Name: Abgeleitet von Maus und Mensch primäre gastrische Epithelzellen Monolayer Kultur for the Study of Regeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung primärer gastrischer Epithelzellen aus Maus- und Humanorganoiden für Regenerationsstudien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellmigration und Wundheilung in vitro.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 (YZ) zu gewähren.

Um Kontaminationen zu vermeiden, führen Sie Protokoll in seiner Gesamtheit in eine sterile Gewebekultur Kapuze. Fundic Gewebe von Patienten mit Sleeve-Gastrektomie nach dem genehmigten Protokoll der University of Cincinnati IRB gesammelt wurde (IRB-Protokollnummer: 2015-4869). Alle Studien an Mäusen wurden genehmigt, von der University of Cincinnati institutionelle Pflege der Tiere und Nutzung Committee (IACUC), die eine American Association of Assessment und Akkreditierung von Laboratory Animal Care (AAALAC) Anlage unterhält.
1. zur Gründung Human abgeleitet 3D Magen Fundic Organellen
Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf Recherchen, die zuvor in diesem Labor8veröffentlicht.
<ol><li>Bereiten Sie 3D organoide Medien besteht aus 50 % Wnt konditioniert und zu 20 % R-Spondin konditioniert Medien vor.<ol>
<li>Bereiten Sie Wnt konditioniert Medien, Kultur der L-Zellen im Wnt Wachstumsmedium (Dulbecco modifizierten Eagle Medium (DMEM), 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin) für 7 Tage, das Medium zu ernten, und Filtern Sie mit einem 0,22 µm-Filter.</li>
		<li>R-Spondin konditioniert Medien vorbereiten. Eine modifizierte HEK-293T R-Spondin absondernde Zelllinie R-Spondin Nährmedium wachsen (Dulbecco modifizierten Eagle Medium (DMEM), 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin). Auf Anlage nach 2 h, ändern Sie das Medium aus diesen Zellen in OPTIMEM Wachstum Mittel, 1 % Penicillin/Streptomycin. Kulturzellen Sie für 7 Tage. Dann ernten die R-Spondin konditioniert Medien und Filtern mit einem 0,22 µm-Filter. Hinweis: Dieses Protokoll ist bereits erschienen und für eine ausführlichere Protokoll beziehen sich auf 6,7,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auftauen der Wachstumsfaktor reduziert, Phenol rotfrei-Basalmembran Matrix für 16 h auf dem Eis bei 4 ° C. Sammeln Sie das Gewebe in den eiskalten Ca2 +/Mg2 +-DBPS in einem großen Kunststoff-Behälter frei. Speichern Sie auf dem Eis bis Anfang Schritt 1.4. Hinweis: Gewebe wird von Patienten, die Sleeve-Gastrektomie gesammelt.</li>
	<li>Mit Pinzette, waschen das Gewebe kräftig in einem sterilen Becher mit 100 mL Ca2 +/Mg2 +-freie Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS). Wäsche für ca. 30 s oder bis die Trümmer und das Blut entfernt wurde. Als nächstes mit steriler Gaze, wischen Sie die Schleimschicht aus dem Epithel.</li>
	<li>Mit großen Zangen, fest fassen Sie die Muskelschicht des Gewebes und mit Kraft, kratzen Sie entfernt das Epithel mit der großen gebogenen blutstillende Pinzette. Sammeln Sie die ausgekratzte epithelialen Fragmente in eine Petrischale aus Polystyrol, steril.</li>
	<li>Zerkleinere die Epithelgewebe in etwa 2.0 x 2.0 mm2 große Fragmente mit Rasierer, um Gewebe Verdauung zu optimieren. Waschen Sie die gewebefragmente mit Ca2 +/Mg2 + -frei DBPS ergänzt mit Antibiotika (Ca2 +/Mg2 + -freie DPBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/mL Amphotericin B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL Kanamycin), bis die Wäsche ist frei von Blut. Führen Sie mehrere Wäschen, wenn nötig. Aus der Wäsche durch sorgfältig filtern die Wäsche durch eine sterile Gaze in ein Becherglas Abfall entsorgen.</li>
	<li>Sammeln gewaschen Fragmente in ein 125 mL Glas Runde untere Kolben mit 25 mm Stir Bar und vorgewärmten Inkubation Medien (basale Medien ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES-Puffer, 1 mg/mL Kollagenase Typ1, 2 mg/mL Zellkultur Klasse Rinderserumalbumin). Versiegeln der Rundboden-Küvette mit Kautschuk Septen.</li>
	<li>Legen Sie eine 20 G spinalnadel in die Septen und schließen Sie es an eine Sauerstoffflasche mit Kautschuk Schlauch. Um Verunreinigungen herauszufiltern, stecken Sie Seidenpapier in den Schlauch zum Erstellen eines Filters. Schalten Sie den Sauerstoff-Abfluss auf Low. Die Septen zu vermeiden, den Bruch der Septen stecken Sie 10-15 Abfluss Nadeln.</li>
	<li>Sichern Sie den Satz bis zum Ring stehen mit Schellen und legen Sie es in einem Wasserbad auf 37 ° C mit einer Platte rühren für 30-45 min kalibriert. Nachdem das Gewebe für 15 min Inkubation wurde, entfernen Sie 50 µL der Inkubation Medien und visuell suchen dissoziierten Drüsen. Wenn Drüsen nicht dicht sind oder nicht aus dem Gewebe getrennt haben, lassen Sie für eine weitere 5-10 min.</li>
	<li>Fügen Sie unmittelbar nach der Inkubation, 50 mL DMEM/F12 vorgewärmt, Inkubation Medien mit einer sterilen serologische Pipette oder indem Sie direkt in die Inkubation-Mischung Gießen.</li>
	<li>Filtern Sie die Drüse Mischung durch eine sterile Gaze in vier 50 mL konische Röhrchen. Halten Sie das Filtrat auf Eis für 15 min erlauben extrahierte Drüsen an der Unterseite des konischen Rohres zu begleichen. Achten Sie darauf, nicht zu stören die sesshaften Drüsen, entfernen und entsorgen Sie weg von der Oberseite 40 mL überstand mit einer serologischen Pipette. Aufzuwirbeln Sie die restliche 10 mL in 10 mL des DPBS ergänzt mit Antibiotika.</li>
