Name: Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Lernen Sie die Montage und Reinigung von Prototyp-Schaumvirus-Intasomen für biochemische und strukturbiologische Studien in der Retrovirologie. Diese Methode ermöglicht die Isolierung hochreiner Integrationskomplexe.

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Diese Arbeit wurde von NIH AI099854 und AI126742 auf Schlüssel unterstützt.

(1) Glühen des vDNA
<ol><li>Mähdrescher 1 X 10-Puffer (10 X 10 Lager: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl 10 mM EDTA), 10 µM Oligo-1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM-Lager) und 10 µM Oligo-2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM-Lager) in einem Endvolumen von 1,5 mL . Aliquoten 25 µL in sechzig 0,2 mL Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Röhren. Hinweis: Abhängig von der Anwendung können Oligomere mit Fluorophore oder Tags am 5'-Ende von Oligo 2 oder als eine interne amino-T im Boden 13 vom 5'-Ende von Oligo 1 geändert werden. Modifizierte Oligomere sollte durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) vor Glühen gereinigt werden. Wir haben festgestellt, dass 5'-Ende Cy3 oder Cy5 Fluorophor Kennzeichnung von Oligo-2 Intasome-Montage-Effizienz 10-fache reduziert. Interne Fluorophor Kennzeichnung verringert nicht die Versammlung Effizienz.</li>
	<li>Tempern mit einem Thermocycler mit folgenden Zeiten und Temperaturen: 1 Zyklus auf 94,0 ˚C 3 min 99 Zyklen bei (94,0 ˚C 1 min, 93,6 ˚C 1 min) beide Temperaturen um 0,8 ° c pro Zyklus verringert (der letzte Zyklus ist 14,8 ˚C 1 min, 14,4 ° c 1 min) , und bei 4,0 ° c lagern.</li>
	<li>Kombinieren Sie die Glühen Reaktionen alle 60 Röhren. Laden Sie 500 µL, zwei 0,5 mL 3 kDa Molekulargewicht cutoff (MWCO) ultracentrifugal Filter Konzentrationseinheiten. Die geglühten vDNA durch Zentrifugieren in einem Microcentrifuge 14.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) zu konzentrieren. Hinweis: Das Retentat Laufwerk sollte ~ 50 µL in jeder Konzentration Einheit.</li>
	<li>Die Durchströmung zu verwerfen. Jede Filteranlage 250 µL der verbleibenden geglühten vDNA hinzufügen. Wiederholen Sie den Spin und verwerfen Sie die Durchströmung zu. Tausch in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) durch waschen dreimal mit 450 µL TE-Puffer.</li>
	<li>Invertieren der Filtereinheit und Spin bei 1.000 x g für 2 min bei RT Die endgültige Retentat Lautstärke für jede Filteranlage sollte ~ 50 µL kombinieren Sie die Retentates und Übertragung auf ein 1,5 mL Schraubverschluss Rohr.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption 260 nm Ultraviolett (UV) von der vDNA. Verwenden Sie diesen Wert, um die Endkonzentration der molaren DNA zu berechnen. Die vom Aussterben bedroht Leistungszahl (ε260) dieses vDNA ist 622.803 cm-1 M-1 und seine Molekulargewicht 23.972 Da. Store bei-20 ° c.</li>
