Experimentelles Protokoll für die Verwendung von Drosophila als ein Wirbellosen Modellsystem für Toxizitätstests im Labor

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Giftstoffen auf die Fitness in verschiedenen Entwicklungsstadien zu verstehen und die Auswirkungen der Exposition gegenüber Schadstoffen über Generationen hinweg zu untersuchen. Das Verfahren wird von zwei Studenten in meinem Forschungslabor demonstriert, die Teil der Gemeinschaften zum Aufbau eines aktiven MINT-Engagements an der Colorado State University Pueblo sind, Hugh Long und Tyler Harvey. Um mit einer Umweltkontaminante von Interesse zu arbeiten, bestimmen Sie zunächst die 50%ige tödliche Dosis der Verbindung Drosophilie.

Verwenden Sie etablierte Methoden, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen. Bereiten Sie anschließend das Wachstumsmedium mit der Verbindung in der gewünschten Konzentration vor. Fügen Sie die Verbindung zum Beispiel im Wasser aliquot hinzu, wenn Sie Instantmedium herstellen.

Parallel dazu ist das Kontrollmedium ohne die zugesetzte Verbindung herzustellen. Um die Kultur für die Entnahme von Versuchstieren einzurichten, werden die reproduktiven adulten Tiere mit Standardmethoden auf das Wachstumsmedium übertragen. Standardisieren Sie die Anzahl der Fliegen pro Fläschchen und vermeiden Sie eine Überfüllung der erwachsenen Tiere.

Inkubieren Sie die Fliegen dann unter Standardbedingungen für ein bis vier Tage. Nach der Inkubation werden die erwachsenen Tiere verworfen und befruchtete Eizellen zur Reifung für die Tests zurückgelassen. Geben Sie dann die Fläschchen wieder in den Inkubator zurück.

Die Belichtung kann in jedem Entwicklungsstadium eingerichtet werden. Darüber hinaus können je nach Versuchszielen Versuchspersonen in jedem Entwicklungsstadium gesammelt werden. Kontrollieren Sie die sich entwickelnden Tiere täglich, um die ersten Anzeichen des interessierenden Stadiums zu erkennen, wie z. B. wandernde Larven des dritten Stadiums.

Um die Auswirkungen der Exposition auf das wandernde Larvenstadium des dritten Stadiums zu testen, sammeln Sie die Larven innerhalb einer Stunde nach dem Einschalten des Lichts, wenn sie beginnen, aus dem Futtersubstrat zu schlüpfen. Gießen Sie dann das Wasser aus und legen Sie die Larven in ein Labortuch, um überschüssiges Wasser vorsichtig zu entfernen. Nach dem Trocknen werden die Larven zur Entnahme in die entsprechenden Röhrchen gegeben.

Um die Auswirkungen der Exposition auf Erwachsene zu testen, sammeln Sie die neu geschlossenen Erwachsenen; Eine Kohlendioxid-Anästhesie ist in Ordnung. Achten Sie darauf, die Fliegen zu sammeln, bevor sie reproduktiv ausgewachsen sind und mit der Paarung beginnen. Teilen Sie die Fliegen in geschlechtsspezifische Gruppen ein und setzen Sie sie in Fläschchen um, die mit dem Kontrollmedium oder experimentell kontaminiertem Medium beladen sind, um der bereits bestehenden Exposition zu entsprechen.

Später, 24 Stunden vor der Messung der Schadstoffe in den erwachsenen Fliegen, übertragen Sie die erwachsenen Fliegen sowohl im Kontrollmedium als auch im kontaminierten Medium in ein mit Kontrollmedium beladenes Fläschchen, damit die erwachsenen Tiere überschüssiges Medium von ihrem Körper entfernen können. Nach 24 Stunden Fellpflege können die Fliegen mit der entsprechenden Methode getestet werden. Zum Beispiel können Verhaltensänderungen mit einem Paarungswahl-Assay getestet werden.

Mit diesen Methoden lassen sich die transgenerationalen Auswirkungen der Schadstoffbelastung sehr einfach untersuchen. Richten Sie einfach Kreuzungen zwischen exponierten Erwachsenen auf dem Kontrollmedium ein und untersuchen Sie die Auswirkungen der Fnot-Exposition auf ihre Nachkommen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Akkumulation, Eliminierung und Sequestrierung von Blei innerhalb derselben Nachkommengeneration zu bewerten.

Drosophila akkumulierte leicht Blei in verschiedenen Dosen, Entwicklungsstadien und evolutionären Skalen. Anhand einer Mehrgenerationen-Exposition wurde festgestellt, dass die elterliche Exposition nicht auf die erste Generation erwachsener Nachkommen übertragen wird. Daher ist es mit Hilfe dieses Protokolls möglich, adaptive Reaktionen auf verschiedenen evolutionären Skalen sowie transgenerationale Effekte der Exposition zu testen.

Als nächstes wurden die Fliegen vom Eistadium bis zum Erwachsenenalter auf Kontroll- oder Bleimedium aufgezogen und nach 24 Stunden Depuration getestet, wobei die Partnerpräferenz getestet wurde. Weibchen, die auf bleihaltigem Medium aufgezogen wurden, paarten sich bevorzugt mit bleiexponierten Männchen gegenüber kontrollexponierten Männchen. Auf der anderen Seite zeigten Männer nicht die gleiche Voreingenommenheit.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Drosophila aufzieht und sammelt, um verschiedene Fragen und Toxikologie zu beantworten. Einmal gemeistert, kann dieses Protokoll in ein bis zwei Monaten durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Fliegen vorsichtig zu behandeln, um keinen unnötigen Stress zu verursachen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Fragen wie verhaltensbezogene, genetische und neurologische Fragen getestet werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Verunreinigungen äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und das Vorbereiten von Verunreinigungen in einer Haube.