	<li>Verteilen Sie die Mischung gleichmäßig in 5 mL Zelle Kultur Reagenzgläser. Für 5 min bei 65 X g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand mit einer Pipette vorsichtig zu entfernen. Aufzuwirbeln Sie die Drüse Pellet in aufgetauten Basalmembran Matrix mit einer Pipette oder einem 200 µL Breite PIPETTENSPITZE. Mischen Sie, bis Sie homogen. Anmerkung: Es ist wichtig, diesen Schritt ausführen, auf dem Eis und Polymerisation der Basalmembran Matrix beim Mischen zu vermeiden. Darüber hinaus ist es wichtig, die Drüse Dichte von Stichproben für 50 µL Sichtprüfung. Die optimale Dichte ist ~ 70 % Konfluenz.</li>
	<li>Als nächstes Platte die Drüsen in 50 µL der Basalmembran Matrix mit einer Pipette weit gekippt. Produzieren Luftblasen während der Beschichtung zu vermeiden.</li>
	<li>Damit können Basalmembran Matrix zu polymerisieren, 10-15 min bei 37 ° c inkubieren Wenn in einer Kultur 12-Well-Platte Plattieren, fügen Sie 1 mL hFGO Medien (Advanced Dulbecco modifizierte Eagle Medium/F12 Medium ergänzt mit 2mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/mL Amphotericin B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL Kanamycin, 10 mM HEPES Puffer, 1 mM n-Acteylcystine, 1 X N2, 1 x B27, 50 % Wnt konditioniertes Medium, 20 % R Spondin-konditioniertes Medium ergänzt mit 100 ng/mL Knochen morphogenetische Protein Inhibitor 1 nM Gastrin, 50 ng/mL Epidermal Growth Factor, 200 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10, 10 mM Nicotinamid, und 10 µM Y-27632 ROCK-Inhibitor) pro Bohrloch. Wenn nicht mit einer Kultur 12-Well-Platte hinzufügen genügend Medien um die Basalmembran Matrix Blase zu versenken.</li>
	<li>Kultur der Zellen bei 37 ° C in einem 5 % CO2 befeuchtete Zelle Kultur Inkubator. Wechseln Sie Medium alle 4-5 Tage.</li>
</ol>2. Einrichtung Maus stammenden 3D Magen Fundic Organellen
Hinweis: Dieses Protokoll wurde bisher erschienen 6. Tauen Sie Basalmembran Matrix auf dem Eis auf und bereiten Sie alle Reagenzien vor Beginn.
<ol><li>Opfern Sie Mäuse mit einer Methode, die von der Forschungseinrichtung genehmigt wo ist Forschung durchgeführt. Entfernen Sie den Magen von der Maus und sezieren Sie gemäß den zuvor veröffentlichten Protokolle 6. Waschen in 20 mL Eis kalt Ca2 +/Mg2 +-DBPS frei. Hinweis: C57BL/6 Mäusen, im Alter von 8-10 Wochen werden für fundic Magen organoide Kulturen verwendet. Mäuse wurden durch das Einatmen von Kohlendioxid, gefolgt von manuellen zervikale Dislokation vor dem Magen entfernen eingeschläfert.</li>
	<li>Streifen die Muskelschicht aus dem Magen und sichtbaren Blutgefäße wie zuvor 6veröffentlicht.</li>
	<li>Trennen Sie den Fundus von Antrum und Vormagen mit einer sterilen Rasierklinge. Geschnittenen Fundus mit kleine Chirurgische Schere in Fragmente ca. 2,0 x 2,0 mm. mit Zange, sammeln die Fragmente in einem 15 mL konische Röhrchen mit EDTA Inkubation Puffer (Ca2 +/Mg2 +-freie DPBS, 5 mM EDTA) und inkubieren Sie bei 4 ° C für 2 h mit sanfte Bewegung.</li>
	<li>In einem sterilen Haube konische Rohr verlassen und Fragmente auf Eis für etwa 5 min. soviel Inkubation Puffer möglichst unberührt Fragmente entfernen mit einer Pipette. Geben Sie 5 mL Puffer schütteln (1 g D-Sorbit, 1,47 g Saccharose in 100 mL Ca2 +/Mg2 +-frei DPBS) und von hand mit einer Kraft zu schütteln, für 2 min. ermöglicht die große Fragmente zu begleichen und mit Eile, mit einer Pipette 1000 p entfernen die kleinen Fragmente, die noch zu begleichen in der oberen Schicht.</li>
	<li>Drehen Sie die entfernte Fragmente für 5 min bei 4 ° C bei 65 X g.</li>
	<li>Unter Vermeidung von Luftblasen, entnehmen Sie des Überstands in der Basalmembran Matrix Aufschwemmen Sie und mischen Sie, bis sie homogen ist.</li>
	<li>Verwenden Sie eine breite Spitze-Pipette, um die Basalmembran Matrix in 50 µL pro Well Platte und dann bei 37 ° C für 20 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie genug mFGO Wachstumsmedien (Advanced Dulbecco geändert Eagle Medium/F12 Medium ergänzt mit 2mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES Buffer, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50 % Wnt konditioniertes Medium, 20 % R-Spondin-Klimaanlage Medium mit 100 ng/mL Knochen morphogenetische Protein Inhibitor, 10 nM Gastrin 50ng/mL Epidermal Growth Factor, 10 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10 und 10 µM Y-27632 ROCK Inhibitor ergänzt) um die Blase zu versenken.</li>
	<li>Kultur der Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 befeuchtete Zelle Kultur Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle 4-5 Tage.</li>
</ol>(3) Kollagen-Beschichtung für 2D Übertragung
Hinweis: Führen Sie alle Verfahren in einem sterilen Gewebekultur Abzug sofern nicht anders angegeben. Beginnen Sie Kollagen 24 h vor der Übertragung 3D Organellen, die Monolayer Beschichtung. Halten Sie die Ratte Schweif Kollagen auf dem Eis und vor Licht geschützt. Kollagen beschichtete Platten eignen sich für bis zu 2 Wochen. Wenn nicht sofort die beschichteten Platten verwenden, wickeln Sie die Platte im Parafilm und Store bei 4 ° C bis benötigt.
<ol><li>Verdünnen Sie die Ratte Schweif Kollagen bis 50 µg/mL mit 20 mM-Essigsäure.</li>
	<li>Bedecken Sie hinreichend die Oberfläche des Brunnens mit verdünnter Kollagen. Für einen Brunnen in einem standard 12-Well-Platte mit etwa 1 mL der Kollagen bestreichen. Lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur in einer sterilen Kapuze.</li>
	<li>Waschen zweimal mit 1 mL Ca2 +/Mg2 +-kostenlose DPBS pro Bohrloch und lassen bei Raumtemperatur in einem sterilen Abzug für 2 h aufgedeckt.</li>
</ol>(4) Basalmembran Matrix Beschichtung für 2D Übertragung
