Name: Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie NLRP3-Inflammasom-Aktivierung und pyroptotischen Zelltod in murinen Knochenmark-Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie und LDH-Freisetzungsassay nachweisen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einzelner Schritte der Inflammasom-Aktivierung.

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Alle Mikroskopie erfolgte in der W. M. Keck Mikroskopie Mitte mit Unterstützung von Nathaniel Peters und mit Unterstützung des NIH Award S10OD016240. S.L.F. wird von NIH K08AI119142 und R21AI130281 unterstützt. Wir danken Dr. Richard Flavell und Dr. Brad Cookson Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse und Dr. Brad Cookson für den Austausch von Laboreinrichtungen und Geräte.

Alle tierische Verfahren geprüft und bei der Universität von Washington institutionelle Animal Care und Use Committee Richtlinien durchgeführt.
(1) die Ernte des Knochenmarks
<ol><li>Aseptisch Femur und Tibia aus einer Maus herausnehmen und Reinigen der Knochen mit sterilen Instrumenten. Legen Sie die gereinigten Knochen in Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 50 mg/mL Gentamicin Sulfat + 10.000 U/mL Penicillin/Streptomycin + 10 % fetalen bovine Serum (FBS, DMEM-10 komplette) und inkubieren Sie die Rohr für 15 min auf Eis.</li>
	<li>Entfernen Sie die proximalen und distalen Kugelgelenke mit einer Schere. Nadel 25 G an eine 10 mL Spritze gefüllt mit Medium in den Hohlraum der Knochen befestigt. Spülen Sie das Knochenmark mit DMEM-10 abgeschlossen. Aufzuwirbeln Sie jeder Klumpen durch das Medium sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Die Zellen für 10 min bei 300 X g zentrifugieren und die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer. An dieser Stelle entweder Einfrieren der Zellen mit 90 % FBS + 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Platte Zellen in einem 15 cm Petrischale Makrophagen mit L929 konditioniert Medium (Schritt 2.1) zu unterscheiden.</li>
</ol>(2) Differenzierung von Makrophagen Knochenmark abgeleitet
<ol><li>Verwenden vorgewärmte Differenzierung Medium (21 mL DMEM-10 abgeschlossen und L929 Zellen bedingt Medium wie von Swanson Et Al. beschrieben 9 mL ( 18), habe Knochenmarkzellen in einem 15 cm nicht Gewebekultur Petrischale (1,2-1,5 x 107 Zellen) behandelt. 7 Tage inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 . Fügen Sie eine zusätzliche 30 mL Differenzierung Medium auf den Teller am Tag 3 oder 4. Hinweis: Es ist wichtig nicht zu Gewebekultur behandelt Platten verwenden wie Makrophagen schwierig werden zu lösen und zu ernten.</li>
	<li>Makrophagen zu sammeln, waschen Sie die Platte mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 20 mL kaltem PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Brüten Sie der Platte bei 4 ° C für 10 min. Ernte der Zellen durch pipettieren der PBS + EDTA über die Zellen und waschen Sie die Platte mit 10 mL PBS. Kombinieren Sie beide Waschgänge in zwei 15 mL konische Röhrchen.</li>
	<li>Die Zellen bei 300 X g für 10 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL von Phenol-rot frei DMEM + 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL L-Glutamin + 0,05 mM 2-Mercaptoethanol + 5 % FBS (DMEM-5) und die Zellen, die entweder ein Hemocytometer oder ein Coulter Counter zählen. Halten Sie die Zellen auf dem Eis während der Auszählung.</li>
	<li>Samen der Makrophagen in Gewebekultur beschichtete Platten 2 x 105 Zellen/ml. Samen Sie für Mikroskopie-Experimente 1 mL der Zellen auf Deckgläsern in 24-well-Platten. Samen Sie für LDH Release Assays 100 µL der Zellen in einer 96-well-Platte. Samen Sie für die LDH-Assay 9 Brunnen (3 Brunnen unbehandelt, 3 Brunnen mit 100 % Lyse Kontrollen und 3 Brunnen für den experimentellen Stimulus).</li>
