Name: Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Lernen Sie eine innovative RNA-In-Situ-Hybridisierungstechnik zur Visualisierung einzelner RNA-Moleküle im Nucleus accumbens von Ratten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung dopaminerger Dysfunktionen und geschlechtsspezifischer Unterschiede bei Drd1alpha-Expression.

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Die vorliegenden Werke wurden von der National Institutes of Health (NIH) Zuschüsse, HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 unterstützt. Partielle Fonds sorgte ein NIH T32 Ausbildung Stipendium in Biomedical-Behavioral Science.

Experimentelle Protokoll stimmte die Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der University of South Carolina (Bundesrepublik Qualitätssicherung Nummer: A3049-01).
1. Vorbereitung des frischen gefrorene Gehirn Abschnitte
<ol><li>Verwenden Sie die F344/N Ratten Belastung: drei Ratten beider Geschlechter, 13 Monate alt, Körpergewicht ca. 320 g.</li>
	<li>Passen Sie die Sevofluran Konzentration auf 5 % (Überdosierung von Sevofluran). Sevofluran Exposition nach Atmung stoppt für eine weitere Minute weiter.</li>
	<li>Die Ratte zu enthaupten und das Gehirn zu entfernen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Rattengehirn in flüssigem Stickstoff für 15 s innerhalb von 5 min Gewebe Ernte.</li>
	<li>Equilibrate das Gehirn auf-20 ° C in einem Kryostaten für 1 h.</li>
	<li>30 µm Abschnitte schneiden und übertragen auf Folien (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Der Nucleus Accumbens Region, ca. 2,76 mm 2,28 mm anterior Bregma14Abschnitte auswählen.</li>
	<li>Schneiden Sie Rattengehirn aus den Riechkolben kontinuierlich durch die Nucleus Accumbens Region nach der stereotaktischen Gehirnstruktur der Ratte.</li>
	<li>Montieren Sie die Proben auf die Folien. Halten Sie die Abschnitte bei-20 ° C für 10 min trocknen lassen.</li>
	<li>Sofort Tauchen Sie Folien in die vorgekühlt 4 % Paraformaldehyd für 1 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Legen Sie die Folien in einer zunehmenden Ethanol Steigung bei Raumtemperatur (RT): 50 % EtOH für 5 min; 70 % EtOH für 5 min; und 100 % EtOH für 5 Minuten.</li>
	<li>Wiederholen Sie dies mit frischen 100 % EtOH.</li>
	<li>Folien auf Küchenpapier legen und an der Luft trocknen.</li>
	<li>Zeichnen Sie eine Barriere um jeden Abschnitt mit einem Barriere-Stift (siehe Tabelle der Materialien). Lassen Sie die Barriere für 1 min vollständig trocknen.</li>
</ol>2. Vorbehandlung des Gehirns Abschnitte
<ol><li>Schalten Sie den Ofen und stellen Sie die Temperatur auf 40 ° C.</li>
	<li>3 Tropfen (90 µL) Vorbehandlung 4 Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) auf jedes Gehirn Prüfungsteil (eine pro Folie).</li>
	<li>Die Abschnitte für 30 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie die Folien mit 1 X PBS-Puffer für 1 min bei RT. Repeat mit frischen 1 X PBS. Hinweis: Dias sollte nicht mit 1 X PBS-Puffer für länger als 15 Minuten bleiben.</li>
</ol>3. RNA In Situ Hybridisierung fluoreszierende Multiplex-Assays
<ol><li>Erwärmen Sie die Ziel-Sonde für 10 min bei 40 ° C im Wasserbad und kühlen Sie ab, RT</li>
	<li>Legen Sie die RNA-Reagenz (z. B. Amp 1-4 FL) bei RT</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Geben Sie 3 Tropfen (90 µL) der Drd1α Sonde (C1) auf die Probe-Scheibe. 2 h bei 40 ° c inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 Minuten bei RT Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) von Amp 1-FL auf die Probe-Scheibe. 30 min bei 40 ° c inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie Folien in 1 Waschpuffer für 2 min bei RT. Repeat mit frischen 1wash-Puffer.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) des Amp 2-FL auf die Probe-Scheibe. 15 min bei 40 ° c inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 Minuten bei RT Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) von Amp 3-FL auf die Probe-Scheibe. 30 min bei 40 ° c inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 min bei RT. Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den Folien mit saugfähigem Papier und Ort wieder auf die Folie-Rack (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Fügen Sie 3 Tropfen (90 µL) von Amp 4-FL-Alt A auf die Probe-Scheibe. 15 min bei 40 ° c inkubieren</li>
	<li>Tauchen Sie Folien in 1 x Waschpuffer für 2 Minuten bei RT Repeat mit frischen 1 x Waschpuffer.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus Folien und sofort 2 Tropfen Reagenz Montage (siehe Tabelle der Materialien) auf jedem Abschnitt.</li>
	<li>Ein 22 mm-22 mm-Deckglas zu platzieren (siehe Tabelle der Materialien) über jeden Abschnitt des Gehirns.</li>
	<li>Lagern Sie Folien im Dunkeln bei 2 bis 8 ° C trocken.</li>