Hinweis: Führen Sie alle Verfahren in einem sterilen Gewebekultur Abzug sofern nicht anders angegeben. Beginnen Sie Basalmembran Matrix 2 h vor der Übertragung 3D Organellen, die Monolayer Beschichtung. Halten Sie die Basalmembran Matrix auf Eis. Beschichtete Platten sofort verwendet werden und können nicht für längere Zeit gespeichert werden.
<ol><li>Verdünnen Sie die Basalmembran Matrix in einem 15 mL konische Röhrchen mit Grade Zellwasser Kultur bei einem 01:10 Verhältnis. Verdünnen Sie auf Eis.</li>
	<li>Mit einer Pipette geben 100 µL verdünnter Basalmembran Matrix in jedem standard 12-Well-Platte. Mit einem Zelle Schaber, gleichmäßig verteilen Sie die verdünnte Basalmembran Matrix in den Brunnen für eine gleichmäßige Schicht.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>Entfernen Sie das restliche Wasser mit einer Pipette und Trocknen bei Raumtemperatur 1 Stunde vor der Übertragung 3D Organellen.</li>
</ol>5. Übertragung von 3D m/hFGOs auf 2D Magen epitheliale Zelle Monoschichten
<ol><li>Nach 3D Maus - oder Mensch-abgeleitet haben FGOs für 6-7 Tage kultiviert wurde, beginnen die Übertragung von 3D Organellen, die 2D Monolage. Hinweis: Für jedes gut einen monomolekularen Film benötigt empfiehlt es 300 intakter Organellen oder einzelne Zellen aus 300 Organellen zu verwenden. In einer robusten Kultur wird es voraussichtlich ca. 150 organoide/gut innerhalb einer Platte 12 gut Kultur zu erhalten.</li>
	<li>Achten Sie darauf, dass die Platten vor der Übertragung beschichtet sind. Hinweis: Die Basalmembran Matrix beschichtete Platten haben eine lichtdurchlässige Gelschicht, Kollagen beschichtete Platten müssen jedoch nicht offensichtliche Anzeichen der Beschichtung.</li>
	<li>Die 3D Basalmembran Matrix Blase von der Platte zu vertreiben, durch direkt pipettieren 1 mL sterile Ca2 +/Mg2 +-freie DBPS auf die Mitte der Blase.</li>
	<li>Mit einer Pipette, die Basalmembran Matrix und organoide Mischung in Reagenzgläsern Zelle Kultur sammeln. Sammeln Sie in einem Verhältnis von 2 Keller Matrix membranbläschen pro Röhre. Zentrifuge für 5 min bei 40 x g und 4 ° C.</li>
	<li>Mit einem Vakuumsystem Überstand entfernen und wie viel Basalmembran Matrix wie möglich. In Ca2 +/Mg2 +4 mL aufzuwirbeln-freie DBPS, entfernen den überstand und 2 - 3 Mal wiederholen. Das ganze organoide Übertragungsprotokoll fahren Sie mit Schritt 5.10. Fahren Sie mit Schritt 5.7 für die einzelne Zelle Aussetzung Protokoll.</li>
	<li>Zelle Ablösung Lösung auf 37 ° C vorwärmen und jedes Reagenzglas 1 mL hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig durch invertieren Röhren oder oben und unten mit einer Pipette pipettieren. 10 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL Ca2 +/Mg2 +-freie DBPS direkt in jedes Reagenzglas.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 26 G-Nadel und Spritze die Mischung 2-3 Mal. Eine Sichtkontrolle für einzelne Zellen. Spritze 1-2 Mal, gibt es noch Organellen oder Gruppen von Zellen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 40 X g für 5 min bei 4 ° C. Das Pellet in 2D FGO Medien Aufschwemmen (2D Maus FGO Wachstumsmedium: Advanced Dulbecco modifizierte Eagle Medium/F12 Medium ergänzt mit 2mM L-Glutamin, 10 mM Penicillin/Streptomycin, 10 % fetalen Kälberserum, 10 mM HEPES Buffer, 1 x N2, 1 x B27, ergänzt mit 10 nM Gastrin, 50 ng/mL Epidermal Growth Factor, 1 µM TGF-β-Inhibitor und 10 µM Y-27632 ROCK-Inhibitor. 2D menschlichen FGO Wachstumsmedium: Erweiterte Dulbecco modifizierte Eagle Medium/F12 Medium ergänzt mit 2mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES-Puffer, 10 % fetalen Kälberserum, 10 mM Nicotinamid, 1 x N2, 1 x B27, ergänzt mit 50 mg/mL Kanamycin, 50 ng/mL epidermiale Wachstum Faktor und 10 µM Y-27632 ROCK-Inhibitor, 1 µM TGF-β-Hemmer).</li>
	<li>Platte die Wiederfreisetzung auf beschichteten Platten. Platten bei 37 ° c inkubieren Ersetzen Sie Medien alle 4 Tage oder früher Wenn Medien gelb dargestellt wird. Monolage erfordert ca. 4 Tage zu bilden.</li>
</ol>(6) kratzen Sie Wunde Assay mit 2D gastrische Epithelzelle Monoschichten
<ol><li>Mit einer Rasierklinge, kratzen Sie die Monolayer, wenn die Kultur 100 % Konfluenz erreicht hat.</li>
	<li>Monolagen mit 3,7 % Formaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur zu beheben. Permeabilize mit 0,5 % nicht-ionische Waschmittel/PBS für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Als nächstes blockieren Monolagen mit 2 % Esel Serum für 1 h bei Raumtemperatur und inkubieren Sie mit 1: 1000 Verdünnung von H+, K+-ATPase Primärantikörper über Nacht bei 4 ° C mit 0,1 % nicht-ionische Waschmittel/PBS waschen und inkubieren Sie mit 1: 100 Verdünnung der Esel Anti-Maus 488 Sekundärantikörper und 10μg/mL von Hoechst Zellkernen färben für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Um die Oberfläche Schleim Grube Zellen in 2D Menschen abgeleitet Magen Monolayer-Kulturen zu identifizieren, zu beflecken Zellen mit 20 μg /mL von Ulex Europaeus (UEAI)-FITC-Konjugat. Bild Monolagen auf eine confocal Mikroskop.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder von Wunde jedes Paar h. Kratzer zwischen 24-48 h abhängig von der Qualität der Monolage und Unterschiede zwischen den Patienten wieder epithelisiert werden.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Einrichtung von Mensch und Maus abgeleitet gastrische Epithelzellen Monolagen, die für neu-Wunde Assays verwendet werden können. Das Protokoll hängt das Konzept der ansässigen Stammzellen isoliert von primären Mensch (oder Maus) Gewebe und ist ein modifiziertes Protokoll zuerst veröffentlicht durch Schlaermann Et al.7. Insbesondere haben wir das Protokoll hier so optimiert, dass ein Zusammenfluss etablieren und polarisiert gastrische Epithelzellen Mon...