	<li>Zentrifugieren der 96-well-Platte für 5 min bei 300 X g, stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig über die gut verteilt sind.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 ° C + 5 % CO2 vor der Grundierung beginnen.</li>
</ol>3. grundieren
<ol><li>Ersetzen Sie das Medium mit frischem Medium (DMEM-5) mit 100 ng/mL LPS (500 μL für die 24 gut Platte oder 50 μL für die 96 gut Platte). Hinweis: Es gibt eine Vielzahl von strukturellen Variationen in LPS, die Einfluss auf die Fähigkeit, TLR4-vermittelten Priming19zu stimulieren. LPS von Salmonella Minnesota R595 (Re) ist von mehreren Herstellern erhältlich und wird empfohlen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 3 h bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
</ol>(4) Aktivierung des NLRP3-Inflammasome mit Nigericin und Etikettierung mit FAM-YVAD-FMK
<ol><li>Entfernen Sie das Medium zu und ersetzen Sie es mit 290 μL DMEM-5, 5 μM Nigericin und 5 mM Glycin enthält. Glycin wird hinzugefügt, um die Reduzierung der Lyse der Zelle bei der Aktivierung von Caspase-15. 60 min bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren. Verwenden Sie Wildtyp und Caspase-1 mangelhafte Makrophagen, um sicherzustellen, dass die beobachteten Beschriftung spezifisch für Caspase-1 ist.</li>
	<li>Während die letzten 45 min hinzufügen 10 μL 30 x FAM-YVAD-FMK, zubereitet nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 60 min das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL kaltem PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μL von 2 % Paraformaldehyd in jede Vertiefung und auf Eis bedeckt mit Alu-Folie für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie während der letzten 5 min 4 μl 0,2 mM dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck um die Kerne zu beschriften. 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder andere Farbstoffe können auch Label DNA verwendet werden.</li>
	<li>Die Zellen dreimal mit 1 mL kaltem PBS waschen und Deckgläsern auf Objektträger mit 7 μl Anti-Fade Eindeckmittel zu montieren. Lassen Sie die Montage Medium über Nacht vor dem Versiegeln das Deckglas auf den Objektträger mit Nagellack Härten.</li>
	<li>Bild der Makrophagen durch konfokale Mikroskopie. Ex / Em für FAM-YVAD-FMK ist 492/520nm und 642/661 für dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure-Fleck. Achten Sie darauf, das Mikroskop einrichten, so dass unbehandelte Zellen nicht jeden beliebigen Hintergrund Färbung in den 488 Kanal angezeigt werden. Andernfalls wird die Hintergrundfärbung FAM-YVAD-FMK erkannt und nicht die tatsächliche aktive Caspase-1 sein. Hinweis: Mikroskop-Set-up ist in Abschnitt 6 beschrieben.</li>
</ol>5. Antikörper Färbung
Hinweis: Um die Zellen mit Antikörpern gegen ASC erkennen zu beschriften, Saatgut, prime und setzen Sie die Zellen, die Nigericin identisch mit dem vorherigen Abschnitt. Die Verarbeitung ist danach wie folgt:
<ol><li>Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL kaltem PBS. Fügen Sie 250 μL der Fixierung und Permeabilisierung Lösung. Brüten die Zellen auf Eis, und für 30 min abgedeckt.</li>
	<li>Waschen Sie die Makrophagen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL der Waschpuffer.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μl Primärantikörper gegen ASC 1: 500 in Waschpuffer verdünnt und 1 h auf dem Eis inkubieren. Gehören Sie ein deckgläschen, der erhält keiner primären Antikörper, sondern erhält nur die sekundäre. Das Deckglas wird während des Setups Mikroskop verwendet werden, um den richtigen Abstand vom Koordinatenursprung.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min. mit 1 mL Waschpuffer.</li>
