Name: Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie die Immunphänotypisierung orthotoper Pankreaskarzinom-Homografts in murinen Modellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Profilierung des Tumor-Immunmikromilieus für translational onkologische Forschung.

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Die Autoren würden Dr. Jody Barbeau - Danke für das kritische lesen und Bearbeitung des Manuskripts und danken Ralph Manuel für die Gestaltung von Kunstwerken. Die Autoren möchten auch die Krone Bioscience Onkologie Immuno-Onkologie Biomarker Team und Onkologie In Vivo -Team, für ihre großen technischen Bemühungen danken.

Alle Protokolle und Zusatzvereinbarungen oder Verfahren, die die Pflege und Verwendung von Tieren werden überprüft und genehmigt durch die Krone Bioscience Tier Heimen und verwenden Committee (IACUC) vor der Durchführung von Studien. Die Pflege und Verwendung von Tieren in der Regel nach internationalen Richtlinien AAALAC (Verein zur Prüfung und Akkreditierung of Laboratory Animal Care) erfolgt wie in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren, National Research berichtet Rat (2011). Alle tierische experimentelle Verfahren werden unter sterilen Bedingungen in SPF (spezifisch Pathogen-freies) Einrichtungen und unter strikter Einhaltung der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von unterschiedlichen staatlichen Institutionen (z.B. durchgeführt Die National Institutes of Health). Das Protokoll des Ausschusses für die Ethik von Tierversuchen an der Anlage Institution genehmigt werden müssen (z. B. institutionelle IACUC Ausschuß).
1. Vorbereitung für die Tumor-Transplantation
<ol><li>
Unterbringung von Tieren
	<ol>
<li>Erhalten Sie generische C57BL/6 Mäusen von einem kommerziellen Zucht-Anbieter.</li>
		<li>Hausmäuse (5) in einzelnen belüftete Käfige zu folgenden Bedingungen: Temperatur: 20 – 26 ° C; Luftfeuchtigkeit 30 – 70 %; Beleuchtung-Zyklus: 12 h hell und dunkel 12 h.</li>
		<li>Verwendung Corn Cob d. h. Bettwäsche wöchentlich gewechselt.</li>
		<li>Bieten Sie für Ernährung Bestrahlung sterilisiert trockenes Granulat Essen während des gesamten Studiums.</li>
		<li>Bieten Sie für Wasser Tiere freien Zugang zu sterilen Trinkwasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spender Tumor Fragment Vorbereitung
	<ol>
<li>Beginnen Sie durch die Überwachung des Körpergewichts (BW), über wiegen, mit einem Gleichgewicht und Tumorvolumen (TV), durch Messung der Bremssattel, der Spender Tumor-tragenden Mäusen.</li>
		<li>Wenn TV 500 – 1.200 mm3erreicht, einschläfern des Tieres in einem Biohazard Abzug gemäss Protokoll.</li>
		<li>Desinfizieren Sie die Haut um den Tumor mit jodophor Tupfer.</li>
		<li>Den Tumor chirurgisch zu entfernen (in Abschnitt 3 beschriebenen Details: Sektions- und Tumor Ernte) und den Tumor in einer Petrischale mit 20 mL PBS (Pre-chill die Medien oder Puffer auf 4 ° C vor euthanizing Tiere).</li>
		<li>Wenn es kontaminierenden Blut, den Tumor in einer anderen Petrischale zu übertragen und den Tumor mit PBS waschen.</li>
		<li>Halbierung des Tumors, überschüssige Haut, Gefäße, Verkalkung und/oder Nekrosen entfernen.</li>
		<li>Wählen Sie nur intakte Teile des Tumors und legen Sie sie in einen sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 20 mL PBS dann transportieren Sie den Schlauch auf ein Tier Extrazimmer für pharmakologischen Studien zu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Orthotopen und Engraftment subkutanen (SC)
<ol><li>
SC-Impfung
	<ol>
<li>Zuschnitte Tumoren in 2 mm Durchmesser mit einem Skalpell, 1 Stück in jeder Trokar für die SC-Implantation oder zur späteren orthotopen Implantation (siehe unten).</li>
		<li>Betäuben Sie die Empfänger Tier mit 5 % Isofluran, der von einer bugnase bei 1 % gepflegt wird. Das Tier wird beginnen zu entspannen, ihre aufrichtenden Reflex zu verlieren und schließlich unbeweglich geworden. In dieser Tiefe der Narkose können sie leicht durch schmerzhafte Reize geweckt werden; lassen Sie Anästhesie, zu vertiefen, bis solche Reaktionen auf Schmerz fehlen.</li>
		<li>Sobald betäubt, befestigen Sie die Mäuse auf einem Experiment Board in der rechten Seitenlage. Sterilisieren Sie die Maus über jodophor Tupfer, insbesondere der Umgebung der Tumoren.</li>
		<li>Machen Sie mit einem Skalpell einen Hautschnitt von 0,5 bis 1,0 cm auf der linken Flanke, nur cranial bis zur Hüfte.</li>
		<li>Tunnel unter der Haut in Richtung der vordergliedmaße, zwei bis drei Zentimeter, mit stumpfen Pinzette.</li>