</ol>2. Intasome Montage
<ol><li>Führen Sie nach Möglichkeit die Intasome-Assembly in einem kleinen Raum mit einem Variablen Thermostat. Stellen Sie den Thermostat auf ca. 18-22 ° c. Hinweis: Nach unserer Erfahrung ist Intasome Versammlung bei 4 ° c ineffizient.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 L des Dialyse-Puffer (20 mM Bis-Tris Propan, pH 7,5, 200 mM NaCl, 2 mM Dithiothreitol (DTT), 25 µM ZnCl2) in einem 2 L Becherglas mit Stir Bar auf einem Teller rühren. Equilibrate des Puffers in der 18-22 ° c Raum für mindestens 6 h.</li>
	<li>Um die Intasomes zu montieren, verbinden Sie Propan 50 mM Bis-Tris, pH 7.5, 500 mM NaCl und 120 µM PFV IN 50 µM vDNA in einem Gesamtvolumen von 150 µL. Hinweis: Der PFV IN sollte frei von kontaminierenden Nuklease Aktivität7,8. Wenn die Konzentration des PFV IN zu verdünnen, 120 µM IN 150 µL Volumen unterzubringen, ist dann es möglich ist, das Endvolumen zu 200 µL zu erhöhen. Die entscheidenden Faktoren für diesen Schritt sind weiterhin das molare Verhältnis von IN zu vDNA (2.4:1) und ausreichend komplex, während der Chromatographie zu visualisieren.</li>
	<li>Reinigen Sie ein ~ 10 cm langes Stück 10 mm 6-8 kDa MWCO Dialyse Schläuche und Clips mit doppelt destilliertem Wasser (DdH2O) oder die höchste Reinheit Wasser zur Verfügung. Stecken Sie ein Ende des Schlauches. Hinweis: Dialyse Schläuche sollten mit Sorgfalt, um zu verhindern, dass etwaige Kontaminationen aus dem Labor-Raum behandelt werden.</li>
	<li>15 mL Dialyse Schläuche spülen Puffer (50 mM Bis-Tris Propan, pH 7.5, 500 mM NaCl) zu machen. Spülen Sie die Innenseite des Schlauches Dialyse dreimal mit 1-2 mL spülen Puffer. Entfernen Sie so viel des Puffers spülen wie möglich mit einer Pipette und dünnen Gel laden Tipp.</li>
	<li>Verwenden Sie ggf. eine saubere Rasierklinge oder einem Skalpell schneiden die Dialyse Schläuche, so dass ein dünne Gel-laden-Tipp am Ende des Schlauches erreichen kann.</li>
	<li>Übertragen Sie die Intasome-Assembly von Schritt 2.3 auf der Dialyse-Schlauch mit einer Pipette und einem dünnen Gel laden Tipp. Befestigen Sie das offene Ende der Dialyse Schläuche, Minimierung der Menge von Luft in den Schlauch eingeführt. Legen Sie die Schläuche in der Dialyse-Puffer.</li>
	<li>Dialyse über Nacht (16-20 h) unter schonenden rühren, damit das Rohr dreht sich aber nicht in einen Strudel. Sicherstellen Sie, dass die Dialyse-Schlauch unter Wasser und mobile. Beobachten Sie nach etwa einer Stunde einen sichtbaren Niederschlag in den Schlauch. Hinweis: Mit Cy3 oder Cy5 Eindringmittel vDNA bezeichnet, ist der Niederschlag deutlicher. Dies gilt auch für Ende beschriftet und intern beschrifteten fluoreszierende vDNA.</li>
</ol>3. Intasome Solubilization