Die Verwendung von Grund auf neu-Wunde-Assays ist eine beliebte Methode zur Untersuchung von Reparatur und Regeneration1,2,3,4,5,6. Die vorgeschlagene Methode kann verwendet werden, insbesondere Magen-Regeneration und Helicobacter Pylori Besiedlung zu studieren. In der Vergangenheit Magenkrebs Zelllinien als Mittel verwendet wurden, um Helicobacter Pylori (H. Pylori) Infektion1,2 studieren und Zell-Linien wie AGS Zellen waren bis vor kurzem Magenkrebs favorisierte1 ,2,3,4. Eine Einschränkung der Magenkrebs Zellkulturen ist ihrer Nichtbeachtung die zelluläre Vielfalt der Magen Epithel zu rekapitulieren. Zu versuchen, diese Einschränkung Adresse gezeigt, hier ist die Errichtung und die Übertragung der primären Mensch und Maus abgeleitet 3-dimensionale fundic Magen Organellen (FGOs), ein Magen epithelialen Monolage für Wunde heilende Assays basieren auf einer modifizierten Methode zuerst von Schlaermann Et al.beschrieben. 7 wir zeigen, dass Magen epitheliale Monolagen abgeleitet 3D Magen FGOs geschert oder FGO abgeleitet Einzelzellen behalten eine polarisierte zelluläre Zusammensetzung, die eng, die der Magen Epithel darstellt in-vivo. Angesichts der Tatsache, dass Magenkrebs Zelllinien keine Zelle Zusammensetzung, die diese Technik zeigt erkennen lassen, hat das aktuelle Protokoll einen Vorteil gegenüber alternativen Kratzer-Wunde-Assay-Methoden. Diese Methodik wurde optimiert, wobei Monolagen etablierten aus ganzen Organellen oder aus einer einzelnen Zelle Suspendierung vom dissoziierten Organellen und überzogen mit einer Basalmembran Matrix oder Kollagen-Beschichtung werden können. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, festzulegen, dass eine organoide gastrische Epithelzellen Monolage Kulturen für einen neuartigen Wunde heilende Assay abgeleitet.