	<li>Schalten Sie das konfokale Mikroskop und wechseln Sie zu einem 60 X Objektiv.</li>
	<li>Z-Stapel Bilder mit einem konfokalen Mikroskop zu erhalten. Sehen Sie das ergänzende Video für ein Detail-Verfahren der konfokalen Abbildung.</li>
	<li>Bilder von Drd1α Zellen in der Nucleus Accumbens Region beschriftet (Anregung: 488 nm; Emission: 515/30 nm). Hinweis: Nicht in lassen Sie Gehirn, die Abschnitte zwischen Inkubationsschritte austrocknen.</li>
</ol>(4) Datenanalyse
<ol><li>Semi-quantitativ analysieren die Färbung Muster: "diskrete Punkte".<ol>
<li>Um die einzelnen Zelle aus dem Bild zu erkennen, führen Sie DAPI-Färbung als nukleare Marker. Es ist jedoch nach wie vor schwierig, bestimmte Teile des Gehirngewebes zu analysieren, da es mehrere Arten von Zellen mit unregelmäßiger Form von Kernen und/oder Zellen hat. Hier ordnen zwei erfahrene Forscher separat jede Zelle von Bildern zu Zelle definieren.</li>
		<li>Punkten Sie optisch jede Zelle innerhalb der repräsentativen konfokale Bilder basierend auf der Anzahl der Punkte pro Zelle anhand spezifischer Kriterien (Abbildung 1 b).</li>
		<li>Bestimmen Sie die Ergebniszelle Anzahl in jeder Kategorie und dividieren durch die Anzahl der Ergebniszelle X100, relative Häufigkeit Diagramme erstellen, die die prozentuale Häufigkeit der Zellen innerhalb jeder Kategorie für alle Gewebeschnitte (Abbildung 2A) und für Männer und Frauen anzeigen separat (Abb. 2E).</li>
		<li>Teilen Sie die Summe der Zellen in allen vorherigen Kategorien durch die Ergebniszelle Anzahl X100 die kumulative Häufigkeit von Zellen für alle Gewebeschnitte (Abb. 2 b) und für Männer und Frauen getrennt zu bestimmen (Abb. 2F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die "diskrete Punkte" Färbung Muster (Optional) statistisch zu analysieren.<ol>
<li>Prüfen Sie die Anzahl der Punkte pro Zelle zu einer kategorialen Variablen, die in der Natur (d. h. die Anzahl der Zellen, die vom niedrigsten Zelle Ausdruck (1) zum höchsten Zelle Ausdruck (9) in jeder Rang Kategorie fallen) ordinal ist für weitere statistische Auswertungen.</li>
		<li>Nach Prüfung der deskriptiven Statistik verwenden drei Ansätze: eine Mantel-Haenszel-Statistik, ein Mann-Whitney U-Test und Kruskal-Wallis-Test. Obwohl der genaue statistische Ansatz abhängig sein wird kann die experimentellen Design und Forschung Frage von Interesse, eine statistische Entscheidungsbaum (Abbildung 4) Hilfe bei Entscheidungen bezüglich des analytischen Ansatzes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizieren der Signalintensität in der Region of Interest (ROI) für das Beflecken Muster: "Cluster".<ol>
<li>Berechnen Sie die Signalstärke der einzelnen Bilder unter Verwendung der folgenden Gleichung: Signal-Intensität = Gesamtintensität des ROI Bild - (durchschnittliche Intensität × Gesamtbild Hintergrundbereich)</li>
		<li>Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen innerhalb von ROI-Bild, um den ungefähren Signal Ausdruck pro Zelle zu berechnen. Gruppenunterschiede in Signal Intensität/Bild sowie die Anzahl der Zellen/Bild möglicherweise von Interesse Mechanismen zu berücksichtigen, die zur Gruppenunterschiede in Signal Ausdruck/Zelle beitragen können (Abb. 3 b-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die "Cluster" Färbung Muster (Optional) statistisch zu analysieren.<ol>
<li>Untersuchen Sie die Signal Ausdruck/Zelle, um eine kontinuierliche Variable für weitere statistische Auswertungen zur Verfügung zu stellen. Verwenden Sie zwei Ansätze, inklusive einer unabhängigen Stichproben t-Test und Varianzanalyse (ANOVA), basierend auf der Anzahl der Faktoren zwischen Themen in die Gestaltung einbezogen. Ein statistische Entscheidungsbaum (Abb. 4) kann helfen bei der Entscheidungsfindung bezüglich der am besten geeignete statistische Ansatz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia%3A+insights+for+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li>
<li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology%2C+signaling%2C+and+pharmacology+of+dopamine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li>
<li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li>
<li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li>
<li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li>
<li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition%3A+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li>
<li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li>
<li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li>
<li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li>
<li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li>
<li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).</li>
</ol>