		<li>Aseptisch einen Würfel des Tumors vom Medium und tief im Inneren des subkutanen Tunnels.</li>
		<li>Bestätigen Sie visuell, dass der Tumor tief im Tunnel (und nicht bei der hautinzision).</li>
		<li>Schließen Sie die Wunde mit Wunde Clips.</li>
		<li>Die Tiere Post Impfung zu überwachen, bis sie ausreichend Bewusstsein um sternale Recumbence beizubehalten wiederhergestellt. Tiere nur nach ihre vollständige Genesung aus der Narkose zurück in ihren Käfig zurück. Vervollständigen Sie das Anästhesie-Protokoll, und initiieren Sie das Tier-Gesundheit-Diagramm zu. Wiegen Sie Empfänger Tiere täglich für drei Tage</li>
		<li>Impfen Sie für ein Standardverfahren 5-10 Mäuse pro Gruppe für die Überwachung der Tumor Wachstum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pankreas orthotopen implantation
	<ol>
<li>Anästhesie und Analgesie<ol>
<li>Verwenden Sie eine 2 mL Ketamin Injektion und 0,42 mL Xylazin Injektion (20 mg/mL) vermischt in 5,91 sterile Spritze Wasser oder Kochsalzlösung in ein Dosis-Volumen von 0,06-0,1 mL/20-25 g Körpergewicht. Hinweis: Nach Tierschutz, Analgesie ist notwendig beide Pre und post-Vorgang. 0,05-0,1 mg Buprenorphin schnitzelfleisch, SC. Die erste Dosis ist Pre-Vorgang und dann dosiert 3 mal alle 4 Stunden Post-Vorgang immer wieder.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Chirurgischer Eingriff zur orthotopen implantation<ol>
<li>Mäuse über intramuskuläre Injektion (IM) pro Schritt 2.2.1 zu betäuben.</li>
			<li>Nachdem die Tiere vollständig betäubt sind, befestigen Sie die Mäuse auf ein Experiment-Board in der rechten Seitenlage.</li>
			<li>Halten Sie die Mäuse in der rechten Seitenlage. Desinfizieren Sie die Haut um die Milz mit Jod dann de iodinate mit 75 % Äthylalkohol.</li>
			<li>Finden Sie den mittlere Punkt der Milz zu und machen Sie einen vertikalen Schnitt 1 cm am Bauch, Milz verfügbar zu machen.</li>
			<li>Ein Teil des Gewebes der Bauchspeicheldrüse unter der Milz sanft mit Flat-Tip Pinzette herausziehen, und Naht ein Maus Homograft Tumor Stück aus Samen Maus auf die Bauchspeicheldrüse des Empfängers Maus von 9-0 resorbierbaren chirurgischen Naht.</li>
			<li>Schließen Sie den Bauch mit einer 6-0 Seide Naht von doppelten Naht. Homöostase durch Kompression zu erreichen.</li>
			<li>Nach der Veredelung Tumor Implantation tritt weder Blutungen noch Tumor Gewebe austreten, halten Sie die Tiere in einem warmen Käfig.</li>
			<li>Überwachen Sie das Tier, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt; das Tier in den tierraum nach vollständiger Genesung aus der Narkose zurück. Überwachen des Tumors mit Mäusen durch Abtasten des Bauches in der Nähe der Milz und wählen Sie sich die Mäuse mit orthotopen Tumoren.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tumor-tragenden Mäusen Gesundheit Überwachung
	<ol>
<li>Überprüfen Sie den Verbrauch von Wasser und Nahrung täglich.</li>
		<li>Überprüfen der Maus Auftritt für ein ungepflegt Fell, Klumpen, Schlankheit, abnorme Atem oder Aszites.</li>
		<li>Ertasten Sie den Bauch zu überprüfen, ob es spontane Tumoren in der Leber oder Milz gibt.</li>
		<li>Wiegen Sie Mäuse, die wöchentlich mit einer Waage.</li>
		<li>Wenn eines der folgenden klinischen Anzeichen zu beobachten sind, werden die Mäuse für Probenentnahme und Autopsie geopfert: BW Verlust > 20 %; beeinträchtigte Mobilität (nicht in der Lage zu essen oder zu trinken); nicht normalerweise durch erhebliche Aszites und erweiterten Bauch bewegen; Aufwand in der Atmung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Autopsie und Tumor-Ernte
<ol><li>Überprüfen Sie optisch und durch Abtasten auf das Vorhandensein von tastbaren Tumoren vor Kündigung.</li>
	<li>Für die Kündigung zuerst einschläfern Mäuse nach genehmigten Prüfplan und öffnen den Bauch und visuell prüfen für Tumoren die Bauchspeicheldrüse.</li>
	<li>Schneiden Sie den Tumor chirurgisch Post mortal und kaltem PBS hinzufügen. Legen Sie alle Tiere in eine saubere, ungeladenen, transluzente Euthanasie Kammer mit einem speziellen Deckel mit einem Anschluss für die Lieferung des Kohlendioxids verwendet werden.</li>
	<li>Entladen Sie Gas in die Kammer mit einer Durchflussrate, die schnelle Bewusstlosigkeit mit minimalen Stress für das Tier produziert. Die optimale Durchflussmenge für CO2 sollte ca. 2 – 2,5 L/min sein.</li>
	<li>Beobachten Sie visuell jedes Tier bei der Euthanasie zu versichern, dass alle Tiere erhalten angemessene Gaskonzentrationen und tanken Bewusstsein nicht während des Verfahrens einschläfern.</li>