<table><tbody><tr><td>Advanced Dulbecco's modifiziertes Eagle/F12 Medium (Basalmedien)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-Glutamin)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo</td><td>Scientific SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B/Gentamicin</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01510</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>RO1510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Puffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP-Inhibitor (Noggin)</td><td>Pepro Tech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Pepro Tech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; Inhibitor</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+-frei DPBS</td><td>Fisher</td><td>21-031CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>FBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22&micro; M Filter</td><td>Fisher</td><td>099-720-004</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 1</td><td>Worthington</td><td></td><td></td>LS004214</tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (Seidenpapier)</td><td>Fischer Scientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>125 mL Rundkolben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Zoll (25 mm) Rührstab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gummisepten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gaze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 g Nadeln mit einer Länge von 1,5 μm Thermo</td><td>Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20 g Spinalnadeln mit einer Länge von 3,5 μm Thermo</td><td>Fisher</td><td>405182</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td> <td>mit Zellkultur behandeltMidwest Scientific</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor reduziert, phenolrotfrei MatrigelTM (Basalmembranmatrix)</td><td>Fisher</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Rasierklingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Pinzette <td></td><td></td><td></td><td>mit breiter Spitze</td></tr><tr><td>Gebogene hämostatische Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L breite Pipettenspitzen</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Zellkultur-Reagenzgläser</td><td>Fisher</td><td>14-956-3C</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstofftank mit Gummischlauch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g D-Sorbit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>SS-500</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariertablett</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schaukeltisch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rattenschwanz Kollagen Typ 1</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig in Zellkulturqualität</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in Zellkulturqualität</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>2-Well-Kammer-Objektträger</td><td>Thermo Fisher</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>12-well Transwell (Polyester-Membraneinlagen)</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Corning</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (Lösung zur Zellablösung)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>263/8 G Spritze</td><td>Thermo Fisher</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L Zellen</td><td>L-Zellen, eine Wnt3a-produzierende Zelllinie, wurden von Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Niederlande) als Geschenk erhalten.&nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T Rspondin-sezernierende</td> Zellen <td>Eine modifizierte HEK-293T R-Spondin-sezernierende Zelllinie wurde von Dr. Jeff Whitsett (Sektion für Neonatologie, Perinatale und Lungenbiologie, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre und The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA&nbsp;) gewonnen. &nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HK-ATPase Primärer Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>SC-374094</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherinn</td><td>SantaCruz</td><td>sc-59778</td><td></td></tr><tr><td>UEA1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 488 Sekundärantikörper (Donkey anti-mouse 488 Sekundärantikörper)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37114</td><td></td></tr></tbody></table>

