Name: De Novo Generation von somatischen Stammzellen von YAP/TAZ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Reprogrammierung differenzierter Zellen zu Stammzellen mittels YAP-Expression. Diese Methode nutzt lentivirale Vektoren und transgene Systeme für regenerative Medizin und Krebsforschung.

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Wir danken für das Geschenk von TetO-YAPS127A MäusenF. Camargo; R26-rtTAM2 Mäuse (Lager #006965) wurden von The Jackson Laboratory gekauft. Wir danken Chiara Frasson und Giuseppe Basso für Hilfe mit FACS-Verfahren. Diese Arbeit wird unterstützt durch AIRC spezielle Programm Molekulare Clinical Oncology '' 5 Promille '' und ein AIRC PI-Grant, S.P und Epigenetik Vorzeigeprojekt CNR-Miur gewährt S.P. Dieses Projekt wird finanziell vom European Research Council (ERC) unter der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm (Finanzhilfevereinbarung DENOVOSTEM Nr. 670126).

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</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier präsentieren wir Protokolle, um ex-Vivo unheilbar differenzierten Epithelzellen der verschiedenen Geweben in ihre entsprechenden gewebespezifischen Vorläuferzellen (oder ySCs) umprogrammieren von Transienten Expression von YAP, wie bereits berichtet1. Wir haben zwei Verfahren detailliert: eine Reprogrammierung von FACS gereinigt durch Lentivirale Vektoren und eine zweite, die virale Infektion vermeidet und nutzt die Vorteile der transgenen YAP Ausdruck ermöglicht. Jedes Protokoll stellt eine effiziente Strategie zu isolieren und Kultur primären differenzierte Zellen und eine Strategie zur exogenen Kraft YAP Genexpression in differenzierten Zellen generieren de Novo gewebespezifischen erweiterbar gewebestammzellen (siehe Regelungen in Abbildungen 1A und 2A).
Wir bewiesen, dass die hier vorgestellten effektiv isoliert-Strategien eine reine Bevölkerung von differenzierten Zellen isolieren, wie durch die Tatsache bewiesen, dass wir nie irgendwelche Auswuchs von negativen Kontrollproben (Abbildungen 1 und 2 C) erkannt.
Die Lentivirale Vektoren verwendet in dieser Studie für die Reprogrammierung von primären Mamma LD sind Doxycyclin induzierbaren, bietet die Möglichkeit, eine strenge Kontrolle des Transgens Ausdrucks; Dadurch schalten und aus exogenen YAP Ausdruck zu werden. Besondere Aufmerksamkeit sollte in den Verzicht auf eine übermäßige virale Titer platziert werden, wie dies im Hinblick auf die Umprogrammierung Effizienz nachteilig sein kann. Im Falle der primären acinar Zellen wechselten wir in ein vollständig transgenen Ansatz zu einer YAP-abhängige Neuprogrammierung mit minimalen Manipulationen. Diese letztere Strategie eignet sich auch besonders für primäre pankreatischen Azini, wie isolierte acinar Cluster Lentivirale Infektion kaum zugänglich und sehr zerbrechlich sind. Die transgenen Strategie bietet den gleichen Vorteil von Doxycyclin-abhängige Lentivirale Vektoren für die strenge Kontrolle der Genexpression. Darüber hinaus trägt die transgenen Strategie ausgenutzt mit primären pankreatischen Azini den Vorteil einer wesentlich höheren Neuprogrammierung Wirkungsgrad im Vergleich zu der viral induzierten Reprogrammierung von Mamma LD. Über die verschiedenen intrinsischer Plastizität Zellen aus verschiedenen Geweben zugeordnet kann die höhere Rate der pankreatischen Neuprogrammierung von der höheren Effizienz der Ausdruck verbunden, einheitliche und autonome YAP Ausdruck in allen abgeleitet werden explantierten Zellen. Insbesondere haben wir gezeigt, dass exogene YAP nach der Generierung von ySCs (yMaSC-Kolonien und yDucts), entfällt ohne ihre Selbsterneuerung Kapazität. Und zwar deshalb, weil ySCs endogenen YAP/TAZ zu reaktivieren und nutzen sie für Selbsterneuerung1exogene YAP ausgeschaltet ist.
Wir validiert die Vorstellung, die ySCs in der Tat von differenzierten Zellen entstehen durch die Kontrolle der Zelle der Ursprung unserer Neuprogrammierung Experimente durch genetische Abstammung-Ablaufverfolgung Validierungen1.
Umfassende Charakterisierungvon ySCs zeigt, dass YAP-induzierte Umprogrammierung normale somatische SCs1 als ich erzeugt) auf der transkriptomischen Ebene anzeigen ySCs massive Überschneidungen mit native SCs; (II) ySCs Anzeige Differenzierungspotenzial und erzeugen eine multilineage Nachkommen immer beschränkt auf die Identität des ihr Gewebe des Ursprungs; (III) ySCs werden nicht verändert und nicht tumorigenic wann verpflanzt in Vivo.
Hier beschreiben wir auch Verfahren zu erhalten und zu erweitern in der Kultur yMaSCs und yDucts als Organellen in 100 % Basalmembran Matrix Hydrogele eingebettet. Diese Bedingungen ermöglichen für die Selbstorganisation des ySCs in dreidimensionale Organellen, die Stemness Eigenschaften Kultur langfristig zu gewährleisten, ermöglichen, diese zu erweitern Bevölkerung nach Belieben für nachgelagerte Analysen und Anwendungen stammen. Aus unbekannten Gründen wir Fehler beim Abrufen yMaSC Organellen indem man infiziert LD Zellen direkt in organoide Kulturbedingungen 7 Tage nach der Behandlung Doxycyclin in Kunststoff Gewebekultur Platte; in anderen Worten, ist der mittlere Wachstum Schritt in Mamma Kolonie Bedingungen unerlässlich. In unseren Händen erfordern auch native MaSCs Mamma Kolonie Bedingungen vor passagierung in organoide Kultur. Darüber hinaus wird die effizienteste organoide Auswuchs erreicht, wenn wir vermeiden, liegt die primäre Kolonien in einzelnen Zellen, sondern die intakten Kolonien in organoide Kulturbedingungen übertragen.
Organoide Kulturbedingungen tragen auch den Vorteil bietet die Möglichkeit, ySCs, Tiefgefrieren, vorausgesetzt, dass die Organellen aus ihrer Matrizen, Vermeidung von Zelle Dissoziation vor der Kryokonservierung in Stickstoff Bad zurückgewonnen werden.
Die YAP Umprogrammierung Verfahren vorgestellt kann verschiedene differenzierte Zelltypen abgeleitet aus verschiedenen Erwachsenen Geweben in ihren entsprechenden gewebespezifische Stammzellen (wir haben es mit Mamma, Pankreas und neuronalen Zellen getestet) umwandeln1. Im Unterschied zu iPSCs oder andere Neuprogrammierung Bemühungen können YAP/induzierte SCs die Erinnerungen an ihr Gewebe Herkunft pflegen. Der Hinweis de-Differenzierung der somatischen Zellen in Zellen mit Stiel-ähnliche Eigenschaften ausgestattet ist die einzige Form der Zelle Schicksal Plastizität und Umprogrammierung in vivo beobachtet, zum Beispiel nach Gewebeschäden und zur Unterstützung der Wundheilung5,17 , 18 , 19 , 20. es ist bemerkenswert, dass YAP und TAZ für normale Homöostase weitgehend entbehrlich sind aber entscheidend für die Reparatur von Gewebe in mehreren Geweben11,21. Konsequent mit einer physiologischen Funktion der Neuprogrammierung Schritte hier beschrieben, haben YAP/TAZ kürzlich gezeigt, dass im Darm Regeneration in Mausmodellen der Colitis ulcerosa Patienten geforderten verursacht eine Umwandlung von Erwachsenen Darmzellen in eine Reparatur von Epithel, die Funktionen des fetalen Darm19anzeigt. YAP Umprogrammierung erweitert somit die aktuellen induzierte Zelle Plastizität Strategien indem Sie ein Mittel zu generieren somatische Stammzellen, ein Staat, der bislang streitig gemacht, in Vitrozu erfassen. Dieser Ansatz, könnte wenn auch auf Menschen-abgeleitete Zellen erweitert haben breite Relevanz aus regenerativen Medizin Anwendungen zur Erforschung des somatischen Stemness Staates und ergeben sich für die Erweiterung der somatischen Zellen in Vitro.