<ol><li>Bereiten Sie zwei breite Bohrung Pipettenspitzen durch Entfernen von 2-4 mm vom Ende von 200 µL Tipp mit einer neuen Rasierklinge oder Skalpell Klinge auf eine saubere Oberfläche. Hinweis: Die Tipps werden in Schritt 3.3 und 3.5 verwendet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Dialyse-Schläuche aus der Dialyse-Puffer. Vermeidung einer Verdünnung der Probe mit Dialyse-Puffer Intasome, die am Ende des Schlauches in der Nähe des Clips bleiben können, mithilfe einer Mikropipette mit einem kleinen Pipettenspitze um jede überschüssige Dialyse-Puffer zu entfernen. Entfernen Sie den Clip von einem Ende der Dialyse Schläuche.</li>
	<li>Verwendung eine große Bohrung Pipettenspitze Schritt 3.1, die Probe einschließlich des Niederschlags in der Dialyse-Schlauch, ein 1,5-mL-Tube auf Eis zu übertragen. Beachten Sie das Gesamtvolumen des zurückgewonnenen Materials; Das Gesamtvolumen beträgt in der Regel ca. 140 µL.</li>
	<li>Die Probe mit Niederschlag ist bei 200 mM NaCl; erhöhen Sie das Salz, eine Endkonzentration von 320 mM NaCl, indem das entsprechende Volumen der NaCl-Stammlösung der 5 M. Zum Beispiel für eine Probe von 150 µL hinzufügen 3,9 µL 5 M NaCl und 1,1 µL DdH2O für ein Endvolumen von 155 µL. Transfer Eiseimer mit Probe in einen Kühlraum von 4 ° c.</li>
	<li>Verwendung eine große Bohrung Pipettenspitze Schritt 3.1 Aufschwemmen und solubilisieren die Ausfällung von pipettieren. Wiederholen Sie alle 20 min für mindestens 1 Stunde beobachten, die meisten des Niederschlags in Lösung gehen sollte. Hinweis: Um den Niederschlag Aufschwemmen Pipettieren kann beendet werden, wenn es ersichtlich ist, dass der Niederschlag zwischen Zeitpunkten nicht mehr spürbar reduziert wird. Wenn vDNA nicht beschriftet ist oder intern bezeichnet, ist der Niederschlag um ~ 90 % bezogen auf die Sichtprüfung reduziert. Bei Cy5 Ende beschriftet vDNA wird der Niederschlag nur ~ 20 % reduziert; die meisten des Niederschlags mit Fluorophor Ende beschriftet vDNA werden nicht anderweitig. Die Menge des Niederschlags, die effektiv solubilisiert ist ist variabel und sollte empirisch ermittelt werden.</li>
</ol>4. Intasome-Reinigung
<ol><li>Bereiten Sie 250 mL Größe Ausgrenzung Chromatography (SEC) Puffer (20 mM Bis-Tris Propan, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10 % Glycerin) ausgeführt. Sterilfilter des Puffers mit einem 0,2 µm Filtern Einheit und bei 4 ° c lagern. Hinweis: Alle Reinigungsschritte sind in einem 4 ° c kalten Raum durchgeführt.</li>
