Sie eine Korrektur des Bildastigmatismus durch.Stellen Sie den Zoom, den Fokus und den Rahmen ein und nehmen Sie ein Transmissionselektronenmikroskopiebild auf. Schieben Sie den Detektor in die Bildgebungskammer. Passen Sie die Schärfe des Bildes im Fokusmodus an.Wählen Sie einen Punkt in der Probe für die Röntgenmikroanalyse aus und sammeln Sie Spektren. Wählen Sie Elemente wie Kalzium, Fluor, Chlor und Phosphor aus, um eine Ionenkartierung durchzuführen, und führen Sie eine Kartierung der ausgewählten Elemente durch. Stimulierte Saos-Zellen mineralisierten effizienter als hFOB-Osteoblasten.Unter Anregung durch UV-Licht können nur Fluorapatite beobachtet werden. HFOB-Zelllysate waren fluoreszierender als Saos, was darauf hindeutet, dass Fluorapatiten in diesen Zellen häufiger vorkommen. Stimulierte Saos-Zellen produzieren mehr Vesikel, die Mineralien enthalten, als hFOB-Zellen und ruhende Saos-Zellen.Synthetische Apatite hatten unterschiedliche mineralische Formen. Das oben angewandte Verfahren zeigte das Vorhandensein von Vesikeln in hFOB- und Saos-Zellen unter Ruhe- und Stimulationsbedingungen. Die roten Punkte zeigen die Verteilung von Kalzium, grünem Phosphor und blauem Fluor an.Unter stimulierten Bedingungen gab es eine starke Überlappung zwischen der Kalzium- und Phosphorverteilung in den von Saos-Zellen produzierten Vesikeln und zwischen Fluor und Phosphor in Vesikel, die von hFOB-Zellen produziert wurden. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Vesikel eine Schlüsseldeterminante für die Keimbildung von Mineralien sind, insbesondere auf zellulärer Ebene. Der Vergleich von Vesikel, die aus Saos-2-Zellen freigesetzt werden, die effizienter mineralisieren, und Vesikel, die aus hFOB 1.19-Zellen freigesetzt werden, unterstützt die Hypothese, dass Matrixvesikel mineralgefüllte Vesikel sind.Dies lässt die Frage offen, ob das Vorhandensein von Matrixvesikeln erforderlich ist, um die Apatitnukleation zu induzieren und wie sich dadurch die physiologische bis pathologische Mineralisierung verändern kann.

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Forschung

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Chemie

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Analyse der Mineralien von hFOB 1.19 produziert und Saos-2 Zellen mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse (Video) | JoVE Journal

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