Gewebe-spezifische somatische Stammzellen (SCs) sind entscheidend für Gewebe Erneuerung und Reparatur nach Verletzung. Die Möglichkeit, leicht isolieren und unbegrenzt erweitern Ex Vivo somatische SCs stellt ein schwerwiegendes Problem für potenzielle regenerative Therapien sowie für SC-Anwendungen in der Grundlagenforschung und Krankheit Modellierung. Fortschritte in dieser Richtung wurde jedoch durch die Schwierigkeit der Erfassung des SC-Zustand der verschiedenen epithelialen Organe in Vitrobegrenzt. In der Tat in mehreren adulten Geweben resident SCs können nicht vorhanden oder nicht verfügbar sein, oder ihre Anzahl und regenerative Potenzial können durch Alterung oder Krankheit Bedingungen erodiert. Im Jahr 2016 haben wir begonnen, diese Lücke durch die Berichterstattung dieser Ausdruck einer einzigen transcriptional Coactivator YAP (ja-assoziierten Protein) oder die eng verwandten Protein TAZ (transcriptional Aktivator mit einem PDZ-Motiv), unheilbar differenzierte Zellen effizient schafft funktionale, erweiterbar, nicht tumorigenic, autologe Zell-Populationen, die operativ und Molekular von ihren entsprechenden gewebespezifischen SCs1zu unterscheiden sind. Ein Puls von getragen YAP oder TAZ Aktivität für einige Tage ist ausreichend, um das Aussehen der selbst erneuern somatische SCs zu induzieren. Dies ist ein stabiler Zustand, der nicht mehr kontinuierliche Transgene Ausdruck abhängig ist, wie es durch Zelle Generationen ohne weitere Ausdruck ektopische YAP/TAZ1übertragen werden kann. Das Protokoll hier vorgestellten Einzelheiten des Verfahrens Erzeugung von de Novo epithelialen Stammzellen/Vorläuferzellen der Brustdrüse und der Bauchspeicheldrüse zur, differenzierte Zellen dieser Gewebe ab. Diese Prozedur füllt eine Black Box in der aktuellen Neuprogrammierung/Transdifferenzierung Arena. Große Anstrengungen in diese Richtungen haben in der Tat bisher zentriert auf Zelle Übergang zu einem induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) Zustand, gefolgt von der Umwandlung von diesen embryonalen und pluripotenten SCs in differenzierter Zellen. Allerdings sind iPSCs tumorigenic einmal in adulten Geweben, heben die Notwendigkeit der Entwicklung von Protokollen für ihre vollständige und effiziente Differenzierung2eingeführt. Jedoch kommt diese Differenzierung Schritt, auch wenn möglich, zum Preis von langfristigen Erweiterbarkeit, Selbstorganisation und Orgel Wiederbesiedlung Potenziale. Das sind wesentliche Attribute für Organregeneration, die in der Tat nur der endogenen gewebespezifischen SCs und der derzeit beschriebenen YAP-induzierte SCs (ySCs) typisch sind. In ähnlicher Weise differenzierte direkte Transdifferenzierung von einem Zelltyp ineinander mit Cocktails aus verschiedenen Transkription Faktoren auch erzeugen Zellen, die wesentliche proliferative und Stemness mögliche3fehlt.
Das hier beschriebene Verfahren nutzt auch die kürzlich eingeführte organoide Technologie, durch die endogene SCs erweiterbar und ex Vivo4differenziert. YAP-induzierte SCs können organoide Formen SCs sogar im Versuchsbedingungen, biologische oder Krankheit generieren in denen endogenen SCs nicht vorhanden sind. Wir möchten beachten, dass sich die Differenz mit anderen Neuprogrammierung Verfahren, die Art der Zelle Plastizität durch YAP vermittelt die einzige Form der Rückfall in eine SC-Status wie entsprechen kann, die in lebendes Gewebe auftritt. Rückgewinnung von SC-ähnlichen Merkmalen wurde Gewebereparatur oder Onkogene Aktivierung5zugeordnet. Obwohl entbehrlich für die Homöostase von mehreren adulten Geweben sind YAP und/oder TAZ absolut notwendig für Regeneration, Tumorwachstum und Erweiterung der somatischen SCs in Vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table><tbody><tr><td>10 mL sterile Spritzen</td><td>Rays</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>100 mm&nbsp; Zellsieb</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL sterile konische Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten mit ultraniedrigem Aufsatz</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>40 mm Zellsiebe</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>48-Well-Multiwell-Platten</td><td>Corning</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>50 mL sterile konische Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Multiwell-Platten</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ I</td><td>Sigma</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>Einwegskalpelle</td><td>Swann-Morton</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DnaseI</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin Hyclat</td><td>Sigma</td><td>D9891&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>FACS Röhrchen (mit Siebkappen)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-Maus CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#19780&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-EGFP</td><td>Addgen</td><td>&nbsp;#84041</td><td>als Negativkontrolle</td></tr><tr><td>FUW-tetO-MCS</td><td>Addgen</td><td>&nbsp;#84008</td><td>als Negativkontrolle</td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgen</td><td>&nbsp;#84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgen</td><td>&nbsp;#84010</td><td>als Negativkontrolle (transkriptionell tote YAP-Mutante)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Pufferlösung (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>humanes R-Spondin1 (His Tag)</td><td>Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase aus Rinderhoden</td><td>Sigma</td><td>H3506&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>K-14 Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>Ab7800</td><td></td></tr><tr><td>K-8 Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>AB14053&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lin (Allophycocyanin [APC] Antikörper-Cocktail aus der Mauslinie)</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&reg; Wachstumsfaktor reduzierte Basalmembranmatrix, phenolrotfreies</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>nicht-zellklebende 10 cm Schalen (sterile Petrischale aus Polystirol & Oslash; 94)</td><td>ROLL</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclone</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PE Hamster Anti-Maus CD61</td><td>BD Biosciences</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Ratte Anti-Human CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>551129</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Anti-Maus/Ratte CD29 Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail Collagen I (Beschichtung)</td><td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail Collagen I für 3D-Kultur</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant human FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant human Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant murine EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant murine FGF basic (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (Trypsin-Inhibitor ab Glycin max)</td><td>Sigma</td><td>T6522&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris BASE&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth medium</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