	<li>Equilibrate eine vernetzte Agarose SEC-Spalte (Durchmesser = 10 mm; Länge = 300 mm; Volumen Bett = 24 mL; probieren Volumen = 25-500 µL; Maximaldruck = 1,5 MPa; Ausgrenzung Limit = 4 x 107 Da; trennt Molekulargewichte zwischen 5 bis 5.000 kDa, sehen die Tabelle von Mat Erials) mit SEC laufenden Puffer mit einer Durchflussrate von 0,4 mL/min. Hinweis: Diese Reinigung kann auf unterschiedlicher Größe Ausgrenzung Spalten angepasst werden, wenn sie effektiv 300 kDa trennen 44 kDa, z. B. Superose 12 10/300 GL oder Superose 6 erhöhen können. Superose 12 10/300 GL hat niedrigeren Auflösung, was zu mehr Überschneidungen der Gipfel. Im Gegensatz dazu Superose 6 erhöhen verfügt über höhere Auflösung und besseren Trennung.</li>
	<li>Zentrifuge Intasome Probe in ein Microfuge bei 14.000 x g für 10 min bei 4 ° c, alle übrigen Niederschlag pellet. Entfernen Sie vorsichtig den überstand. Laden des Überstands zu einem 200 µL Injektionsschleife (Schläuche, die ~ 200 μL enthalten kann). Die Probe auf der SEC-Spalte anwenden. Hinweis: Kleinere Ladevolumen ermöglichen höhere Auflösung von SEC</li>
	<li>Eluieren mit 25 mL SEC laufen zu puffern und sammeln 95 Bruchteile von 270 µL. beachten Sie, dass die SEC-Chromatogramm drei A280/a260 -Gipfel (Abbildung 1 zeigt). Hinweis: Die erste sollte ein Aggregat (~9.0 - 11,5 mL Elution), gefolgt von der PFV Tetramer Intasome Peak (~12.0 - 14,75 mL Elution) und PFV IN Monomer mit kostenlosen vDNA Peak (~15.0 - 18,0 mL) sein.</li>
</ol>5. Integration Strang Transfer Assay, Bruchteil Auswahl und Lagerung
<ol><li>Kombinieren Sie 2 µL der Höhepunkt jedes Intasome und 50 ng 3 kb supercoiled Plasmid DNA (Lager Konzentration ist 50 ng/µL) in Reaktion-Puffer (10 mM Bis-Tris Propan, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT) in eine endgültige Reaktionsvolumen von 15 µL. Bei 37 ° c für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Gehören Sie eine Negativkontrolle mit keine zusätzlichen PFV Intasome. Stoppen Sie die Reaktion mit 0,75 µL Proteinase K (20 mg/mL Stammlösung) und 0,75 µL SDS (10 % Stammlösung). Inkubieren Sie bei 55 ° c für 1 h Store Proben Bedarf bei-20 ° c für spätere Analysen. Hinweis: Dieser Test ist eine qualitative Bewertung der Integration Aktivität. Die Intasome molare Konzentration der einzelnen Fraktionen ist nicht vor dieser Assay ermittelt. Brüche in der Integration Strang Transfer Test enthalten können gespeichert werden auf dem Eis (einschließlich Lagerung über Nacht) bis zur Integration Tätigkeit bestätigt und ausgewählte Brüche sind regelmÄÑig. Hier verwenden wir pMP2, eine pUC19 Derivative9. Wir haben auch erfolgreich die 5,4 kb-Plasmid PcDNA 3.1 verwendet. Alle Plasmid, das gelöst werden kann entspannt Kreis, linear, und supercoiled Formen als Ziel für die Integration verwendet werden.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 120 mL 1 % Gewicht pro Volumen (w/V) Agarose-Gel auf 1 X TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) mit 0,1 μg/mL Interkalation Bromid (EtBr, 10 mg/mL Stammlösung)10. Schmelzen Sie die Agarose-Lösung zu und gießen Sie sie in ein 15 x 10 cm Gel Casting Tablett. Legen Sie einen 15-Brunnen-Kamm mit 5 mm breit, 0,75 mm dick Brunnen. Hinweis: Schmalere Brunnen liefern besseren Band-Auflösung im Vergleich zu 1,5 mm Dicke Brunnen.</li>