	<li>Fügen Sie 250 μL der Sekundärantikörper (Fluoreszenzfarbstoff konjugierten Ziege-Anti-Maus) 1: 500 in Waschpuffer verdünnt und 1 h auf dem Eis inkubieren. Label-Kerne 4 μl 0,2 mM dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck für die letzten 5 min diese Inkubation hinzufügen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3 X mit 1 mL kalte Waschpuffer und Mount Deckgläsern auf Mikroskop Folien mit 7 μl Anti-Fade Eindeckmedium. Lassen Sie die Montage Medium über Nacht vor dem Versiegeln das Deckglas auf den Objektträger mit klaren Nagellack Härten.</li>
	<li>Bild Makrophagen konfokalen Mikroskopie. Ex / Em für den sekundären Antikörper ist 555/580 nm und 642/661 für dunkelrote fluoreszierende Nukleinsäure Fleck (wie unten beschrieben). Hinweis: Mit FAM-YVAD-FMK und Antikörper Beschriftung Beschriftung kann kombiniert werden um Co Lokalisierung von aktive Caspase-1 und ASC zeigen. Hierzu folgen Sie die Bedingungen für die FAM-YVAD-FMK Kennzeichnung und wechseln Sie dann in der Antikörper labeling Protokoll zur weiteren Verarbeitung.</li>
</ol>6. Bildgebung von beschrifteten Makrophagen durch konfokale Mikroskopie
Hinweis: Die gefärbten Zellen können nach der Deckgläsern erlaubt haben, über Nacht zu heilen und wurde auf dem Objektträger mit Nagellack versiegelt angesehen werden. Hier ist die Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop beschrieben. Zellen können auch durch standard Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.
<ol><li>Legen Sie die Folie mit den unbehandelten Zellen auf den Mikroskoptisch und konzentrieren Sie das Mikroskop auf die Zellen zu.</li>
	<li>Das Mikroskop Look Up Table (LUT) einstellen Einstellungen, Versatz, so dass es keine positiven FAM-YVAD-FMK Färbung in den unbehandelten Zellen. Dieser Vorgang kann auch mit mangelhaft Makrophagen Caspase-1 durchgeführt werden. Hinweis: Der Offset hat für jeden Kanal in das Experiment verwendet angepasst werden, aber einstellen den korrekten Offset ist kritischste für die FAM-YVAD-FMK Kanal und fluoreszierende Antikörper Kanäle. Der Offset für die DNA-Kanal ist weniger kritisch. Sobald der Offset festgelegt wurde, stellen Sie diese Einstellung für den Rest des Experiments nicht.</li>
	<li>Wechseln Sie die Folie zum Beispiel Nigericin behandelt. Finden Sie ein Feld, beide Zellen, die positiv und negativ enthält für die FAM-YVAD-FMK Färbung sind. Passen Sie die Abbildungsebene des FAM-YVAD-FMK Kanals auf das Flugzeug, das die höchste Intensität der positive Färbung hat. Normalerweise werden dies im Flugzeug, wo das Zentrum des Inflammasome Fokus abgebildet ist.</li>
	<li>Passen Sie die Verstärkung so dass Brennpunkte in den Zellen sichtbar sind, die verdichteten Kerne haben. Lassen Sie nach der Einstellung von Gain und Offset diese Einstellungen für den Rest der bildgebenden Sitzung. Hinweis: Eine einfache Möglichkeit, festzustellen, ob eine Zelle Pyroptotic ist durch das nukleare Morphologie betrachten. Zellen mit aktiven Caspase-1 haben abgerundete und verdichteten Kerne, während nukleolen in Zellen ohne Aktivierung der Caspase-1 und die nukleare Morphologie sichtbar sind ist ähnlich denen von unbehandelten Zellen.</li>
	<li>Sammeln Sie Bilder von 5 zufällig ausgewählten Felder bei 100 X Gesamtvergrößerung. Dies führt normalerweise ca. 40 Zellen pro Bild. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe.</li>
	<li>Die Anzahl der Zellen in jedem Bild mit Bildanalyse-Software. Dann die Anzahl der Zellen, die positive FAM-YVAD-FMK Färbung haben. Vertreten Sie die Aktivierung der Caspase-1 als der Anteil der FAM-YVAD-FMK positive Zellen.</li>
</ol>(7) LDH-Release-Assay
Hinweis: Für die LDH-Release-Assay verwenden Saatgut und Prime, was die Zellen wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, außer einer 96-well-Platte. Entfernen Sie das Medium nicht nach dem grundieren.
