Bildgestützte Resektion der Glioblastom und intrakraniellen Implantation von therapeutischen Stammzellen entkernt Gerüste

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Hirntumor bei Mäusen chirurgisch zu resezieren und ein Gerüst mit tumor-homing-therapeutischen Stammzellen in die postoperative Resektionshöhle zu implantieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Zelltherapie und Neuroonkologie zu beantworten, z. B. wie sich die chirurgische Resektion auf die Zellimplantation in die Operationshöhle auswirkt, wie wirksam neue Therapeutika bei postoperativen Hirntumoren sind und wie gerüstbasierte Verabreichungssysteme die Therapieergebnisse beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Hirntumor-Interventionen an Mäusen auf eine Weise untersucht werden können, die dem klinischen Behandlungsstandard bei menschlichen Patienten sehr nahe kommt.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Stammzelltherapie auf dem Gerüst geben kann, kann sie auch auf andere Interventionen wie Nanopartikel, kleine Moleküle, onkolytische Viren oder andere neue Therapien angewendet werden. Bereiten Sie die Gerüste 48 Stunden vor der Implantation bei Mäusen vor, indem Sie die PLA-Gerüste zunächst in resektionshohlraumgroße Stücke von etwa zwei mal zwei Millimetern schneiden. Sterilisieren Sie die Gerüste, indem Sie sie 15 Minuten lang in 70%iges Ethanol eintauchen.

Tauchen Sie die Gerüste nach 15 Minuten in PBS. Platzieren Sie dann die Gerüste in Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium, das 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, während Sie die Zellen für die Aussaat vorbereiten. Um die Zellen vorzubereiten, heben Sie zunächst kultivierte MSCs mit 0,05 % Trypsin an.

Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie nach der Inkubation sicher, dass sich die Zellen angehoben haben. Geben Sie dann DMEM in den Kolben, um das Trypsin zu inaktivieren.

Übertragen Sie dann den Kolbeninhalt in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Pelletieren Sie dann fünf mal 10 bis zu den fünften MSCs für jedes Gerüst durch Zentrifugation bei 100 mal g für fünf Minuten.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand aspiriert und die MSCs in fünf Mikrolitern DMEM pro fünfmal 10 Zellen resuspendiert. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette ein Gerüst aus der DMEM-Immersion und legen Sie es auf den Deckel der Sechs-Well-Platte. Heben Sie das Gerüst vom Deckel ab und hinterlassen Sie ein Tröpfchen überschüssiges DMEM.

Stellen Sie das Gerüst wieder auf den Deckel an einem neuen, trockenen Ort. Wiederholen Sie dies drei- bis fünfmal. Legen Sie dann das teilweise getrocknete Gerüst für die Aussaat in eine neue Sechs-Well-Platte.

Ein teilgetrocknetes Gerüst sorgt für optimale Ergebnisse bei der Zellaussaat. Wenn das Gerüst zu nass ist, rutschen die Zellen vom Gerüst und haften an der darunter liegenden Platte. Wenn das Gerüst zu trocken ist, breitet sich das Tröpfchen nicht über das gesamte Gerüst aus, was zu einer schlechten anfänglichen Zellverteilung führt.

Mischen Sie das Röhrchen mit den MSCs vorsichtig mit einer Pipette, um die Suspension zu homogenisieren, da sich einige Zellen möglicherweise am Boden abgesetzt haben. Pipettieren Sie langsam 2,5 Mikroliter frisch gemischte MSC-Suspension direkt auf das Gerüst, so dass ein kleiner Tropfen über dem Gerüst entsteht. Geben Sie 300 Mikroliter DMEM an die Ränder jeder Vertiefung, um eine schnelle Verdunstung des Zelltröpfchens zu verhindern.

Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Zellen an das Gerüst anheften können. Drehen Sie die Gerüste nach der Inkubation mit einer Pinzette vorsichtig in der Vertiefungsplatte um. 2,5 Mikroliter frisch gemischte MSC-Suspension aussäen, um insgesamt fünfmal 10 auf die fünften Zellen pro Gerüst zu geben.

Nach einer Inkubation von 30 Minuten, damit sich die Zellen an das Gerüst anheften können, bedecken Sie die Gerüste mit DMEM, indem Sie zwei Milliliter in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte geben. Heben Sie die Gerüste vorsichtig an, damit das Medium darunter fließen kann. Inkubieren Sie in diesem Zustand 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius vor der Implantation.

Beginnen Sie damit, den stereotaktischen Rahmen auf dem Tisch eines Fluoreszenz-Präparier-Stereomikroskops zu platzieren. Sichern Sie dann die anästhesierte Maus im stereotaktischen Rahmen mit kontinuierlicher inhalativer Anästhesiezufuhr über einen Isofluran-Nasenkonusadapter. Halten Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen aufrecht.

Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Sterilisieren Sie dann die Inzisionsstelle der Kopfhaut mit einer Serie von drei Alkohol- und drei Betadine-Tüchern. Führen Sie den Zehenquetschreflextest an jeder Gliedmaße durch und bestätigen Sie die negative Reaktion, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.

Mit einer Pinzette die Kopfhaut zusammendrücken und sanft anheben. Nachdem Sie mit einer chirurgischen Schere einen linearen rostral-kaudalen Schnitt in der Mittellinie vorgenommen haben, spülen Sie die Inzisionsstelle mit PBS und entfernen Sie das subdermale Fett mit einem Wattestäbchenapplikator in kreisenden Bürstenbewegungen. Ordnen Sie die Haut so an, dass das zuvor etablierte Schädelfenster vollständig sichtbar ist.

Verwende eine 18-Gauge-Nadel, um die Dura direkt von innen bis zu den Rändern des Schädelfensters vorsichtig zu punktieren. Wiederholen Sie den Vorgang, bis der Schnitt das Innere des Fensters vollständig nachzeichnet. Entfernen Sie die Dura, indem Sie sie mit einer feinen Pinzette abziehen, wodurch das darunterliegende Parenchym und der Tumor zum Vorschein kommen.

Dimmen Sie als Nächstes die Raumbeleuchtung und schalten Sie den Stereomikroskop-Fluoreszenzmodus ein. Lokalisieren Sie den U87 mCherry und Firefly Luciferase exprimierenden Tumor. Legen Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze in das Ende des Schlauchs einer Vakuumpumpe.

Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein. Sezieren Sie den Tumor, indem Sie das fluoreszierende Gewebe vorsichtig aspirieren, bis kein Signal mehr vorhanden ist. Um Blutungen zu kontrollieren, spülen Sie mit kaltem PBS und üben Sie mit einem Wattestäbchen-Applikator gleichmäßigen Druck aus.

Verwenden Sie eine Kombination aus Kochsalzlösung, gleichmäßigem Druck mit einem Wattestäbchen-Applikator und/oder einem Blutstillungsmittel wie SURGICEL, um die Blutung vor dem Implantieren des Gerüsts zu stoppen. Wenn es nicht richtig kontrolliert wird, kann sich ein potenziell gefährliches Hämatom bilden. Schalten Sie nach der Resektion die Vakuumpumpe aus und entsorgen Sie die Pipettenspitze.

Schalten Sie die Fluoreszenz aus und die Raumbeleuchtung geht wieder an. Tauchen Sie unmittelbar vor der Implantation ein mit MSC gesätes PLA-Gerüst langsam in PBS, um unerwünschte Medien und zugehörige Komponenten zu entfernen. Implantieren Sie das Gerüst in die Resektionshöhle.

Fügen Sie bei Bedarf einen Mikroliter Fibrinogen gefolgt von einem Mikroliter Thrombin hinzu, um das Gerüst an Ort und Stelle zu halten. Nachdem Sie die Dura entfernt und den Knochenlappen aus dem Schädelfenster bereits verworfen haben, versiegeln Sie die Wunde, indem Sie die Haut schließen und chirurgischen Kleber auftragen. Nehmen Sie das Tier aus der Inhalation und lassen Sie es auf einer erhitzten Oberfläche erholen.

Diese Phasenkontrast-, Fluoreszenz- und kombinierten Bilder zeigen U87-Krebszellen, die mit lentiviralen Konstrukten so verändert wurden, dass sie mCherry- und Glühwürmchen-Luziferase-Marker exprimieren. Diese Phasenkontrast-, Fluoreszenz- und kombinierten Bilder zeigen entsprechende Bilder von Stammzellen, die so verändert wurden, dass sie diagnostische GFP-Renilla-Luziferase oder therapeutisches GFP-TRAIL exprimieren und auf das PLA-Gerüstmaterial ausgesät wurden. Dieses Hellfeld- und Fluoreszenz-Overlay-Bild zeigt die Lage des Tumors.

Hier ist die postoperative Resektionshöhle mit verbleibenden Tumorherden zu sehen. Dieses Bild zeigt das implantierte PLA-Gerüst, das mit MSC-TRAIL besiedelt wurde. Hier ist postmortales Hirngewebe zu sehen, über dem das Gerüst liegt.

Diese fluoreszierende Überlagerung hebt die GFP-TRAIL-Zellen hervor. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 30 Minuten für jede Maus durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass es eine intrinsische Variabilität im Ausmaß der Resektion von Maus zu Maus gibt, ähnlich wie in Kliniken.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine chirurgische Resektion eines Hirntumors durchgeführt wird, und deren Auswirkungen auf therapeutische Interventionen, zu denen auch die gerüstbasierte Stammzelltherapie gehört, bewerten.