de novo generation von somatischen stammzellen von yap/taz

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Hier präsentieren wir Protokolle, um primäre differenzierte Zellen und drehen Sie sie in Stamm/Vorläuferzellen (SCs) derselben Linie durch transiente Expression des Transkriptionsfaktors YAP zu isolieren. Mit dieser Methode werden luminalen differenzierte (LD) Zellen der Brustdrüse Maus in Zellen umgewandelt, die molekulare und funktionelle Eigenschaften von Mamma SCs. YAP auch Kurven voll differenzierte exokrinen Pankreaszellen in Pankreas Rohr-ähnliche aufweisen Stammväter. In ähnlicher Weise an endogenen, natürlichen SCs, YAP-induzierten Stammzellen-ähnliche Zellen ("ySCs") schließlich als organoide Kulturen langfristig in-vitro- ohne weitere Notwendigkeit ektopische YAP/taz, erweiterbar wie ySCs mit einem Erbbaurecht selbst erneuernde SC-ähnlichen Zustand ausgestattet sind.
Die Neuprogrammierung Verfahren hier vorgestellten bietet die Möglichkeit zu generieren und in-vitro- Vorläuferzellen der verschiedenen Gewebe Quellen ausgehend von differenzierten Zellen zu erweitern. Die einfache Erweiterung der somatischen Zellen ex Vivo hat Folgen für regenerative Medizin, Verständnis der Mechanismen der Tumorentstehung und im Allgemeinen für Zell- und Entwicklungsbiologie Studien.