Es gibt keine Interessenkonflikte zu erklären.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine neuartige Technik der in Situ Hybridisierung für Tiefkühlfrische Gehirnscheiben, Drd1α-Rezeptor-Expression in dem Nucleus Accumbens (NAc) und Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Ausdruck in der Substantia Nigra (SNR) Region zu bewerten. Wir bieten auch Methoden der Datenanalyse für unterschiedliche Färbung Muster: "diskrete Dot" oder "Cluster".
Die entscheidenden Schritte für einen erfolgreichen Multiplex-Fluoreszenz RNA-Assay in Situ Hybridisier...

Dysfunktion des striatalen Dopamin-Systems beteiligt sich das Fortschreiten der klinischen Symptome bei mehreren neurokognitiven Krankheiten beobachtet. Dopamin-D1-Rezeptoren sind in den präfrontalen Kortex (PFC) und striatalen Regionen des Gehirns und stark beeinflussen kognitive Prozesse1, einschließlich der Verwendung von Speicher, zeitliche Verarbeitung und Lokomotive Verhalten2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. frühere Studien aufgeklärt, dass Änderungen der Dopaminrezeptoren D1 verbunden mit dem Fortschreiten der Aufmerksamkeit Defizit-Hyperaktivität-Störung (ADHS)8, die neurokognitiven Symptome bei Schizophrenie9, waren 10 und Stress Anfälligkeit11. Insbesondere bei Schizophrenie zufolge Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Studien die Bindungsfähigkeit der Dopamin-D1-Rezeptoren in den präfrontalen Cortex hoch mit kognitiven Defiziten und die Anwesenheit von negativen Symptomen11zusammenhing. Das dendritische Wachstum der exzitatorischen Neuronen im präfrontalen Cortex von Dopamin D1-Rezeptor reguliert lindert Stressempfindlichkeit. Darüber hinaus könnte die Knockdown von D1-Rezeptor im medialen präfrontalen kortikalen (mPFC) Neuronen soziale Niederlage Stress-induzierte soziale Vermeidung12verbessern.
Hier stellen wir eine neuartige Technik der RNA in Situ Hybridisierung, einzelnen RNA-Moleküle in einer Zelle mit Tiefkühlfrische Gewebeproben zu visualisieren. Das vorliegende Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber Methoden, die in der aktuellen Literatur vorhanden sind. Zuerst die aktuelle Prozedur bewahrt den räumlichen und morphologischen Kontext des Gewebes und wurde am Tiefkühlfrische Gewebeproben durchgeführt, so dass andere Verfahren, die frische, nicht eingebettete Gewebe mit den aktuellen Methoden kombiniert werden können. Ähnliche Verfahren in Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Gewebe haben gezeigt, dass einzelne Transkription Auflösung mit einer RNA in Situ Hybridisierung Technik13erreicht werden kann. Erkennung von RNA Ebene der einzelnen Transkription bietet höhere Sensitivität zu niedrigen Kopie Zahlenausdruck sowie die Möglichkeit, Genexpression auf der Ebene einzelner Zellen vergleichen, die von anderen Nukleinsäure-Nachweismethoden nicht erreicht werden kann, wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Techniken. Darüber hinaus unterhält die aktuelle Methode Bilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis durch hochspezifische RNA-Sonden, die hybridisiert, einzelnes Ziel-RNA-Transkripte und nacheinander gebunden mit einer Kaskade von Signalmolekülen Verstärkung bei der Erkennung System. Zu guter Letzt bietet die gegenwärtige Technologie die Möglichkeit, mehrere biologische Systeme mit der Target-spezifische proprietären Sonden, anstatt unsere Untersuchung auf nur eine Klasse von systembezogenen Markierungen wie Proteindetektion durch Begrenzung zu bewerten immunhistochemische Methoden.