	<li>Pflegen Gasstrom für mindestens 1 min nach offensichtlichen klinischen Tod die Möglichkeit zu minimieren, die ein Tier erholen kann (wenn Apnoe aber nicht tot).</li>
	<li>Neben nicht-Tumor-Gewebe zu entfernen. Gereinigte Tumor kann schnell fotografiert werden. Setzen Sie die Tumorgewebe in RPMI-1640 und halten auf dem Eis vor Dissoziation. Hinweis: Tierkörper sind eingesackt und gespeichert in den entsprechenden Gefrierschrank auf Entfernung zu warten.</li>
</ol>(4) Tumor Gewebe Dissoziation und einzelne Zelle Vorbereitung
<ol><li>
Reagenz-Vorbereitung Hinweis: Der Tumor Dissoziation Bausatz besteht aus 2 Fläschchen Enzym d (lyophilisierte Pulver), 1 Fläschchen Enzym R (lyophilisierte Pulver), 1 Fläschchen Enzym A (lyophilisierte Pulver) und 1 mL des Puffers A.<ol>
<li>Bereiten Sie Enzym D durch Neuaufbau des lyophilisierten Pulvers in jedes Fläschchen mit 3 mL RPMI-1640. Bereiten Sie Aliquote von einem entsprechenden Volumen, wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.</li>
		<li>Bereiten Sie Enzym-R durch Neuaufbau der gefriergetrockneten Pulvers im Fläschchen mit 2,7 mL RPMI 1640 vor. Bereiten Sie Aliquote von einem entsprechenden Volumen, wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.</li>
		<li>Bereiten Sie Enzym A durch Neuaufbau des lyophilisierten Pulvers in der Ampulle mit 1 mL Puffer A mit dem Kit geliefert. Tun Sie nicht Wirbel. Bereiten Sie Aliquote von einem entsprechenden Volumen, wiederholte frei-tau-Zyklen zu vermeiden.</li>
		<li>Bereiten Sie die Enzym-Mix durch Zugabe von 2,35 mL RPMI-1640, 100 µL Enzym D, 50 µL Enzym R und 12,5 µL Enzym a in jeder GentleMACS C-Schlauch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tumor-Dissoziation
	<ol>
<li>Für jeden Tumor bereiten Sie einem C-Rohr mit Tumor-Verdauung-Mix, finden Sie in Abschnitt 4.1 für Verdauung Puffer Verdünnung und Vorbereitung.</li>
		<li>Verwendung 3 mL Verdauung Puffer für Tumor Fragmente < 0,8 g, und stellen Sie sicher, der Tumor vollständig verdaut.</li>
		<li>Mit der Studie Code, Tumor, Maus-ID, Behandlungsgruppe und tumorgewicht kennzeichnen.</li>
		<li>Sammeln Sie den Tumor von der Maus zu, waschen Sie den Tumor in kaltem PBS und reinigen Sie das Gewebe auf den Tumor (z. B. Blutgefäße, Fett, Faszie, etc.) befestigt.</li>
		<li>Setzen Sie den Tumor in Verdauung Medien in einen Brunnen von einem sterilen 6-well-Platte.</li>
		<li>Halten Sie den Tumor mit der sterilen Pinzette/Pinzette und Scheibe mit einem Skalpell. Schneiden Sie den Tumor gut genug, um in kleinere Stücke (~ 1 mm3) zu brechen.</li>
		<li>Legen Sie die Tumor-Stücke wieder in den C-Schlauch und den restlichen Verdauung Puffer waschen der Plattenrandes und übertragen dann die Flüssigkeit in den C-Schlauch, der bis Verdauung auf Eis gelegt wird.</li>
		<li>Schalten Sie die Dissociator mit Heizungen.</li>
		<li>Platzieren Sie Tumor Dissoziation C-Rohre kopfüber in die Ärmel der vakanten Stellen zu, und passen Sie den Status der Röhre Positionen von kostenlos bis ausgewählt. Wählen Sie eine Dissoziation-Programm (37_c_m_TDK_1), gefolgt von der Auswahl des Ordners erforderlich, wo die Liste der Programme angezeigt wird.</li>
		<li>Ausziehen Sie C-Rohre nach Beendigung des Programms die Dissociator und Spin kurz (300 X g, 4 ° C), um die Probe pellet.</li>
		<li>Wieder auszusetzen Sie Proben und in eine Zelle Sieb über eine 50 mL-Tube. Waschen Sie die Zellen durch die Zelle Sieb mit 10 mL Waschpuffer, eine einzellige Suspension bereitzustellen.</li>
		<li>Die Rohre bei 300 X g für 5 min zentrifugieren, überstand verwerfen und erneut aussetzen der Zellen mit 5 mL Waschpuffer, Anzahl vitaler Zellen verwenden Trypan blau und/oder durch Zelle Zähler und passen Sie die Zelle Concentraton, 1 x 106 Zellen pro Röhre oder pro Probe. Gehören Sie die richtigen Isotype Kontrolle Antikörper um sicherzustellen, dass Beflecken spezifisch ist</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) immun Panel-Design und Flow-Datenerfassung
<ol><li>
Panel-design
	<ol>
<li>Bitte siehe Tabelle 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining
	<ol>
<li>FC-Block-Sample-Zellen: Zellen in 200 µL Puffer mit 1 µg/mL Fc-Block, gefolgt von Inkubation auf Eis oder 4 ° C Kälte für 15 min im Dunkeln Färbung wieder auszusetzen.</li>
		<li>Fleck-Zellen mit den gewünschten Antikörper/Fluoreszenz-Paneele (zB. T-Cell Panel, Makrophagen-Panel, etc..): Fügen Sie die Antikörper-Mischung verdünnt in Fc blockierende Puffer zu jeder Probe, Fleck für mindestens 30 min auf Eis im Dunkeln.</li>
