Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

Das übergeordnete Ziel dieses neuartigen RNA-in-situ-Hybridisierungsassays ist es, einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnbereich sichtbar zu machen, die für die Klärung der dopaminergen Dysfunktion während einer Erkrankung des Zentralnervensystems entscheidend sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. dopaminerge Anomalien, die Verhaltensreaktionen vermitteln und die Arbeitsgedächtnisfunktion modulieren. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine neuartige in-situ-Hybridisierungstechnik zur Untersuchung der Dysfunktion des Dopaminsystems während des Fortschreitens von Erkrankungen des Zentralnervensystems bietet.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Gesamtexpression einer Ziel-mRNA in einer bestimmten Gehirnregion geben kann, kann sie auch angewendet werden, um zu bestimmen, wie mRNA-Transkripte in den Zellen einer bestimmten Region verteilt sind. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauchen Sie ein erwachsenes Rattengehirn innerhalb von fünf Minuten nach der Entnahme 15 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff. Als nächstes wird das Gehirn eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius in einem Kryostaten äquilibriert.

Schneiden Sie nach einer Stunde 30-Mikrometer-Schnitte mit Nucleus accumbens von 2,76 Millimeter bis 2,28 Millimeter vor dem Bregma und montieren Sie sie auf die Objektträger. Anschließend trocknen Sie die Abschnitte bei minus 20 Grad Celsius für 10 Minuten. Tauchen Sie die Objektträger anschließend eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in vorgekühltes 4%-Paraformaldehyd.

Legen Sie dann die Objektträger in einen ansteigenden Ethanolgradienten bei Raumtemperatur und geben Sie die Objektträger für weitere fünf Minuten in frisches 100%iges Ethanol. Legen Sie anschließend die Objektträger auf das saugfähige Papier, um sie an der Luft trocknen zu lassen. Zeichnen Sie mit einem Barrierestift eine Barriere um jeden Abschnitt.

Lassen Sie die Barriere eine Minute lang vollständig trocknen. Um die Hirnabschnitte vorzubehandeln, schalten Sie den Ofen ein und stellen Sie die Temperatur auf 40 Grad Celsius ein. Geben Sie drei Tropfen Reagenz vor der Behandlung auf jeden Gehirnabschnitt.

Dann inkubieren Sie die Schnitte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Tauchen Sie dann die Objektträger eine Minute lang bei Raumtemperatur in 1X PBS und übertragen Sie die Objektträger für eine weitere Minute in frisches 1X PBS. Folien sollten nicht länger als 15 Minuten in 1X PBS bleiben.

Um den Multiplex-Assay durchzuführen, erwärmen Sie die Zielsonde 10 Minuten lang bei 40 Grad Celsius in einem Wasserbad und kühlen Sie sie dann auf Raumtemperatur ab. Bringen Sie das RNA-Reagenz bei Raumtemperatur. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit saugfähigem Papier von den Objektträgern und legen Sie sie wieder auf das Objektträgergestell.

Geben Sie dann drei Tropfen des Drd1alpha als Sonde auf jede Probenscheibe und inkubieren Sie die Proben zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger anschließend zweimal zwei Minuten lang in 1X Waschpuffer bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann mit saugfähigem Papier überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern und legen Sie sie wieder auf das Objektträgergestell.

Lassen Sie die Hirnabschnitte zwischen den Inkubationsschritten nicht austrocknen. Geben Sie drei Tropfen AMP 1FL auf jede Probenscheibe und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger anschließend zweimal zweimal für jeweils zwei Minuten bei Raumtemperatur in 1X Waschpuffer.

Entfernen Sie dann mit saugfähigem Papier überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern und legen Sie sie wieder auf das Objektträgergestell. Geben Sie anschließend drei Tropfen AMP 2FL auf jede Probenscheibe. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 40 Grad Celsius.

Tauchen Sie die Objektträger anschließend zweimal zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in 1X Waschpuffer. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit saugfähigem Papier von den Objektträgern und legen Sie sie wieder auf das Objektträgergestell. Geben Sie drei Tropfen AMP 3FL auf jede Probenscheibe und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius.

Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in 1X Waschpuffer. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit saugfähigem Papier von den Objektträgern und legen Sie sie wieder auf das Objektträgergestell. Geben Sie dann drei Tropfen AMP 4FL ALT A auf jede Probenscheibe und inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 40 Grad Celsius.

Waschen Sie den Objektträger zweimal zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in 1X Waschpuffer. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern und geben Sie sofort zwei Tropfen Einbettreagenz auf jeden Abschnitt. Legen Sie als Nächstes ein 22 Millimeter x 22 Millimeter großes Deckglas über jeden Gehirnabschnitt.

Anschließend lagern Sie die Dias im Dunkeln bei zwei bis acht Grad Celsius bis zum Trocknen. Schalten Sie für die Bildgebung das Konfokalmikroskop ein und wechseln Sie zu einem 60-fach-Objektiv. Erhalten Sie Z-Stapel-Bilder und erfassen Sie Bilder von Drd1alpha-markierten Zellen in der Region des Nucleus accumbens.

Für Bilder aus dem Nucleus accumbens, die das Färbemuster der diskreten Punkte zeigten, wurde der dynamische Expressionsbereich mit einer semiquantitativen Analyse bewertet. Jede Zelle wurde basierend auf der Anzahl der Punkte pro Zelle von null bis neun bewertet. Diese hybridisierte Signal-Score-Methode kann somit das Ausmaß und die Variabilität der Drd1alpha-Expression über einzelne Zellen hinweg bewerten.

Hier sind die repräsentativen konfokalen Bilder der Drd1alpha-Expression bei männlichen und weiblichen Ratten, die das Färbemuster der diskreten Punkte aufweisen. Um die verschachtelte Datenstruktur zu berücksichtigen, wurden für jede Kategorie durchschnittliche Zählwerte berechnet und für die statistische Analyse verwendet. Ein Mann-Whitney U-Test wurde durchgeführt, um Unterschiede in der medianen Zellzahl bei männlichen und weiblichen Ratten zu bewerten.

Die Häufigkeit der Zellen in jeder Kategorie wird anhand der relativen Häufigkeit und der kumulativen Häufigkeit analysiert. Weibliche Tiere zeigten eine signifikante Verschiebung in der Verteilung, wobei die Häufigkeit von Zellen in niedrig geordneten Kategorien im Vergleich zu männlichen Tieren größer war. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf deutliche Geschlechtsunterschiede in der Drd1alpha-Expression im Nucleus accumbens hin.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, schnell zu arbeiten, da Temperaturänderungen oder das Austrocknen des Gewebes die mRNA schädigen und unsere Fähigkeit, ein zuverlässiges Signal zu erhalten, beeinträchtigen können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die In-situ-Hybridisierungstechnik in kortikalen Geweben durchführen, Signal-mRNA-Transkripte in ausgewählten Gehirnregionen fluoreszierend abbilden und die Verteilung von mRNA-Transkripten für die statistische Analyse charakterisieren.