In unserer Studie haben wir diese neuartige RNA in Situ Hybridisierung, um Drd1α-Rezeptor-Expression in dem Nucleus Accumbens (NAc) und Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Ausdruck in der Substantia Nigra (SNR) zu bewerten sowohl weibliche als auch männliche F344/N Ratten verwendet. Die innovative RNA in Situ Hybridisierung konnten wir Mechanismen beeinflussen DA Aufnahme und DA Freigabe gleichzeitig, ein besseres Verständnis der Komplexität der striatalen DA System zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Vorgehensweise Tiefkühlfrische Gehirn Scheiben und Methoden der Datenanalyse für unterschiedliche Färbung Muster: "diskrete Dot" oder "Cluster".

<table><tbody><tr><td>HybEZ Ofensystem</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik&nbsp;</td><td>310010</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Sonde - Rn-Drd1a</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik&nbsp;</td><td>317031</td><td>Farbkanal 1, Grüne</td></tr><tr><td>RNAscope-Sonde - Rn-Th-C2</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>314651-C2</td><td>Farbkanal 2, Orange</td></tr><tr><td>RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Reagenzien-Kit</td><td>für erweiterte Zelldiagnostik&nbsp;</td><td>320850</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophober Barrierestift</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sevofluran</td><td>Merritt Veterinärbedarf</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek vertikales Gestell mit 24 Objektträgern</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9837976</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Färbeschale</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0731403</td><td></td></tr><tr><td>Precision Allzweckbäder</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSGP28</td><td></td></tr><tr><td>Vorbehandlung 4</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik&nbsp;</td><td>320850</td><td>Teile von Kits</td></tr><tr><td>ProLong Gold Anti-Fade-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Amp 1-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>Teile der Kits</td></tr><tr><td>Amp 2-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>Teile der</td></tr><tr><td>Kits Amp 3-FL</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>Teile von Kits</td></tr><tr><td>Amp 4-FL-Alt A</td><td>Advanced Cell Diagnostics&nbsp;</td><td>320850</td><td>Teile von Kits</td></tr><tr><td>EZ-C1 Softwarepaket</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Version 3.81b</td></tr><tr><td>SAS/STAT Software</td><td>SAS Institute, Inc.,</td><td></td> <td>Version 9.4</td></tr></tbody></table>

identifizierung von dopamin-d1-alpha-rezeptor im nagetier nucleus accumbens durch eine innovative rna- in situ -detection-technologie