abgeleitet von maus und mensch primäre gastrische epithelzellen monolayer kultur for the study of regeneration

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In-vitro- Studien der Magen Wunde Reparatur umfasst in der Regel die Verwendung von Magenkrebs Zell-Linien in einem neu-Wunde-Assay der zelluläre Proliferation und Migration. Eine kritische Einschränkung solcher Tests ist jedoch ihre homogene Sortiment von zellulären Arten. Reparatur ist ein komplexer Prozess, der die Interaktion der verschiedenen Zelltypen verlangt. Daher geht um eine Kultur zelluläre Subtypen zu studieren, die überwunden werden müssen, wenn wir die Reparatur-Prozess zu verstehen. Das Magenband organoide Modell kann dieses Problem beheben, wobei die heterogene Sammlung von Zelltypen, die den Magen Epithel oder anderen nativen Gewebe in Vivoentspricht. Gezeigt, hier ist ein Roman, in-vitro- Kratzer-Wunde Assay abgeleitet von Mensch oder Maus 3-dimensionale Organellen, die dann auf eine gastrische Epithelzellen Monolage als entweder intakten Organellen oder als einzelne Zelle Aussetzung der übertragen können getrennt Organellen. Das Ziel des Protokolls ist, organoide abgeleitet gastrische Epithelzellen Monolagen zu etablieren, die in einem Roman Kratzer-Wunde-Assay-System einsetzbar, um Magen-Regeneration zu studieren.

Organellen stammen aus dem Korpus/Körper des Menschen oder Fundus der Maus Magen Gewebe (Abbildung 1A). Nach Kollagenase oder EDTA Verdauung von Mensch oder Maus abgeleitet Magen Gewebe sind, Drüsen in Basalmembran Matrix eingebettet bzw. für 6-7 Tage (Abbildung 1A) kultiviert. Abbildung 1 b zeigt die Bildung des Menschen abgeleitet Magen Organellen (HuFGOs), die dann zu einer Magen epithelialen Mono...

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Einrichtung und Kultivierung von Mensch und Maus abgeleitet 3-dimensionale (3D) Magen Organellen und die Methode für die Übertragung von 3D Organellen auf eine 2-dimensionale monomolekularen Film. Die Verwendung von Magen epithelialen Monolage als eine neuartige Kratzer-Wunde-Assay für Regeneration Studien wird ebenfalls beschrieben.