	<li>Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur zu festigen. Tauchen Sie das Gel in 1 X TAE mit 0,1 μg/mL EtBr.</li>
	<li>Jede Integration Reaktion 3 µL 50 % Glycerin aus Schritt 5.2 hinzufügen. Laden Sie das gesamte Reaktionsvolumen auf das Gel. 1 µL 10 kb DNA Größe Marker (150 ng/µL Lager Konzentration) auf Bahnen auf beiden Seiten der Proben zu laden; Das heißt, sollte der DNA Größe Marker die Probe Gassen flankieren.</li>
	<li>Laden Sie in eine äußere Fahrspur 6 µL Orange G Farbstoff (0,25 % Orange G, 30 % Glycerin). Führen Sie das Gel bei konstanter Spannung, 10 V/cm (100 V) bei Raumtemperatur 1 Stunde oder bis Orange G Farbstoff vorne das Ende des Gels erreicht.</li>
	<li>Sofort Bild das Agarosegel mit einem fluoreszierenden Scanner EtBr (532 nm Anregung, 610 nm Emission Filter) überschreitet. Wenn Fluorophore beschriftet vDNAs verwendet wurden, auch mit entsprechenden Fluorophor Einstellungen Bild. Hinweis: zum Beispiel mit der Bezeichnung Cy5 erkennen DNA, Bild mit 633 nm Anregung und 670 nm Emission Filter. Abgestimmte Integrationsprodukte (CI, lineare DNA) laufen maßhaltig bei ~ 3 kb, nicht umgesetztes supercoiled Plasmid (SC) läuft schneller (~ 2 kb) und halb-Website Integrationsprodukte (HSI, entspannten Kreis DNA) läuft langsamer (~3.5 kb). Nicht umgesetztes vDNA führen maßhaltig bei ~ 40 bp.</li>
	<li>Die Bänder in jeder Bahn mit imaging Software7zu quantifizieren. Der Anteil der DNA in jeder Spur, die CI, HSI oder SC ist zu berechnen; vDNA ist in dieser Berechnung nicht enthalten. Hinweis: Integration Effizienz oder der Bruch des SC zu einem linearen Produkt umgewandelt wurde dividiert das Pixel-Volumen von abgestimmten Integrationsprodukte (CI) durch das gesamte Pixel Volumen von drei Bands (HSI + CI + SC). Wenn Intasomes Fluorophore beschriftet sind, können die HSI und CI-Produkte auch durch Fluoreszenz quantitated.</li>
	<li>Wählen Sie Brüche, die die meisten abgestimmte Integration-Aktivität haben. Hinweis: Nach unserer Erfahrung fällt der Spitzenaktivität abgestimmte Integration mit dem Protein-Gipfel als tetrameres PFV Intasomes identifiziert. Messen Sie die A280 jedes dieser Fraktionen und berechnen Sie die endgültigen Intasome Konzentration. Die ε-280 für ein Tetramer von Wildtyp PFV IN mit zwei vDNAs hier beschriebenen ist 908.339 cm-1M-1 und das Molekulargewicht ist 225.5 kDa. Die Konzentrationen sollten das gleiche Muster als die SEC Chromatogramm Peak und im Strang Transfer Test folgen.</li>
	<li>Jede Fraktion in 5 µL-Aliquots verteilen und snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie Aliquote bei-80 ° c. Brüche, ausgewählt für die Lagerung sind in der Regel zwischen 200 und 600 nM.</li>
</ol>