		<li>Jedes Rohr 1 mL kaltem PBS Eis hinzufügen und erneut aussetzen der Zellen sanft, gefolgt von Zentrifugation bei 300 X g für 5 min. verwerfen der resultierende überstand.<ol>
<li>Wiederholen Sie, um die Zellen zweimal waschen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Fleck für intrazelluläre Marker bei Bedarf, Springen folgende Schritte 6-10, ansonsten mit Schritt 10 fort.</li>
		<li>Wieder aussetzen der Zelle Pellet durch Puls-Wirbel und 200 µL bereit Fixierung/Permeabilisierung funktionierende Lösung für jede Probe hinzufügen. Wirbel wieder Puls und dann bei 4 ° C inkubieren Übernachtung (bevorzugt) oder 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
		<li>Spin-down der Zellen und den überstand zu entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie zweimal durch Hinzufügen von 1 mL 1 x Permeabilisierung Puffer (hergestellt aus 10 x Permeabilisierung Puffer, verdünnt mit destilliertem H2O) gefolgt von Zentrifugieren und Dekantieren des Überstandes.</li>
		<li>Intrazelluläre Marker-Antikörper in 1 x Permeabilisierung Puffer hinzufügen und bei Zimmertemperatur 30 Minuten im Dunkeln inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen zweimal mit 1 mL 1 x Permeabilisierung Puffer. Zentrifugieren Sie und Dekantieren Sie überstand.</li>
		<li>Zellen in 150 µL Puffer Färbung aufschwemmen und auf eine Cytometer analysieren. Aufgrund der Fixierung und Permeabilisierung Verfahren, FSC (vorwärts-Light Scatter) / SSC (Seitenlicht Streuung) Verteilung der Zellpopulation werden verschiedene Zellen zu leben. Das Tor und Spannungen müssen daher geändert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FMO-Steuerelemente (Fluorescence abzüglich einer Kontrolle) Hinweis: Multi-Color Flow-Analyse ist besonders wichtig für die Analyse von Tumor infiltriert Immunzellen. Daher gibt es eine Notwendigkeit, einen Weg finden, zu identifizieren und gate-Zellen im Zusammenhang mit Daten, die durch mehrere Fluorochromes in einem bestimmten Bereich zu verbreiten. FMO (Fluoreszenz Minus eins) Kontrolle ist ein wichtiger Ansatz für diesen Zweck.<ol>
<li>Zu diesem Zweck sind zusätzliche Mäuse in jeder Gruppe für FMO Steuerelemente (mindestens 2 pro Rx) und Prozess individuell für jedes Gewebe. Nach Dissoziation, Pool-Gewebe. Zum Beispiel in einer Studie mit 4 Rx-Gruppen, sollten 8 weitere Tumoren einzeln verarbeitet und dann gebündelt in einer Probe für RGV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Flow-Instrument-Setup
	<ol>
<li>Machen Sie Entschädigung Perlen, während die Maschine erwärmt wird (mindestens 20 min).</li>
		<li>Verwenden Sie CS & T Perlen, um Leistung zu überprüfen.</li>
		<li>Einstellungen für Spannung und Entschädigung: UltraComp Perlen, Wirbel der Comp gründlich vor der Anwendung Perlen zu verwenden.</li>
		<li>Beschriften Sie eine separate 12 x 75 mm2 Probenröhrchen für jeden Fluorochrom konjugierten Antikörper.</li>
		<li>Fügen Sie 100 µL Puffer, um jedes Rohr Färbung. Jedes Rohr 1 volle Tropfen (ca. 60 µL) der Perlen hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie Antikörper und führen Sie die Färbung genau so, wie die in Ziffer 4 genannten Beispielprozess.</li>
		<li>Zugeben Sie 0,5 mL Puffer, um völlig Wulst Pellets über Wirbel wieder auszusetzen Färbung.</li>
		<li>Eingestellte Flow Cytometer PMT Spannung pro Zielgewebe für die gegebenen Experiment.</li>
		<li>Durchflusszytometer für die Datenerfassung durch Anspritzung auf der Singulett-perlenpopulation pro FSC und SSC Lesungen durchlaufen.</li>
		<li>Eingestellte Durchflussmenge um 200 – 300 Veranstaltungen/s.</li>
		<li>Legen Sie eine angemessene Entschädigung für einen gegebenen Fluorescein [FITC]-konjugierten Antikörpern, Verwendung eine FL1 vs. FL2 Dot-Plot.</li>
		<li>Legen ein Quadrant Tor direkt damit negative Perlen im unteren linken Quadranten sind und positive Perlen sind in der oberen oder unteren Quadranten. Passen Sie die kompensationswerte bis mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) jede Bevölkerung (siehe Quadrant Statistik Fenster) ungefähr gleich ist (d.h. für FL2-% FL1, FL2 MFI von beiden Perlen sollte ähnlich sein).</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.4.11. und 5.4.12 für alle Rohre.</li>
		<li>Fahren Sie mit dem tatsächlichen Erwerb gefärbten Proben. Führen Sie den Ausgleich-Assistenten aus und speichern Sie die Einstellungen mit dem Format "Datum experimentieren Ihre Initialen".</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. die Bewegungsdaten Analyse und Präsentation
<ol><li>Analysieren Sie Daten per Flowjo und/oder Kaluza.</li>
</ol>