Generation von yMaSCs Ein Überblick über die experimentelle Strategie zur primäre Mamma LD-Zellen durch transiente Expression von YAP zu programmieren ist in Figur 1Apräsentiert. Primäre Mamma LD Epithelzellen sind durch Leuchtstofflampen-aktivierte Zelle Sortieren13gereinigt. Abbildung 1 b stellt eine typische Sortierung Prozedur zu drei unterschiedliche Subpopulationen: Basalzellen (EpCAMniedrigeCD49fhoheCD61–), luminalen Vorläuferzellen (LP) Zellen (EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61+ ) und LD-Zellen (EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61–). Vorsichtig sein, dass von den drei Subpopulationen gating ist unerlässlich um eine reine Herstellung von LD-Zellen zu isolieren, die vollständig unterscheiden sich und völlig Wachstum bei ausgesät in Brustdrüse koloniebildenden Bedingungen (siehe Abbildung 1, Links Panel) verhaftet. Umgekehrt, starten, wenn induziert, exogene YAP auszudrücken, LD Zellen vermehren um leicht erkennbar dichten epithelialen Kolonien in 5 % Basalmembran Matrix Suspensionskulturen (Abbildung 1) bilden. Die Effizienz der Neuprogrammierung, bezeugt rund 3 % für ein typisches experiment, kann durch zählen der Anzahl der Kolonien über die Anzahl der Einzelzellen, die ursprünglich in Basalmembran Matrix Suspensionskulturen (Abbildung 1) ausgesät gewertet. Umprogrammierten luminalen Zellen (yMaSCs) kann dann Übergang in 100 % Basalmembran Matrix organoide Kulturbedingungen (siehe Schema in Abbildung 1A), Self-organizing in komplexe organoide-ähnliche Strukturen, die um mehrere Lumen zu entwickeln und bemerkenswerte Selbsterneuerung Fähigkeit auch in Abwesenheit von Doxycyclin (d.h. in Abwesenheit von transgenen YAP Ausdruck) angezeigt (Abbildung 1E). Histologisch, yMaSC-abgeleitete Organellen zeigen eine basale Schicht (K14 positiv), mit Blick auf die Basalmembran Matrix rekonstituiert ECM und einer luminalen Schicht (K8 positiv), mit Blick auf die Lumen-Vertiefungen innerhalb der organoide (Abb. 1F). Diese Architektur ist zu unterscheiden von der Organellen durch native MaSCs (Abb. 1F) gebildet.
Generation von yDucts Ein Überblick über die experimentelle Strategie zur primären pankreatischen Azini durch transiente Expression von YAP zu programmieren ist in Abbildung 2Apräsentiert. Gesamte acinar Cluster sind von den Großteil der Bauchspeicheldrüsen-Gewebe durch eine Kombination aus milden Dissoziation und Größe Ausgrenzung durch Filtrierung isoliert. Eine typische Zubereitung wird in Abbildung 2 bdargestellt. Nach Isolierung sollte die acinar zellcluster als Suspension der exokrinen acinar Einheiten der homogene Größe ohne Kontamination durch endokrine Langerhans Inseln oder Fragmente der pankreatischen duktalen Baum und minimale Dissoziation Einzelzellen angezeigt werden. Kontamination durch endokrine Inselchen oder duktale Fragmente ist ein Hinweis auf mangelhafte selektive Filterung (Schritt 2.1.10), möglicherweise durch raue Handhabung; unerwünschte Dissoziation von acinar Clustern einzelner Zellen möglicherweise aufgrund übermäßigen Kollagenase-Behandlung oder ungepufferter Aktivität der proteolytischen Enzymen durch das Gewebe, die durch zusätzliche SBTI Behandlung gebremst werden kann.
Ein typisches acinar Neuprogrammierung Experiment ist in Abbildung 2dargestellt. innerhalb von 5-7 Tagen Kultur in 3D Kollagen-ich Sitz Hydrogel in Anwesenheit von Doxycyclin, Pankreas Azini abgeleitet R26-rtTAM2/TetO-YAPS127A Mäuse leicht biegen Sie in Rohr-ähnliche Cluster (, den wir yDuctsgenannt), bestehend aus einer dünnen Monolage von epithelialen Zellen, die um eine expandierende zentralen Hohlraum zu vermehren. Die Neuprogrammierung Effizienz, die rund 70 % für ein typisches Experiment ist, kann leicht gemessen werden, erzielte die Anzahl der Rohr-ähnliche Cluster über die Gesamtzahl der kernigen Azini (Abb. 2D). Die Negativkontrolle Zellen, d. h. R26-rtTAM2 / + oder R26-rtTAM2/TetO-YAPS127A Zellen Links ohne Doxycyclin, unveränderlich bleiben als Post-mitotische acinar Cluster in diesen Kulturbedingungen, wie bereits berichtet1 ,14,15. Umprogrammierten yDucts kann dann auf der Ebene der einzelnen Zelle in Matrigel-basierte organoide Kultur Bedingungen16 passagiert werden (siehe Schema in Abbildung 2A), bemerkenswerte Selbsterneuerung Fähigkeit auch in Abwesenheit von Doxycyclin (d.h. anzeigen in Abwesenheit von transgenen YAP Ausdruck) (Abb. 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Abbildung 1: Isolation von primären Mamma LD Zellen und Induktion von Mamma Stammzellen. (A) schematische Darstellung der Versuchsanordnung angenommen primäre Mamma LD Zellen umzuprogrammieren. (B) Vertreter FACS-Darstellungen zur Veranschaulichung einer typischen Sortierung Prozedur LD Zellen zu reinigen. (i) dissoziierte Zellen werden nach vorwärts und seitliche Streuung für lebende Zellen (P1; blau) angespritzt. (II) Bevölkerung P1 ist dann weiter nach Lin Profil eingezäunt: Subpopulation von Lineage-negativen Zellen (P2; grau) ausgewählt ist, ausgenommen Linie-positiven hämatopoetische Zellen; (III) Bevölkerung P2 wird dann in einer EpCAMhoch (P3; gelb + grün) und eineniedrige (P6; rot) Subpopulationen EpCAM getrennt; (IV) P3 und P6 werden dann weitere angespritzt entsprechend ihrer CD61/CD49f Profil in drei Untergruppen: EpCAMniedrigeCD49fhoheCD61– Basalzellen (P7; rot), EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61+ LP Zellen (P8; gelb) und EpCAMhoheCD49fniedrigenCD61– LD Zellen (P9; grün). (C) Bilder sind Beispiele für die Fähigkeit der LD Zellen, infiziert mit dem angegebenen Konstrukten, Mamma Kolonien bilden 15 Tage nach der Aussaat in Mamma Kolonie Medium. Nur YAP exprimierenden Zellen wiederum in koloniebildenden Zellen, während negative Kontrolle (EGFP-infizierten) Zellen bleiben als Einzelzellen Wachstum verhaftet. Maßstabsleiste = 50 μm. (D) Quantifizierung der koloniebildenden Fähigkeit der angegebenen Zellen, wie in (C). Daten sind als Mittelwert + s.d. präsentiert und sind Vertreter von fünf unabhängigen Experimenten, jeweils mit sechs technischen repliziert. (E) repräsentatives Bild von YAP umprogrammiert Mamma Stammzell-ähnliche Zellen (yMaSCs) nach 12 Tagen in organoide Kulturbedingungen in frischen dreidimensionale 100 % Basalmembran Matrix Hydrogel in Ermangelung von Doxycyclin. Maßstabsleiste = 100 μm. (F) repräsentative Immunfluoreszenz Bilder für die basalen Marker K14 (grün) und der luminalen Marker K8 (rot) von Organellen abgeleitet aus den angegebenen Zellen nach 12 Tagen in organoide Kulturbedingungen. Maßstabsleiste = 10 μm. Diese Zahl wird von Panciera Et Al., 20161wiedergegeben. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Abbildung 2 : Isolierung des primären pankreatischen acinar Zellen und Induktion von Pankreas Vorfahren. (A) schematische Darstellung der Versuchsanordnung reprogram primäre acinar Zellen der Bauchspeicheldrüse exokrine angenommen. (B) repräsentatives Bild der primären pankreatischen Azini kurz nach der Isolierung-Verfahren (Schritt 2.1.14). Die acinar Vorbereitung sollte als eine homogene Suspension acinar Cluster mit minimalen Präsenz einzelner Zellen erscheinen. Maßstabsleiste = 400 μm. (C) repräsentative Bilder von primären pankreatischen Azini abgeleitet R26-rtTAM2 (oberen Platten)oder R26-rtTAM2; TetO-YAPS127A (untere Verkleidungen) Mäuse und kultiviert in 3-d-Kollagen ich-basierte Hydrogel für 5 Tage mit oder ohne Doxycyclin (Doxy), wie angegeben. Nur konvertieren primäre Azini YAP exprimierenden Zellen wachsen als zystenartigen organoide nach Doxycyclin Zugabe. Skalieren von Balken = 70 μm. (D) Quantifizierung der Fähigkeit der Bauchspeicheldrüse Azini duktale Organellen bei transgenen Überexpression von YAP wie in (C) bilden. Daten sind als Mittelwert + s.d. präsentiert und sind Vertreter von fünf unabhängigen Experimenten mit vier technischen repliziert. (E) repräsentatives Bild von YAP neuprogrammiert duktale-ähnliche Zellen (yDucts) nach drei Passagen in frischen dreidimensionale 100 % Basalmembran Matrix Hydrogel in Ermangelung von Doxycyclin. Maßstabsleiste = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolation von primären Mamma Zellen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 + chelatisierenden Lösung</td>
			<td>Shop bei 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0,02 % w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagen ich Beschichtung Lösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Essigsäure 0.02N, pH-Wert 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Ratte Tail Kollagen (Beschichtung)</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase Lösung</td>
			<td>Shop bei 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dissoziation Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase-Stammlösung</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stammlösung Kollagenase ich</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hämolytische Lösung</td>
			<td>Shop bei 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl-Lösung</td>
			<td>1 Teile</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20,6 g/L</td>
			<td>9 Teile</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH-Wert auf 7,2 einstellen</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Shop bei 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase-Stammlösung</td>
			<td>0,2 µm-Filter, bei 4 ° C lagern</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase aus bovine Hoden (Pulver)</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumphosphat-Puffer 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl-Lösung</td>
			<td>Bei T. Amb lagern.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anpassen der pH-Wert auf 7,65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sortierung der Lösung</td>
			<td>0,2 µm-Filter, bei 4 ° C lagern</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Waschen Sie Medium #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waschen Sie Medium #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mamma 2D Kulturmedium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparin</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Induktion und Passaging von yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mamma Kolonie Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutamin</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (fügen Sie unmittelbar vor der Aussaat)</td>
			<td>5 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mamma organoide Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Erweiterte DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Heparin</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>menschlichen Birne</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Generation von yMaSCs. Zusammensetzung aller verschiedenen Nährmedien und Lösungen für die Isolation von primären Mamma LD Zellen und Induktion von yMaSCs (Abschnitt 1)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolierung der primären pankreatischen Azini</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar Kulturmedium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexamethason</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ABt</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Waymouth Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar Wash Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1 %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinar Rettungsmediums</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar Kulturmedium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ABt</td>
			<td>30 %</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagenase ich Lösung A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinar Wash Medium</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stammlösung Kollagenase ich</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Shop bei 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Stammlösung Kollagenase ich</td>
			<td>Shop bei-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase, Typ ich (Pulver)</td>
			<td>6.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Der pankreatischen Organellen passagierung</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Kollagenase ich Lösung B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 X</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Stammlösung Kollagenase ich</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pankreas organoide Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Erweiterte DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrin</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>menschliche FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>menschlichen Birne</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Murine EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Acetylcystein</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Generation von yDucts. Zusammensetzung aller verschiedenen Nährmedien und Lösungsvorschläge für die Isolierung von primären acinar Zellen und Induktion und passagierung der yDucts (Abschnitt 2).