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In das zentrale Nervensystem ist der D1-Alpha-Rezeptor Subtyp (Drd1α) die am häufigsten vorkommende Dopamin (DA)-Rezeptor, der spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der neuronale Wachstum und Entwicklung. Die Mechanismen, die Drd1α Rezeptor Anomalien Vermittlung Verhaltensreaktionen und modulierende Working Memory-Funktion sind jedoch noch unklar. Mit einem neuartigen RNA in Situ Hybridisierung Assay, identifiziert die aktuelle Studie Drd1α Dopamin Rezeptor und Tyrosin Hydroxylase (TH) RNA Ausdruck von DA-bezogene Schaltungen in den Nucleus Accumbens (NAc) Bereich und Substantia Nigra Region (SNR), bzw.. Drd1α Ausdruck in der NAc zeigt einen "diskrete Dot" Färbung Muster. Deutliche Geschlechtsunterschiede in Drd1α Ausdruck wurden beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigt TH ein "gruppierte" Färbung Muster. Zu TH Ausdruck angezeigt weibliche Ratten einen höheren Signal Ausdruck pro Zelle im Vergleich zu männlichen Tieren. Die hier vorgestellten Methoden bieten eine neuartige in Situ Hybridisierung Technik für die Untersuchung von Veränderungen der Dopamin-System Funktionsstörung während das Fortschreiten der Erkrankungen des zentralen Nervensystems.

Die aktuelle Studie beobachtet eine "diskrete Punkte" Färbung Muster für RNA-Expression in den Dopamin-D1-Alpha-Rezeptoren (Drd1α) von der NAc in F344/N Ratten (Abbildung 1A). Einzelnen Fluoreszenz Signale waren leicht zu erkennen und zu sehen als einzigen "Dots", von denen jede einen einzelnen RNA-Transkript innerhalb der Zelle darstellt. Für Bilder von der NAc, die die "diskrete Punkte" Färbung Muster zeigen, untersuchten wir den dynamischen Bereich des Aus...

Identifikation der Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor in dem Nucleus Accumbens ist von entscheidender Bedeutung für die Klärung von D1-Rezeptor Dysfunktion während eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Wir haben einen neuartigen RNA in Situ Hybridisierung-Assay um einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnareal zu visualisieren.

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Das übergeordnete Ziel dieses neuartigen RNA-in-situ-Hybridisierungsassays ist es, einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnbereich sichtbar zu machen, die für die Klärung der dopaminergen Dysfunktion während einer Erkrankung des Zentralnervensystems entscheidend sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. dopaminerge Anomalien, die Verhaltensreaktionen vermitteln und die Arbeitsgedächtnisfunktion modulieren. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine neuartige in-situ-Hybridisierungstechnik zur Untersuchung der Dysfunktion des Dopaminsystems während des Fortschreitens von Erkrankungen des Zentralnervensystems bietet.Obwohl diese Methode einen Einblick in die Gesamtexpression einer Ziel-mRNA in einer bestimmten Gehirnregion geben kann, kann sie auch angewendet werden, um zu bestimmen, wie mRNA-Transkripte in den Zellen einer bestimmten Region verteilt sind. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauchen Sie ein erwachsenes Rattengehirn innerhalb von fünf Minuten nach der Entnahme 15 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff. Als nächstes wird das Gehirn eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius in einem

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Dieses Video zeigt die Implantation von Elektroden und Kanülen in einer anästhesierten Ratte, um die Dopaminfreisetzung im Nucleus accumbens mit einem Potentiostaten und die Infusion von Medikamenten zur Modulation der dopaminergen Aktivität im ventralen tegmentalen Bereich zu messen.