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<li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes%3A+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li>
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</ol>

Alle Autoren sind aktuelle Vollzeit-Mitarbeiter von Krone Bioscience, Inc.

Obwohl Studien mit SC Tumore leichter durchgeführt werden, können Orthotopically implantierten Tumoren Modelle potenziell relevanter für präklinische pharmakologischen Studien (besonders I/O Untersuchungen) sein, verbesserte Übersetzbarkeit versorgen. Dieser Bericht soll helfen das interessierte Leser/Publikum, dass man direkt die technischen Verfahren zu visualisieren, die in ihrer jeweiligen Forschung verwendet werden können. Unsere Protokolle zeigen, dass orthotopen Implantation der PDAC kann dazu führen, dass effizie...

Duktales Pankreaskarzinom (PDAC) bewirkt, dass fast eine halbe million Todesfälle weltweit jährlich eines der Top-5-Krebs-Killer. Es gibt einige wirksame Behandlungsmöglichkeiten und keine zugelassenen Immuntherapien; neue Behandlungen sind daher dringend erforderlich. Krebserkrankungen werden zunehmend als immunologische Erkrankungen, einschließlich PDAC, zusätzlich zu den Erbkrankheiten, wie heute bekannt anerkannt wird. Immunologische und genetische Faktoren würde wahrscheinlich feststellen, Prognose sowie Behandlung Ergebnisse. Tumoren Host immunüberwachung umgehen und schließlich vorrücken, um zum Tod führen. Viele dieser immun Prozesse treten innerhalb der Tumor Mikroumgebung (TME)1,2,3,4 wo verschiedene Arten von Immunzellen zu interagieren, mit Tumorzellen, miteinander und mit anderen tumor Stromazellen Komponenten direkt oder indirekt über Zytokine die Krankheit Ergebnis letztlich zu bestimmen. Charakterisierung der Tumor immun Komponenten des TME oder Tumor Immunphänotypisierung, einschließlich Subtypisierung, Nummerierung und Lokalisierung von verschiedenen Linien von Immunzellen, ist daher entscheidend für Anti-Tumor Immunität zu verstehen. Im Falle der PDAC, es wurde vorgeschlagen, die erhöhte Tumor infiltrieren suppressive Makrophagen (TAM) und B-Zellen zur Vermeidung von T-Zell-Infiltration und/oder Aktivierung und ein hohes Maß von Fibrose5,6geführt haben.
Das gemeinsame Konzept zu immun TMEs experimentell untersucht Surrogat Tumor präklinischen Tiermodellen verwenden würden, vor allem relevanten Maus Tumor Modelle7, besonders Maus Phänomen (Homograft) oder gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMM) Krebserkrankungen, auf die vermeintlichen Ähnlichkeit von Maus und Mensch für Tumoren und Immunität8,9. Es ist in Wirklichkeit verstanden, dass es angeborene Unterschiede zwischen den beiden Arten10,11.
Transplantierten Maus Tumoren haben erhebliche betriebliche Vorteile gegenüber spontanen Tumoren7, nämlich synchronisierte Tumorentwicklung, im Gegensatz zu den elterlichen GEMM spontane Tumorentwicklung. Bestätigung der spontanen murinen Tumoren gelten Primärtumoren gewesen nie manipuliert, in Vitround Spiegelung original Maus Tumor Histo- / Molekulare Pathologie7sowie möglichen immun Profile. Diese murinen Homografts gelten oft als "eine Maus Version des Patienten abgeleitet Xenotransplantate (PDXs)". Sie haben daher wahrscheinlich eine bessere Übersetzbarkeit als konventionelle Phänomen Zelle Linie abgeleitet Maus Tumoren12. Vor allem sind viele Homografts abgeleitet spezifische GEMM bestimmte menschliche Krankheitsmechanismen, z. B. Onkogenen Fahrer Mutationen sind so konstruiert, wobei diese Bestätigung sollte daher Vorteile auf ihre klinische Relevanz haben. Insbesondere entwickeln die KPC GEMM Maus PDAC innerhalb von 15 – 20 Wochen alt, die morphologisch rekapituliert menschlichen Erkrankungen mit überwiegend gut bis mäßig-differenzierten glandulären Architektur und hochangereichertes Stroma. Dieses Modell rekapituliert auch die häufigsten genetischen Eigenschaften der menschlichen PDAC, nämlich Kras aktivierende Mutation und P53 Verlust der Funktion, die in 90 % und 75 % der menschlichen PDAC, jeweils5,6auftreten.
Standorte der Transplantation sind auch vorgeschlagen worden, eine Rolle im Modell Übersetzbarkeit. Die spezifische Gewebe Umgebung, wie z. B. eine entsprechende orthotopen Umgebung könnte eine Nische für bestimmte Tumoren, Fortschritt, im Gegensatz zu der einheitlichen subkutaner (SC) Umgebungen für die häufigsten transplantierten Tumoren. Es wäre von besonderem Interesse wird bzw. was für einen Unterschied zwischen den beiden Standorten der Transplantation, in Bezug auf die immun-Mikroumgebung und die Relevanz für Krebserkrankungen, z.B.existiert. im Falle der PDAC.
Einer der wichtigsten Aspekte der immun Profilierung oder Immunphänotypisierung, soll Tumor infiltrieren Immunzellen der verschiedenen Linien, Nummern, relative Anteil innerhalb von Tumoren, sowie ihren Aktivierungsstatus und Standorte bestimmen. Dazu gehören Tumor-Infiltratrating Lymphoctyes (TILs, T- und B-), Tumor infiltrieren Makrophagen (TAMs), Tumor infiltrieren natürlichen Killer-Zellen (NKs) und Tumor-Resident dendritischen Zellen3,13,14 , 15 , 16 , 17und die subzelluläre Lokalisation von bestimmten Zellen18,19,20, etc.. Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) oder Flow Cytometry ist eine einzellige Detection-Technologie, die häufig verwendet wird, um die spezifischen Parameter einer Zelle messen. Multi-Color flow Cytometry Maßnahmen mehrere Markierungen auf eine einzelne Zelle3,4,21 und ist die am häufigsten verwendete Methode zur Bestimmung der Zahlen und relativen Prozentsatz von verschiedenen Untergruppen von Immunzellen, auch innerhalb der Tumoren.
Dieser Bericht beschreibt die Verfahren für die Profilerstellung Tumor infiltrieren Immunzellen: 1) Implantation des orthotopen PDAC Maus Tumor Homografts, zusammen mit SC Implantation; (2) Tumor Gewebe Ernte und Vorbereitung der Einzelzelle über Tumor Dissoziation; (3) Flow Cytometry Analyse aller von den Zellen von Tumoren als Basislinie abgeleitet; (4) Vergleich der Baseline profile beider Transplantation Ansätze.