Verfügbarkeit von somatischen SCs ist entscheidend für die regenerative Medizin Krankheit Modellierung und Einblick in SC Eigenschaften. Hier präsentieren wir experimentelle Strategien reprogram, in Vitro unterscheiden sich adulte Zellen in ihre entsprechenden erweiterbar gewebespezifische Stammzellen/Progenitor-Zellen durch die transiente Expression die transkriptionelle Coaktivator YAP.

De Novo Generation von somatischen Stammzellen von YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, primär differenzierte Zellen durch transiente Expression des Transkriptionsfaktors YAP in Vorläuferzellen der gleichen Linie umzuwandeln. Dieses Reprogrammierungsverfahren bietet die Möglichkeit, in vitro Vorläuferzellen oder stammähnliche Zellen verschiedener Gewebe ausgehend von ihren differenzierten Gegenstücken zu erzeugen, auch wenn die endogenen Stammzellen selten oder schwer zu identifizieren sind. Die hier aufliegende Möglichkeit, somatische Zellen ex vivo zu expandieren, hat Auswirkungen auf die regenerative Medizin, auf das Verständnis von Mechanismen der Zellplastizität, die auch bei Krebs relevant ist, sowie auf das Zellgewebe und die Entwicklung biologischer Studien.Dieses Verfahren füllt eine Blackbox in der aktuellen Reprogrammierungsarena, da wir nicht darauf abzielen, spezialisierte Zellen durch Differenzierung embryonaler Stammzellen herzustellen, sondern gewebespezifische Stammzellen aus differenzierten Zellen. Nachdem Sie 10 weibliche Mäuse gemäß dem Textprotokoll geopfert haben, präparieren Sie die Brustdrüsen, indem Sie einen y-förmigen Schnitt entlang der Bauchhaut machen. Trennen Sie dann mit einer Dumont-Pinzette die Drüsen vorsichtig vom Bauchfell, indem Sie vorsichtig daran ziehen.Legen Sie die präparierten Drüsen in eine nicht zellfreie Klebeschale mit 10 Millilitern eiskaltem HBSS+PS. Verwenden Sie unter einer Gewebekulturhaube 10 Milliliter frisches HBSS+PS, um jede Drüse einmal zu waschen, und legen Sie sie in eine leere, nicht zellgebundene Klebeschale. Anschließend werden die Drüsen mit zwei sterilen Skalpellen fein in ein Kubikmillimeter große Fragmente zerkleinert.Die richtige Zerkleinerung der Drüsen ist für eine effiziente Zellisolierung unerlässlich. Ziehen Sie 20 Drüsen zusammen und versuchen Sie, diesen Schritt innerhalb von drei bis fünf Minuten durchzuführen, um eine optimale Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Unter Verwendung einer serologischen 25-Milliliter-Pipette und 10 Millilitern Dissoziationsmedium wird das zerkleinerte Gewebe aus jeder Schale entnommen und die Suspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt, indem mindestens fünfmal pipettiert wird, um die Gewebeklumpen zu disaggregieren.Inkubieren Sie das Gewebe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter ständigem kräftigem Schütteln. Schleudern Sie dann das verdaute Gewebe bei 400 mal g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang herunter. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, verwenden Sie drei Milliliter hämolytische Lösung, um das Gewebe zu resuspendieren, und inkubieren Sie drei Minuten lang auf Eis.Waschen Sie anschließend mit 10 Millilitern Waschmittel Nummer eins die Zellen. Nachdem Sie das verdaute Gewebe geschleudert und den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Gewebepellet in 10 Millilitern Waschmedium Nummer zwei und plattieren Sie die Zellen in 10 Zentimeter große Gewebekulturschalen. Anschließend werden die Gerichte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.Die Zellsuspension wird in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gegeben und das Röhrchen fünf Minuten lang mit dem 400-fachen g gedreht. Verwenden Sie dann 10 Milliliter der Calcium-Chelatlösung, um das Pellet zu resuspendieren. Nach der Zentrifugation und nach Wiederholung der Wäsche resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern 0,25 % Trypsin-EDTA.Nach der Inkubation der Probe werden fünf Milliliter Dispaselösung, ergänzt mit einem Mikrogramm pro Milliliter DNase, auf die Trypsinlösung gegeben. Um die Klumpen zu disaggregieren, pipettieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze mindestens fünfmal auf und ab und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, wobei Sie alle drei Minuten schütteln. Geben Sie 10 Milliliter Waschmittel Nummer zwei hinzu und filtrieren Sie die Lösung durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen.Schleudern Sie dann die Zellsuspension herunter. Um die Zellreinigung durch FACS durchzuführen, verwenden Sie 200 Mikroliter Waschmedium Nummer eins, um jedes Pellet zu resuspendieren. Fügen Sie dann 44,5 Mikroliter Antikörpermischung hinzu, pipettieren Sie gründlich und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis.Dillutieren Sie die Zellsuspension in 10 Milliliter Waschmedium Nummer eins und schleudern Sie die Probe herunter. Resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei Millilitern Sortierlösung und filtrieren Sie es durch ein FACS-Siebröhrchen, bevor Sie mit der FACS-Trennung der Zellpopulationen fortfahren. Verwenden Sie Waschlösung Nummer eins, um die aus FACS gewonnenen Zellen zu waschen.Verwenden Sie nach dem Entfernen des Überstands ein 2D-Kulturmedium für die Brust, um das Zellpellet zu resuspendieren, und legen Sie eine Platte von 500 Mikrolitern pro Vertiefung auf eine mit Kollagen behandelte Platte. Sieben Tage nach der Doxycyclin-Induktion von lentiviral infizierten primären LD-Zellen geben Sie 150 Mikroliter 05%Trypsin-EDTA pro Well zu den Zellen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sobald die Zellen gewaschen und gezählt wurden, verwenden Sie Memory-Kolonie-Medium, ergänzt mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin, um sie zu resuspendieren.Dann säen Sie 1.000 Zellen pro Well in 24-Well-Platten mit extrem niedrigem Attachment aus, um YAP-exprimierende maskenartige Kolonien zu kultivieren. Um y Masken zu subkultivieren, entnehmen Sie jede Probe und fügen Sie ein Volumen von 10 bis einem Volumen eiskaltem HBSS hinzu, dann inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang auf Eis, um die Basalmembranmatrix zu lösen. Nachdem Sie die Kolonien heruntergeschleudert haben, verwenden Sie eiskaltes HBSS, um die Zellen dreimal zu waschen.Geben Sie dann 05%Trypsin-EDTA zu den Bienenvölkern und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Führen Sie die Kolonien 10 Mal durch eine P1000-Pipettenspitze, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Zählen Sie dann die Zellen und säen Sie sie in Mammakoloniemedium ohne Doxycyclin in 24-Well-Platten mit extrem niedrigem Attachment bei einer kologenen Dichte von 1.000 Zellen pro Well erneut aus.Vor der dritten Passage übertragen Sie y Maskenkolonien unter organoiden Kulturbedingungen, indem Sie die Kolonien aus dem Mammakoloniemedium gewinnen und eine 100%ige Wachstumsfaktor-reduzierte Basalmembranmatrix verwenden, um sie