<ol><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li>
<li>Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasome+assembly+and+inhibition+of+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer.</a> Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).</li>
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<li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+conformations+of+prototype+foamy+virus+integrase+and+its+stable+synaptic+complex+with+U5+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA.</a> Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).</li>
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<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
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<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+a+novel+octameric+integrase+structure+for+betaretroviral+intasome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function.</a> Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+supramolecular+assembly+mediates+lentiviral+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration.</a> Science. 355 (6320), 93-95 (2017).</li>
<li>Passos, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+and+atomic+model+of+the+HIV-1+strand+transfer+complex+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome.</a> Science. 355 (6320), 89-92 (2017).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+Rous+sarcoma+virus+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome.</a> Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).</li>
<li>Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+retroviral+integration+from+X-ray+structures+of+its+key+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates.</a> Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Retroviren INs bilden einen Komplex mit viralen genomischen DNA führen Integration und weiter den viralen Lebenszyklus Multimeric. Die Anzahl der im Monomeren pro Intasome möglicherweise Tetramers, Octamers oder eventuell höhere Ordnung Multimere11,12,13,14. PFV Intasomes sind, dass ein Tetramer des rekombinanten mit doppelsträngigen DNA-Oligomere, die viralen genomischen DNA zu imitieren endet...

Integration des viralen Genoms in das Wirtsgenom ist ein obligatorischer Schritt im Lebenszyklus von allen Retroviren1. Das virale Enzym Integrase (IN) katalysiert die kovalente Verbindung der beiden Enden der viralen DNA-Genom an den Host DNA. Während einer zellulären Infektion gehört eine Vorintegration Komplex, die die Integration vermittelt. Rekombinante IN komplexiert mit doppelten gestrandeten DNA-Oligomere imitiert die virale DNA-enden können auch die Integration in ein Ziel DNA in Vitro2durchführen. Eine gemeinsame Integration Assay in Vitro nutzt ein supercoiled Plasmid als Ziel DNA. Integration der beiden virale DNA-Oligomere (vDNA) auf dem Plasmid führt zu einem linearen Produkt und ist abgestimmte Integration (Abbildung 2A) bezeichnet. Die Integration Tests in Vitro können auch Produkte mit nur ein vDNA kovalent an das Ziel-Plasmid, was zu einem entspannten Kreis trat führen. Dieser halb-Website Integration Produkt scheint ein Artefakt der Assay in Vitro.
IN rekombinanten und vDNA Integration in Vitroverrichten, aber sie sind nicht ideal Reagenzien für das Studium der Dynamik oder die Struktur der komplexe Integration, wenn Monomere IN relevanten Visualisierung verdecken würde. Gereinigte Integration komplexe oder "Intasomes" sind für dynamische Einzelmolekül-Analyse oder strukturelle Studien erforderlich. PFV IN und vDNAs können durch Dialyse aus einem relativ hohen Salzkonzentration Puffer zu einem niedrigeren Salzkonzentration3,4montiert werden. Während der Dialyse, einen Niederschlag Formen. Dieser Niederschlag aus Dialyse entfernt und die Salzkonzentration steigt. Die höheren Salzkonzentration solubilisiert überstürzten enthaltenden PFV-Intasomes. Die Intasomes werden dann durch Größe Ausgrenzung Chromatography (SEC) gereinigt. Rekombinante Prototyp schaumig Virus (PFV) IN nachweislich als ein Monomer in Lösung in Konzentrationen bis zu 225 µM5existieren. SEC Fraktionierung trennt effektiv PFV Intasomes (225.5 kDa), die ein Tetramer des PFV IN und zwei vDNAs umfasst, von Monomeren PFV IN (44,4 kDa) und freie vDNA (24,0 kDa). Der PFV Intasomes können eingefroren werden und Integration Aktivität für mindestens sechs Monate Lagerung bei-80 ° c aufbewahren.
Rekombinante PFV Intasomes kann auch geändert werden, um IN Aminosäure Substitutionen oder abschneiden Mutationen oder vDNAs beschriftet mit Fluorophore oder Biotin4,6erweitert. Die gereinigten PFV Intasomes durchführen ohne weiteres Integration in ein Ziel supercoiled Plasmid DNA in Vitro. Bulk-biochemische Integration-Assays mit Intasomes können die Auswirkungen der IN Mutationen im Hemmer oder sonstigen chemischen Zusätzen testen. Biotinylierte Intasomes kann verwendet werden, Affinität mit Nukleinsäuren oder Proteine zu untersuchen. PFV Intasomes funktionieren bei Umgebungstemperatur zulassend Einzelmolekül-Mikroskopie-Analyse von magnetischen Pinzette Messung die Zeit zwischen den Beitritt der beiden vDNA enden oder Totalreflexion Fluoreszenz, die Intasome Suche auf Ziel zu visualisieren DNA-6. Darüber hinaus wurden PFV Intasomes die erste strukturell sein deutlich beeinflussen das Feld von Retroviren Integration3gekennzeichnet.