<table><tbody><tr><td>Anästhesiegerät</td><td>\</td><td>SAS3119</td><td>\</td></tr><tr><td>Trokar 20</td><td>\</td><td>\2</td> <td>mm</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>\</td><td>\</td><td>20 mm</td></tr><tr><td>100x Antibiotikum und Antimykotika</td><td>\</td><td>\\</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor Tupfer</td><td>\</td><td>\</td><td>Täglicher Apothekenkauf</td></tr><tr><td>Alkoholtupfer</td><td>\</td><td>\</td><td>Täglicher Apothekenkauf</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>Luftchemikalie</td><td></td> <td>\\</td></tr><tr><td>Biosicherheitshaube</td><td>AIRTECH</td><td>BSC-1300IIA2</td> <td>\</td></tr> <tr><td>FACS Maschine LSRFortessa X-20</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Antikörper</td><td>BD</td> <td>\</td><td></td></tr> <tr><td>Trevigen MD oder BD Matrigel Basalmembran Matrix Hohe Konzentration</td><td>BD</td><td>354248</td><td>\</td></tr><tr><td>FACS Puffer</td><td>BD</td><td>554656</td><td>Zerkleinerungspuffer</td></tr><tr><td>Brilliant Staining Buffer</td><td>BD</td><td>563794</td><td>\</td></tr><tr><td>Maus BD Fc Block</td><td>BD</td><td>553142</td><td>\</td></tr><tr><td>Zellfilter</td><td>BD-Falcon</td><td>352350</td><td>70 &micro; m</td></tr><tr><td>Routine Blutröhrchen</td><td>BD-Vacutainer</td><td>365974</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman</td><td></td><td>vs 1,5</td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>\</td></tr><tr><td>Foxp3 Fix/Perm Kit</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>\</td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>ebioscience</td><td>01-2222-42</td><td>\</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810R,5920R</td><td>\</td></tr> <tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo LLC</td> <td>\</td> <td>vs 10.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30809.01</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Einweg-, sterile Skalpelle</td><td>Jin zhong</td><td>J12100</td><td>11 #</td></tr> <tr><td>Messergriff</td><td>Jin zhong</td><td>J11010</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Augenschere und Pinzette</td><td>Jin zhong</td><td>Y00030</td><td>Augenschere 10 cm</td></tr><tr><td>Augenschere und Pinzette</td><td>Jin zhong</td><td>JD1060</td><td>Augenpinzette 10 cm mit Zähnen</td></tr><tr><td>Tragbarer Flüssigstickstofftank</td><td>Jinfeng</td><td>YDS-175-216</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Elektronische Waage</td><td>Metter Toledo</td><td>AL204</td><td>0-100 g</td></tr><tr><td>Miltenyi C-Röhren</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-334</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Miltenyi Sanfte MACS mit Heizblöcken</td><td>Miltenyi</td><td>120-018-306</td><td>\</td></tr><tr><td>Tumor Dissoziationskit</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-730</td><td>\</td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer</td><td>Cellometer Auto T4</td></tr><tr><td>Kryokonservierungsröhrchen</td><td>Nunc</td><td>375418</td><td>1,8 mL</td></tr><tr><td>Cultrex Hohe Proteinkonzentration (HC20+) BME</td><td>PathClear</td><td>3442-005-01</td><td>\</td></tr><tr><td>Spritzen</td><td>Shanghai MIWA Medizintechnik</td><td>\</td><td>1-5 mL</td></tr><tr><td>Studylog-Software</td><td>Studylog</td><td>\</td><td>Software</td></tr><tr><td>Studylog-Balance und Unterstützung von USB</td><td>OHAUS</td><td>SE601F</td><td>Balance und Unterstützung von USB</td></tr><tr><td>Studylog-Datenleitung von Messschiebern</td><td>Sylvac</td><td>926.6721</td><td>Datenleitung von Messschiebern</td></tr><tr><td>Bremssattel</td><td>Sylvac</td><td>910.1502.10</td><td>Sylvac S-Cal pro</td></tr><tr><td>Sterilisierte Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo</td><td>339653</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Sterilisierte Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo</td><td>339651</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>Thermo</td><td>KLCS-288</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>Thermo</td><td>PLF-276-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>Thermo</td><td>DW-862626-80</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermo</td><td>am7021</td><td>\</td></tr></tbody></table>

die immunphänotypisierung der orthotopen homograft (phänomen) der murinen primäre kpc duktales pankreaskarzinom durch durchflusszytometrie