zu resuspendieren. Nach der Inkubation, wenn die Basalmembranmatrix erstarrt ist, überlagern Sie die Gele mit 500 Mikrolitern des Mammaorganoid-Mediums. Durchlaufen Sie die Kulturen, indem Sie jede Organoidprobe sammeln und eine Stunde lang in einem überschüssigen Volumen HBSS auf Eis inkubieren.Anschließend die Organoide mit eiskaltem HBSS dreimal waschen. Trypsinisieren Sie die Organoide, wie zuvor in diesem Video gezeigt, und säen Sie Einzelzellsuspensionen in einem Tropfen einer 100%igen Basalmembranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor erneut aus, dann verwenden Sie 500 Mikroliter Brustorganoidmedium, um die Gele zu überlagern. Nach dem Waschen von verdautem Pankreasgewebe der Maus gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie sechs Milliliter Azinus-Rückgewinnungsmedium, um das verdaute Gewebe vorsichtig zu resuspendieren und es auf zwei Vertiefungen einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte aufzuteilen.Beurteilen Sie unter einem Stereomikroskop sorgfältig die Qualität der Azinusisolierung und entfernen Sie eventuell vorhandene große Gewebeklumpen. Um primäre Pankreas-Acini zu säen, sammelt man nach zweistündiger Inkubation der Cluster zur Zellrückgewinnung die Azinuszellsuspension in einem konischen Röhrchen und zentrifugiert die Proben fünf Minuten lang bei 100 mal g und 18 Grad Celsius. Nach der Resuspendierung von Acini in Azinus-Kulturmedium verdünnen Sie die Suspension mit einem gleichen Volumen neutralisierter Rattenschwanzkollagen-Eins-Lösung, wobei Sie die Röhrchen auf Eis halten.Sorgfältig und schnell mischen und die Zellsuspension in 16 Vertiefungen auf das Kollagenkissen aussäen. Für eine optimale Aussaat von Pankreas-Acini ist es entscheidend, alle Röhrchen vor dem Plattieren im Eis zu halten und schnell vorzugehen, aber gleichzeitig ist vorsichtiges Pipettieren zur Vermeidung der Bildung von Luftblasen unerlässlich, um eine homogene Kollagenmatrix zu schaffen. Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, damit sich ein Hydrogel bilden kann.Um dann Pankreas-Organoide zu induzieren, überlagern Sie die Kollagen-Hydrogele mit 500 Mikrolitern Azinus-Kulturmedium, das mit Doxycyclin ergänzt ist. Um die Organoide zu subkultivieren, verwerfen Sie das Nährmedium, extrahieren Sie vorsichtig die Hydrogele und überführen Sie sie in konische Röhrchen mit vier Millilitern Kollagenase I Lösung B, dann inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius unter kräftigem Schütteln für 30 Minuten, bevor Sie die Zellen herunterschleudern und den Überstand entfernen. Nachdem Sie die Zellen trypsinisiert und den PBS-Überstand entfernt haben, verwenden Sie eine eiskalte Basalmembranmatrix, um das Zellpellet zu resuspendieren, und säen Sie die Suspension in extrem niedrigen Anhaftungsplatten aus.Lassen Sie das Hydrogel der Basalmembranmatrix erstarren, indem Sie die Platten 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und dann mit Pankreasorganoidmedium überlagern. yDucts wachsen in sieben bis 10 Tagen als zystenartige Organoide. Ein sorgfältiges Gating von primären LD-Epithelzellen der Brust in die drei hier gezeigten Subpopulationen ist unerlässlich, um ein reines Präparat von LD-Zellen zu isolieren, die vollständig differenziert und vollständig wachstumshemmend sind, wenn sie unter den Bedingungen der Bildung von Brustdrüsenkolonien ausgesät werden.Umgekehrt beginnen LD-Zellen, wenn sie dazu gebracht werden, exogenes YAP zu exprimieren, zu proliferieren und bilden leicht erkennbare dichte Epithelkolonien in 5%-Basalmembran-Matrix-Suspensionskulturen. Unter den Kulturbedingungen von Basalmembranmatrix-Organoiden organisieren sich reprogrammierte luminale Zellen selbst zu komplexen organoidartigen Strukturen, die sich um mehrere Lumen herum entwickeln und sich selbst erneuern, selbst wenn kein Doxycyclin vorhanden ist. Innerhalb der fünf bis sieben Tage der Kultivierung in 3D-Hydrogel auf Kollagen-I-Basis in Gegenwart von Doxycyclin verwandeln sich differenzierte Pankreas-Acini leicht in kanalartige Cluster oder yDucts, die aus einer dünnen Monoschicht von Epithelzellen bestehen, die sich um einen expandierenden zentralen Hohlraum proliferieren.Die Effizienz der Reprogrammierung kann leicht gemessen werden, indem die Anzahl der kanalartigen Cluster mit der Gesamtzahl der ausgesäten Acini verglichen wird. Reprogrammierte yDucts können dann auf Einzelzellebene in matrigelbasierte Organoid-Kulturbedingungen überführt werden, die auch ohne endogene YAP-Expression eine bemerkenswerte Selbsterneuerungsfähigkeit aufweisen. Wir haben zwei Verfahren detailliert beschrieben.Eine ermöglichte die Reprogrammierung von FACS-gereinigten Zellen durch lentivirale Vektoren und eine zweite, die eine Virusinfektion vermeidet und die Vorteile der transgenen YAP-Expression nutzt. Bei dem Versuch, Brustzellen zu reprogrammieren, ist es wichtig, die Verwendung von übermäßigen Virustitern zu vermeiden, da dies der Reprogrammierungseffizienz abträglich sein kann. Die vollständig transgene Strategie ist für primäre Pankreas-Acini geeignet, da diese für eine lentivirale Infektion kaum zugänglich sind.Es bietet auch den gleichen Vorteil wie Doxycyclin-abhängige lentivirale Vektoren für die Typenkontrolle der Genexpression. Zusätzlich zu den hier gezeigten Beispielen hat sich dieses YAP-Reprogrammierungsprotokoll als erfolgreich erwiesen, um differenzierte Neuronen in proliferierende Neuronen umzuwandeln. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine YAP-abhängige Reprogrammierung durchführen können, um differenzierte Zelltypen aus verschiedenen adulten Geweben in die entsprechenden gewebespezifischen Stammzellen umzuwandeln.Dieses Verfahren erweitert die derzeitigen Reprogrammierungsstrategien, indem es die Möglichkeit bietet, somatische Stammzellen zu erzeugen, die für die regenerative Medizin, für die Erforschung der somatischen Stammzellen und für die Expansion somatischer Stammzellen in vitro relevant sein könnten. Bitte beachten Sie, dass der Umgang mit lentiviralen Präparaten äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Maßnahmen der Sicherheitsstufe zwei ergriffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Ein Verfahren für die menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) über Retrovirus-vermittelte ektopische Expression von Oct4 generieren, wird Sox2, Klf4 und MYC beschrieben. Ein praktischer Weg, um menschliche iPSC Kolonien auf GFP-Expression zu identifizieren Basis wird ebenfalls diskutiert.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Diese Studie zeigt die Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo in Richtung Pluripotenz ohne die Erzeugung von Teratomen. Wir verwendeten eine hydrodynamische Schwanzveneninjektion von Plasmid-DNA, die für die Yamanka-Faktoren kodiert, um die in vivo Reprogrammierung von adulten Hepatozyten in Zellen mit erhöhter Pluripotenz zu induzieren.