Abgeleitet von Maus und Mensch primäre gastrische Epithelzellen Monolayer Kultur for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Kultursystems ist es, eine primäre Magenmonoschicht aus der Maus oder dem Menschen für die Untersuchung der Regeneration in einem Wundheilungsassay zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Magenbereich zu beantworten, wie z. B. den Mechanismus der Regeneration von Magenepithelzellen als Reaktion auf Verletzungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist erstens die Untersuchung der Zellmigration und -regeneration in einem Wundheilungsassay, der aus primären Magenzellen von Mäusen oder Menschen erzeugt wird, und die zweite Generation von vom Menschen stammenden Magenorganoiden für groß angelegte Experimente.Obwohl diese Methode Einblicke in die Regeneration des Magenepithels geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Helicobacter pylori-Infektionen und epitheliale Immunzell-Cokulturen angewendet werden. Das Verfahren wird von Emma Teal, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Sammeln Sie zunächst das vorbereitete Taschentuch in einem großen Plastikbehälter, der mit kalzium-magnesiumfreiem DPBS gefüllt ist.Lassen Sie den Plastikbehälter bis zum Gebrauch auf Eis. Waschen Sie anschließend das Gewebe mit Hilfe einer Pinzette etwa 30 Sekunden lang kräftig in einem sterilen Becherglas mit 100 Millilitern Calcium-Magnesium-freiem DPBS. Wischen Sie dann mit einer sterilen Gaze die Schleimschicht vom Epithel ab.Verwenden Sie als Nächstes eine große Pinzette, um die Muskelschicht des Gewebes fest zu halten, und verwenden Sie dann eine große, gebogene hämostatische Pinzette und kratzen Sie das Epithel mit Gewalt ab. Bewahren Sie das abgeschabte Epithel in einer sterilen Petrischale aus Polystyrol auf. Um die Verdauung des Gewebes zu optimieren, zerkleinern Sie das Epithelgewebe in Fragmente.Waschen Sie dann das Gewebe mit Calcium-Magnesium-freiem DPBS, das mit Antibiotika ergänzt wird. Waschen Sie sich mehrmals, um das Blut zu entfernen. Entsorgen Sie die Wäsche in einem Abfallbecherglas.Anschließend werden die gewaschenen Epithelfragmente in einem 125-Milliliter-Glaskolben mit rundem Boden mit einem 25-Millimeter-Rührstab und vorgewärmtem Inkubationsmedium gesammelt. Nach dem Sammeln der Gewebefragmente wird der Rundkolben mit einer Septe verschlossen. Und dann verwenden Sie Klammern, um das Setup an einem Ringständer zu befestigen.Führen Sie dann eine 20-Gauge-Spinalnadel in die Septen ein. Verbinden Sie die Septen mit einem Gummischlauch mit einem Sauerstofftank. Führen Sie 10 bis 15 Ausflussnadeln in die Septen ein, um einen Bruch zu verhindern, schalten Sie den Sauerstoffausfluss auf niedrig.Danach kalibrieren Sie das Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf einer Rührplatte für 30 bis 45 Minuten. Stellen Sie das Setup nach der Kalibrierung in das Wasserbad. Nach 15 Minuten Inkubation auf dissoziierte Drüsen prüfen.Nach der gewünschten Inkubationszeit geben Sie mit einer serologischen Pipette 15 Milliliter vorgewärmtes DMEMF12 in das Inkubationsmedium. Als nächstes filtrieren Sie das durch eine sterile Gaze erhaltene Drüsengemisch in vier konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Dann das Filtrat 15 Minuten lang auf Eis inkubieren.Dadurch kann sich die Verschraubung am Boden des konischen Rohrs absetzen. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um 40 Milliliter des Überstands von der Oberseite der Drüsensuspension zu verwerfen. Die restlichen 10 Milliliter der Glad-Mischung in 10 Millilitern DPBS, die mit Antibiotika ergänzt sind, resuspendieren.Verteilen Sie dann die gesamte Mischung in fünf Milliliter Zellkultur-Reagenzgläser. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 65 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig entfernen.Lösen Sie das erhaltene Drüsenpellet mit der gedachten Basalmembranmatrix mit einer breiten Pipettenspitze von 200 Mikrolitern auf. Mischen Sie die Suspension, bis sie homogen ist. Dann plattieren Sie die Drüsen mit Hilfe einer Pipette mit breiter Spitze in 15 Mikroliter der Basalmembranmatrix.Damit die Basalmembranmatrix polymerisiert, inkubieren Sie 10 bis 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann einen Milliliter hFGO-Medium in jede Vertiefung, wenn es in einer 12-Well-Kulturplatte kultiviert wird. Anschließend kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator.Wechseln Sie das Medium alle 45 Tage. Beginnen Sie nach sechs bis sieben Tagen der 3D-FGO-Kultur von Mäusen oder Menschen mit der Übertragung der 3D-Organoide auf die 2D-Monoschicht. Fügen Sie dazu einen Milliliter Calcium-Magnesium-freies DPBS in die Mitte der Blase hinzu, um die 3D-Basalmembranblase von der Platte zu lösen.Sammeln Sie dann die Basalmembranmatrix und das Organoidgemisch im Zellkulturröhrchen. Dann zentrifugieren Sie bei 40-fachem G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation wird ein Vakuumsystem verwendet, um den Überstand und so viel Basalmembranmatrix wie möglich zu entfernen.Lösen Sie dann das Pellet in vier Millilitern kalzium-magnesiumfreiem DPBS auf. Achten Sie darauf, nach der Ernte der Organoide so viel wie möglich von der Grundmatrix zu entfernen, um die Monoschicht vorzubereiten. Geben Sie anschließend einen Milliliter vorgewärmte Zellablösungslösung bei 37 Grad Celsius in jedes Reagenzglas.Mischen Sie dann den Inhalt der Tube, indem Sie ihn mehrmals umdrehen. Zum Schluss inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, geben Sie die zwei Milliliter Calcium-Magnesium-freies DPBS direkt in jedes der Reagenzgläser.Verwenden Sie dann eine 26-Gauge-Nadel, um die Suspension zwei- bis dreimal zu mischen. Nach dem Mischen zentrifugieren Sie die Zellsuspension und lösen Sie das Zellpellet in 2D-FGO-Medium auf. Um das gesamte Organoid zu erhalten, plattieren Sie die Zellsuspension auf beschichteten Platten.Dann inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für etwa vier Tage. Ändern Sie das Medium, wenn die Farbe gelb wird. Sobald die Kultur eine Konfluenz von 100 Prozent erreicht hat, kratzen Sie die Monoschicht mit einer Rasierklinge ein.Fixieren Sie dann die Monoschichten mit 3,7 Prozent Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Anschließend permeablizieren Sie die Monolayer mit Triton X-100 für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Permeablisierung die Monoschichten mit zwei Prozent Eselsserum eine Stunde lang blockieren.Nach einer Stunde Blockierung wird die Monoschicht über Nacht mit einer primären Antikörperlösung bei vier Grad Celsius inkubiert. Wickeln Sie die Monoschicht in Parafilm ein, um ein Verdunsten und Austrocknen der Kultur über Nacht zu vermeiden. Am nächsten Tag mit 0,1 Prozent nichtionischem Waschmittel in PBS waschen.Dann mit Sekundärantikörper inkubieren und 10 Mikrogramm pro Milliliter Wirtszellkerne eine Stunde lang bei Raumtemperatur färben. Als nächstes färben Sie die Zellen. Identifizieren Sie dann die Oberflächenschleimzellen in der vom Menschen stammenden 2D-Magenmonolayer-Kultur unter dem konfokalen Mikroskop.Nehmen Sie schließlich alle paar Stunden Bilder der Wunde auf. Diese Bilder aus der Zeitrafferanalyse zeigen die Bildung menschlicher FGOs. Diese Organoide werden auf eine Magenepithel-Monoschicht auf Basalmembranmatrix-kodierten Kammerobjektträgern übertragen.Die monoschicht des Magenepithels wird einen Tag lang alle acht Stunden analysiert. Das Bild zeigt, dass die Wundfläche immer kleiner wird und in der Kultur an nur einem Tag vollständig verschwindet. Diese Immunofloreszenzfärbung zeigt das Vorhandensein einer E-Cadherin-positiven Monoschicht, die aus den Oberflächenschleimzellen besteht.Dies deutet auf die Regeneration der Magenepithel-Monoschicht hin. Die vorhandenen Zellkerne sind mit Hoechst gefärbt. Anschließend wird die RTPCR-Analyse unter Verwendung von RNA durchgeführt, die aus der menschlichen Magenepithel-Monoschicht extrahiert wurde, um die Expression von Schleimhaut-, Häuptlings- und Schleimhalszellen der parietalen Oberfläche zu bestätigen.Das Vorhandensein von ATPa und PgC zeigt das Vorhandensein von Parietal- bzw. Hauptzellen. Das Vorhandensein von MUC5AC und MUC6 zeigt das Vorhandensein von Oberflächenschleimhaut- bzw. Schleimhalszellen. In diesem Immunfluoreszenzbild sind proliferierende Zellen in der humanen Magenepithel-Monolayer-Kultur durch die bereitwillige Aufnahme von EdU zu sehen.Diese Immunfluoreszenzbilder zeigen die Regeneration des Magenepithels und die Expression von Oberflächenschleimhaut- und Parietalzellen null, acht, 16 und 24 Stunden nach der Kratzwunde. Einmal gemeistert, kann der 3D-zu-2D-Transfer innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, wenn er richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, so viel wie möglich von der Basalmembranmatrix aus den geernteten Organoiden vor dem 2D-Transfer wegzuspülen.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Helicobacter-pylori-Infektion in Monolayern und Monolayer-Immunzell-Cokulturen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. Interaktionen zwischen Wirtspathogenen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Gastroenterologie, um Krankheiten und Regeneration im Magen zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichem Gewebe äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen wie sterile Technik und persönliche Schutzmaßnahmen getroffen werden sollten.