<table><tbody><tr><td>DNA-Oligomere</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Custom DNA Oligos</td></tr><tr><td>Tris Ultra</td><td>Pure Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL Zentrifugalfilter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677094-24EA</td><td>3 kDa MWCO</td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS Propan, >=99,0% (Titration)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Ladespitzen, 1 - 200 &mu; L</td><td>Corning</td><td>CLS4853-400EA</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge; Einschneidig; 100/Pk.; Packung mit 100</td><td>sterilen</td> Einweg-Filtereinheiten Fisher Scientific <td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>mit PES-Membran > 250 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschlauch-Clips</td><td>Spectrum Labs</td><td>132734</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa 10 mm Dialyseschlauch</td><td>Spectrum Medical</td><td>132645</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Res Standard Agarose</td><td>AGTC Bioprodukte</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Fisher Scientific</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>Hyladder 10kb, 500 Bahnen</td><td>Denville Scientific</td><td>CB4225-4</td><td></td></tr></tbody></table>

montage und reinigung der prototyp schaumig virus intasomes

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A Definition von Funktion und notwendiger Schritt des Lebenszyklus Retrovirus ist die Integration des viralen Genoms in das Wirtsgenom. Alle Retroviren kodiert eine Integrase (IN)-Enzym, das katalysiert die kovalente Verbindung von viralen Host DNA, bekannt als Strang übertragen. Integration kann modelliert in Vitro mit rekombinante Retroviren und DNA-Oligomere imitiert die Enden des Virusgenoms. Um genauer rekapitulieren die Integration-Reaktion, die auftritt, in Vivo, Integration sind komplexe von rekombinanten IN und synthetischen Oligomere durch Dialyse in einem reduzierten Salzgehalt Puffer montiert. Die Integration komplexer, genannt eine Intasome kann durch Größe Ausgrenzung Chromatographie gereinigt werden. Bei Prototyp schaumig Virus (PFV) der Intasome ist ein Tetramer von innen und zwei DNA-Oligomere und ist leicht von Monomeren IN und kostenlose Oligomer DNA getrennt. Die Effizienz der Integration des PFV Intasomes kann unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen für die Dynamik besser zu verstehen und Mechanik der retroviralen Integration untersucht.

PFV Intasomes werden von rekombinanten IN und vDNA montiert. Nach der Montage sind Intasomes durch SEC (Abbildung 1) gereinigt. Integration-Aktivität der einzelnen Fraktionen ist mit einem supercoiled DNA Ziel- und Agarose Gelelektrophorese (Abbildung 2) untersucht. Dieses Gel wird mit einem fluoreszierenden Scanner eingestellt, erkennt EtBr (und Fluorophor, wenn Fluorophore beschriftet vDNA verwendet wird) abgebildet. Bildanalys...

Rekombinante Retroviren Integrase und DNA-Oligomere imitiert virale DNA enden können einen enzymatisch aktiven Komplex bekannt als ein Intasome bilden. Intasomes können für biochemische, strukturellen und kinetischen Studien verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu montieren und zu reinigen Prototyp schaumig Virus Intasomes.

Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Prototypen von schaumigen Virus-Intasomen zusammenzusetzen und zu reinigen, die dann für biochemische, strukturelle und kinetische Studien verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Retrovirologie zu beantworten, wie z.B. die Mechanik und Dynamik der Integration. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung von Integrationskomplexen anstelle einer heterogenen Mischung von Arten ermöglicht.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von Vorteil, da eine Rückgewinnung und Solubilisierung von Integrationskomplexen entscheidend sind, um eine optimale Intasome-Ausbeute zu gewährleisten. Kombinieren Sie zunächst 1XTEN-Puffer, 10 mikromolare Oligo-1 und 10 mikromolare Oligo-2 in einem Endvolumen von 1,5 Millilitern. Dann aliquotieren Sie 25 Mikroliter des Gemisches in 60 0,2 Milliliter Polymerase-Wechselreaktionsgefäße.Glühen Sie die DNA mit einem Thermocycler mit den im Textprotokoll angegebenen Zeiten und Temperaturen. Kombinieren Sie nach der Reaktion die Glühreaktionen aller 60 Röhrchen. Laden Sie dann 500 Mikroliter von zwei 0,5-Milliliter-Ultrazentrifugalfilter-Konzen

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Eine einfache, effiziente und robuste Art, die Bereitstellung von mehreren viralen Komponenten auf Pflanzenzellen zu synchronisieren...