Überwachung der Dopaminfreisetzung in einem Rattenmodell mit VTA-Manipulation des dopaminergen Neuronenrezeptors

Dieses Video zeigt den Nachweis der Serotoninrezeptor-RNA-Synthese mit Hilfe von Oligonukleotidsonden in Rattenhirngewebe, das vom Serotonin-Syndrom betroffen ist. Das Protokoll umfasst eine Gewebevorbehandlung, Sondenhybridisierung und enzymatische Detektion, um die RNA-Expression von Serotoninrezeptoren unter einem Mikroskop sichtbar zu machen und zu quantifizieren.

In-situ-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden zur Untersuchung der RNA-Expression in Hirnschnitten von Ratten

Das Ziel dieser Publikation ist es, sichtbar zu machen und zu diskutieren, die operativen Schritte einer Enhanced Northern Blot-Protokoll auf RNA aus Drosophila melanogaster Embryonen entnommen, Zellen und Geweben. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für eine effiziente Erkennung von kleinen RNA-Spezies.

Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster

Die Isolierung der einzelnen Dopamin-Neuronen oder der ventralen Haubengebiet mit direkter oder indirekter Immunhistochemie nutzt Laser Mikrodissektion demonstriert. Parameter für die Isolierung von Gewebe aus einem Glasobjektträger unter Verwendung eines Infrarotlasers und aus Membran Folien unter Verwendung der Kombination eines Infrarot und Ultraviolett-Lasers diskutiert.

Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

Bei der Parkinson-Krankheit (PD), Substantia Nigra (SNC) dopaminergen Neuronen degenerieren, was zu Motorstörungen. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Kultivierung von ventralen Mittelhirns Neuronen aus einer Maus eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase (TH) Promotorsequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen, und die Messung ihrer Transkriptom RNA-seq verwenden.

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung, Detektion, Analyse und Verfolgung des endogenen mRNA-Handels in der lebenden Drosophila melanogaster Eikammer mit molekularen Baken, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und Open-Source-Analyse vor. software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Hier stellen wir eine automatisierte Methode zur semi-quantitativen Bestimmung der dopaminergen Neuronenzahl in der Rattensubantia nigra pars compacta vor.

Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Multiplex in situ Hybridisierung (ISH) wurde verwendet, um gleichzeitig die Transkripte für zwei G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und einen Transkriptionsfaktor im gesamten vagalen ganglionären Komplex der erwachsenen Maus zu visualisieren. Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um genaue Karten der Transkriptionsprofile von vagalen afferenten Neuronen zu erstellen.

Nachweis der G-Protein-gekoppelten Rezeptorexpression in vagalen afferenten Neuronen der Maus mittels Multiplex-In-situ-Hybridisierung

Diese Studie präsentiert eine robuste Methode zur Isolierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraneinsätze, wodurch die Trennung von totalen Neuronen versus Neuriten und RNA-Reinigung ermöglicht wird. In Kombination mit RTddPCR ermöglicht der Ansatz eine absolute Quantifizierung von Low-Copy-Transkripten, was Studien zum mRNA-Transport und der lokalen Übersetzung mit hoher Sensitivität, Reproduzierbarkeit und breiter experimenteller Anwendbarkeit erleichtert.

Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR

Lernen Sie eine innovative RNA-In-Situ-Hybridisierungstechnik zur Visualisierung einzelner RNA-Moleküle im Nucleus accumbens von Ratten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung dopaminerger Dysfunktionen und geschlechtsspezifischer Unterschiede bei Drd1alpha-Expression.

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie (Video) | JoVE Journal

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

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