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (Phänomen) Tumoren sind das "Arbeitspferd" der heutigen Immuno-Onkologie (e/a) präklinischen Forschung. Der Tumor Mikroumgebung (TME), besonders seine immun-Komponenten ist entscheidend für die Prognose und Vorhersage der Behandlungsergebnisse, insbesondere der Immuntherapie. TME immun-Komponenten bestehen aus verschiedenen Untergruppen von Tumor infiltriert Immunzellen bewertbar durch mehrfarbige FACS. Duktales Pankreaskarzinom (PDAC) zählt zu den tödlichsten Malignances fehlen gute Behandlungsmöglichkeiten, so eine dringende und ungedeckten medizinischen Bedarf. Ein wichtiger Grund für seine nicht-Reaktion auf verschiedene Therapien (Chemo-, gezielte, I/O) wurde seine reichlich TME, bestehend aus Fibroblasten und Leukozyten, die Tumorzellen von den Therapien zu schützen. Orthotopically implantierten PDAC geglaubt wird, um mehr genau zurückzuerobern TME der menschlichen pankreaskarzinome als herkömmliche subkutaner (SC) Modelle.
Homograft Tumoren (KPC) sind Transplantationen von Maus spontane PDAC aus gentechnisch KPC-Mäuse (K-RasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Der primäre Tumor-Gewebe ist schneiden Sie in kleine Fragmente (~ 2 mm3) und subkutan transplantiert (SC) an das Phänomen Empfänger (C57BL/6, 7 – 9 Wochen alt). Die Homografts wurden dann chirurgisch Orthotopically verpflanzt auf die Bauchspeicheldrüse von neuen C57BL/6 Mäusen zusammen mit SC-Implantation, die Tumor-Volumen von 300-1.000 mm3 von 17 Tagen erreicht. Nur Tumoren von 400 – 600 mm3 wurden gemäß dem genehmigten Autopsie Verfahren geerntet und gereinigt, um die angrenzenden keinen Tumor-Gewebe zu entfernen. Sie wurden getrennt pro Protokoll mit einem Gewebe Dissociator in einzellige Suspensionen, gefolgt von Färbungen mit dafür vorgesehenen Platten von eindringmittel-markierten Antikörpern für verschiedene Marker von verschiedenen Immunzellen (lymphoide, myeloischen und NK, DCs). Die gefärbten Proben wurden analysiert mit multi-Color FACS um Zahlen von Immunzellen der verschiedenen Linien, sowie ihr relativer Anteil innerhalb von Tumoren zu bestimmen. Die immun Profile der orthotopen Tumoren wurden dann mit den SC Tumoren verglichen. Die vorläufigen Daten bewiesen deutlich erhöhten eindringende TILs/TAMs in Tumoren in der Bauchspeicheldrüse und höhere B-Zell-Infiltration in Orthotopic anstatt SC Tumoren.

Orthotopen Implantation der PDAC führte zu schnelle Tumorwachstum ähnlich gesehen für die SC-Implantation. Nachdem die Spender Tumor Fragmente in Empfänger Mäuse implantiert wurden sowohl subkutan und Orthotopically gemäß den Protokollen beschrieben Schritte 2.1 und 2.2, die implantierten KPC Homograft Tumoren gezeigt ähnlich rasant wie in Abbildung 1A . KPC Homograft Tumoren zu unterschiedlichen Zeitpunkten geerntet sind in Abbildung 1 b...

Die Versuchsdurchführung auf die Immunphänotypisierung der murinen orthotopen PDAC Homografts bezweckt die Profilierung der Tumor Immuno-Mikroumgebung. Tumoren sind Orthotopically über Operation implantiert. Tumoren von 200 – 600 mm3 in der Größe wurden geerntet und distanzierte um einzellige Suspensionen, gefolgt von Multi-immun FACS Markeranalyse mit verschiedenen fluoreszent-markierten Antikörpern vorzubereiten.

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Diese Meldung kann helfen, wichtige Fragen in Immunophenotypisierung in Murine-Modellen zu beantworten, wie Marker verwendet, um verschiedene Immunitätslinien und Alterungsstrategien zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass der Marker und die Alterungs-Stategies, wenn Dieimmunonotypisierung, auf eine Vielzahl von murinen Modellen angewendet werden können. Überwachen Sie das Körpergewicht von C57 Black 6 Mäusen mit einem Gleichgewicht.Überwachen Sie auch das Tumorvolumen von Tumor-verschiedenen Spendermäusen durch Kalibermessung. Nach der Euthanasie des Tieres in einer Biohazard-Haube nach Protokoll, sterilisieren Sie die Haut um den Tumor mit Iodophor Tupfer. Nach der chirurgischen Entfernung des Tumors, wie im Textprotokoll beschrieben, legen Sie den Tumor in eine Petrischale mit 20 Milliliter PBS, die auf 4 Grad Celsius vorgekühlt wurde.Wenn es verunreinigendes Blut gibt, übertragen Sie den Tumor in eine andere Petrischale und waschen Sie den Tumor mit PBS. Den Tumor halbieren. Entfernen Sie zusätzliche Haut, Gefäße, Verkalkung und Nekrose.Wählen Sie nur intakte Tumorstücke und legen Sie sie in ein steriles 50 Milliliter Zentrifugenrohr. Fügen Sie 20 Millilite

immunophenotyping-orthotopic-homograft-syngeneic-murine-primary-kpc

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Krebsstammzellen (CSCS) haben in einer Reihe von Tumoren identifiziert worden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine durchflusszytometrische Methode unter Verwendung Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität und CD44 und CD24-Expression auf CSCs aus menschlichen Pankreaskarzinom Xenotransplantate isolieren. Diese entwicklungsfähigen Zellen können dann in funktionelle und analytische Untersuchungen verwendet werden.