Einfach und robust In-vivo- Und In-vitro- Ansatz für das Studium Virusassemblierung

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Quelle: Mackler, R. M., et al. Herstellung und Reinigung von Prototyp-Foamy-Virus-Intasomen. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Reinigung von Prototyp-Foamy-Virus-(PFV)-Intasomen aus einer gemischten Protein-DNA-Suspension mittels Salzextraktion und Größenauschlusschromatographie, wodurch aktive Komplexe für die nachgeschaltete Analyse erhalten werden.

Reinigung von Prototype-Foamy-Virus-Intasomen mittels Größenausschlusschromatographie

Quelle: Lopez Jr., M. A., et al. Nachweis und Entfernung von Nuklease-Kontaminationen während der Reinigung rekombinanter Integrase des Prototyp-Foamy-Virus. J. Vis. Exp. (2017)In diesem Video wird die Reinigung eines polyhistidinmarkierten viralen Integrase mittels Nickelaffinitätschromatographie demonstriert. Das Protokoll verwendet eine Imidazol-Gradientenelution, um das Integrase basierend auf seiner Affinität zum nickelbeladenen Harz gezielt zu isolieren.

Reinigung der viralen Integrase mittels Affinitätschromatographie

Quelle: Lopez Jr., M. et al. Nachweis und Entfernung von Nuklease-Kontaminationen während der Reinigung rekombinanter integrase des prototypischen Foamy-Virus. J. Vis. Exp. (2017)In diesem Video wird das Verfahren zur Reinigung viraler Integrases aus bakterieller Nukleasekontamination mithilfe der Heparin-Sepharose-Säulenchromatographie sowie die anschließende SDS-PAGE-Analyse zur Bestätigung der Proteinreinheit demonstriert.

Reinigung der viralen Integrase mittels Heparin-Affinitätschromatographie

Quelle: Gao, Y., et al. Erzeugung und Assemblierung virus-spezifischer Nukleokapside des Respiratorischen Synzytial-Virus. J. Vis. Exp. (2021)Das Video zeigt die In-vitro-Assemblierung virus-spezifischer Nukleokapside aus einem gereinigten, RNA-freien Nukleoprotein-Phosphoprotein-Komplex, deren Aufreinigung mittels Größenausschlusschromatographie und die Validierung von vollständiger viralen RNA innerhalb der assemblierten Partikel.

In-vitro-Rekonstitution und Reinigung von viralen nukleokapsidähnlichen Partikeln

Die Demontage von Influenza-A-Viruskernen während des Viruseintritts in Wirtszellen ist ein mehrstufiger Prozess. Wir beschreiben eine in vitro Methode, um die frühen Stadien der viralen Enthüllung zu analysieren. Bei diesem Ansatz wird die Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation verwendet, um die Schritte, die die Entschichtung unter definierten Bedingungen einleiten, biochemisch zu zerlegen.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.

Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Rekombinante Prototyp schaumig Virus Integrase Protein ist oft mit einer bakteriellen Nuklease während Reinigung kontaminiert. Diese Methode Nuklease Kontamination identifiziert und entfernt die letzten Vorbereitungen des Enzyms.

Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

Hier beschreiben wir eine einzellige Mikro-Aspirationsmethode zur Trennung infizierter Amöben. Um virale Subpopulationen in Vermamoeba vermiformis zu trennen, die mit Faustoviren und unbekannten Riesenviren infiziert sind, haben wir das unten beschriebene Protokoll entwickelt und seine Fähigkeit demonstriert, zwei neuartige Riesenviren mit geringem Überfluss zu trennen.

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

Für eine eingehende mechanistische Analyse der RNA-Synthese des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) berichten wir über ein Protokoll zur Verwendung des Chaperonphosphoproteins (P) zur Koexpression des RNA-freien Nukleoproteins (N0)für die anschließende in vitro-Assemblierung der virusspezifischen Nukleokapside (NCs).

Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus

Lernen Sie die Montage und Reinigung von Prototyp-Schaumvirus-Intasomen für biochemische und strukturbiologische Studien in der Retrovirologie. Diese Methode ermöglicht die Isolierung hochreiner Integrationskomplexe.

Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes

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