im lebenden Organismus Reprogrammierung adulter somatischer Zellen zur Pluripotenz durch Überexpression von Yamanaka-Faktoren

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer von Spermien und Eizellen. Menschliche embryonale PGCs sind aus pluripotenten Epiblast Zellen durch Interaktionen von Zytokinen angegeben. Hier beschreiben wir eine 13-tägige Protokoll des Verursachens von menschlichen Zellen Transcriptomally ähnlich PGCs an der Oberfläche des Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen.

Generation von menschlichen Ur Keimzelle-wie Zellen an der Oberfläche der Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen

Dieses Protokoll wurde als Mittel zur Herstellung von Gehirnorganoiden in einer vereinfachten, kostengünstigen Weise ohne exogene Wachstumsfaktoren oder Kellermembranmatrix unter Beibehaltung der Vielfalt der Gehirnzelltypen und vieler Merkmale der zellulären Organisation erzeugt.

Eine statische selbstgesteuerte Methode zur Generierung von Hirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Wir stellen hier eine Methode vor, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren effizient zu erzeugen, ohne dass Gentransfektion oder retrovirale Vektoren erforderlich sind. Diese Strategie ist daher vielversprechend für die translationale Medizin und stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzellorganoidtechnologie dar.

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von iTenozyten durch die Erzeugung von iPSC-abgeleiteten mesenchymalen Stromazellen mit kombinierter Überexpression von Sklerose unter Verwendung eines lentiviralen Vektors und uniaxialer Streckung über einen 2D-Bioreaktor.

Generierung von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten iTenozyten durch kombinierte Sklera-Überexpression und uniaxiale 2D-Spannung

Erfahren Sie die Reprogrammierung differenzierter Zellen zu Stammzellen mittels YAP-Expression. Diese Methode nutzt lentivirale Vektoren und transgene Systeme für regenerative Medizin und Krebsforschung.

De Novo Generation von somatischen Stammzellen von YAP/TAZ

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