Isolierung von Stammzellen aus menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebs Xenografts

Das Video erklärt eine schrittweise chirurgische Methode zur orthotopen Implantation eines Tumorfragments von einem krebsartigen Spender in die Bauchspeicheldrüse einer nicht krebsartigen Empfängermäuse zur Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs. Orthotopisch implantiertes PDAC könnte die Gewebemikroumgebung von menschlichem Bauchspeicheldrüsenkrebs genauer erfassen als herkömmliche subkutane (SC) Modelle.

Orthotope homotransplantierte Tumortransplantation: Eine Technik zur Generierung von Mausmodellen für Pankreastumoren

Die Erzeugung eines orthotopischen Rattenmodell der pleuralen malignes Mesotheliom durch Implantation von II-45 Mesotheliomzellen in die Pleurahöhle von immunkompetenten Ratten dargestellt. Eine durchflusszytometrische Verfahren zu sieben Immunzelluntergruppen in diesen Tieren aus einem 25 &amp; mgr; l Blutprobe zu analysieren, wird ebenfalls beschrieben.

Orthotopen Implantation und der peripheren Immunzellenüberwachung in der II-45 Syngene Rat Mesotheliom Modell

Wir skizzieren ein Protokoll zur gleichzeitigen Ausdruck der Leukämie Stammzell-Marker auf primäre akute myeloische Leukämie-Zellen durch Durchflusszytometrie zu erkennen. Wir zeigen, wie Sie drei Vorläuferzellen Populationen und eine vermeintliche LSC Bevölkerung mit zunehmendem Grad der Reifung zu quantifizieren. Wir bestätigte das Vorhandensein dieser Populationen in entsprechenden Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate.

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Hier beschreiben wir eine minimalinvasive Phänomen orthotopen Transplantation Modell der Lunge Adenokarzinom Mauszellen als Zeit und kostensenkende Modell, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs zu studieren.

Orthotopen Transplantation von Phänomen Lungenzellen Adenokarzinom, PD-L1 Ausdruck zu studieren

Wir beschreiben ein Protokoll für die ultraschallgeführte Implantation von murinabgeleiteten duktodrischen Adenokarzinom-Zelllinien direkt in die native Tumorstelle. Dieser Ansatz führte zu Pankreastumoren, die durch Ultraschall-Scanning innerhalb von 2-4 Wochen nach der Injektion nachweisbar waren, und reduzierte den Anteil der Tumorzellsaatierung an der Peritonealwand im Vergleich zur chirurgischen orthotopischen Implantation signifikant.

Ultraschallgeführte orthotopische Implantation von murine Pankreas-Ductalsocarcinom

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

Hier stellen wir ein Tumortransplantationsprotokoll zur Charakterisierung von tumorinhärenten und peripherieabgeleiteten tumorinfiltrierten Lymphozyten in einem Maustumormodell vor. Die spezifische Verfolgung des Zustroms von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen mit Durchflusszytometrie zeigt die Dynamik der phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen während der Antitumor-Immunantwort.

Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen

Syngene orthotope Allotransplantate der Maus des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse (PDAC) rekapitulieren die Biologie, die Phänotypen und das therapeutische Ansprechen von Krankheitssubtypen. Aufgrund ihrer schnellen, reproduzierbaren Tumorprogression sind sie in präklinischen Studien weit verbreitet. In dieser Arbeit zeigen wir gängige Praktiken zur Generierung dieser Modelle, indem wir syngene murine PDAC-Kulturen in die Bauchspeicheldrüse injizieren.

Syngene orthotope Allotransplantate der Maus zur Modellierung von Bauchspeicheldrüsenkrebs

Wir beschreiben eine Methode, um tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) von Mäusen mittels Durchflusszytometrie für den adoptiven Zelltransfer zu nutzen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die spezifische Zytotoxizität von TILs gegen Tumore in einem syngenen Pankreaskarzinom-Mausmodell zu verifizieren und Einblicke in die Entwicklung adoptiver Zelltherapien für Bauchspeicheldrüsenkrebs zu geben.

Durchflusszytometrie-basierte Isolierung und therapeutische Bewertung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten in einem Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Hier wird eine auf Phosphoflow-Zytometrie basierende Methode zur Analyse der Signalwege stromabwärts der mTORC1-, JAK/STAT5- und MAPK-Signalwege in akuten humanen myeloischen Leukämiezellen beschrieben, die in Mäuse xenotransplantiert und aus Knochenmarkaspiraten gewonnen wurden. Die Werte von p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 und p-ERK1/2 werden gleichzeitig mit einem spektralen Durchflusszytometer der nächsten Generation mit hoher Empfindlichkeit gemessen.

Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie

Lernen Sie die Immunphänotypisierung orthotoper Pankreaskarzinom-Homografts in murinen Modellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Profilierung des Tumor-Immunmikromilieus für translational onkologische Forschung.

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie

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