mouse-human-derived-primary-gastric-epithelial-monolayer-culture-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

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Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

Müller-Glia-Primärkulturen, die aus Mausnetzhaut gewonnen werden, stellen ein sehr robustes und zuverlässiges Werkzeug dar, um die Umwandlung von Gliazellen in retinale Vorläuferzellen nach einer microRNA-Behandlung zu untersuchen. Einzelne Moleküle oder Kombinationen können vor der anschließenden Anwendung von In-vivo-Ansätzen getestet werden.

Primäre Zellkulturen zur Untersuchung des Regenerationspotenzials von murinen Müller-Glia nach MicroRNA-Behandlung

Aus Magenpatienten stammende Organoide finden zunehmend Verwendung in der Forschung, jedoch fehlen formale Protokolle zur Erzeugung menschlicher Magenorganoide aus Einzelzellverdauen mit standardisierter Aussaatdichte. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur zuverlässigen Herstellung von Magenorganoiden aus Biopsiegewebe dar, das während der oberen Endoskopie gewonnen wurde.

Etablierung und Charakterisierung von patienteneigenen Magenorganoiden aus Biopsien des gutartigen Magenkörpers und des Antralepithels

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Abgeleitet von Maus und Mensch primäre gastrische Epithelzellen Monolayer Kultur for the Study of Regeneration

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