<ol><li>Fügen Sie 50 μL DMEM-5 mit 10 μM Nigericin in die experimentelle Vertiefungen und 50 μL DMEM-5, die spontanen und 100 % Lyse-Kontroll-Vertiefungen. Fügen Sie keine Glycin in diesem Experiment, da die Zelle Lysis messen soll. 60 min bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Nach 30 min 10 μl 10 X Lyse Puffer zu 100 % Lyse Kontroll-Vertiefungen und fügen Sie 10 μL DMEM-5 hinzu, die weiteren Bohrungen. Während diese Inkubation 1 Durchstechflasche Substrat-Mix (1,5 mL gefriergetrocknete Substrat) und 1 aliquoten testpuffer (~ 12 mL) aus der Tiefkühltruhe zu entfernen und lichtgeschützt auf Zimmertemperatur auftauen lassen. Hinweis: Die Substrat-Mischung enthält eine Tetrazolium Salz (Iodonitro-tetrazoliumsalz violett), die zu einem roten Formazan Produkt umgewandelt wird.</li>
	<li>Nach insgesamt 60 min Inkubation Zentrifugieren der Platte für 5 min bei 500 X g bei 10 ° C. Übertragen Sie 50 μl des Überstands auf eine klare flach-Boden-Platte. Während dieser Zeit das Fläschchen des Substrat-Mix 12 mL testpuffer hinzu und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min vor der Verwendung.</li>
	<li>Fügen Sie 50 μL des Substrats in jede Vertiefung und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Enthalten Sie mittlere nur Brunnen für leere Werte. Überprüfen Sie die Platte nach 15 min um sicherzustellen, dass das Signal die Nachweisgrenze des Lesers Platte nicht überschreiten wird.</li>
	<li>Fügen Sie nach 30 min 50 μL Stopp-Lösung (1 M Essigsäure hinzu) und Messen Sie OD490 mit einem Teller-Reader.</li>
	<li>Berechnen Sie den Anteil der Lyse der Zelle mit Hilfe der folgenden Formel: % Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (maximale-spontane)) × 100 Experimentelle: Nigericin behandelt Zellen; spontane: unbehandelten Zellen; maximal: Zellen, Lyse-Puffer</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen

In dieser Handschrift haben wir zwei Techniken untersuchen Inflammasome Aktivierung und die Folge der Aktivierung der Caspase-1 nach NLRP3 Stimulation in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet vorgestellt. Die erste Technik ermöglicht den Forscher, die Aktivierung der Caspase-1 auf einer zellulären Basis mit fluoreszierenden Reporter FAM-YVAD-FMK bestimmen. Dieser Reporter ist hochspezifisch für die Bindung der Caspase-1-Familie von Enzymen, wie durch das Fehlen der Färbung in Caspase-1/11 mangelhaft Makrophagen gese...

Inflammasome-vermittelte Entzündung zugrunde liegt auch die Ursache von vielen Krankheiten2ist ein wesentlicher Bestandteil der Abwehr pathogener Organismen1 Die entzündliche Reaktion auf eine Vielzahl von Infektionen ausgelöst durch cytosolische Nachweis des Erregers verbunden molekulare Muster (PAMPs) oder Schäden verbunden molekulare Muster (DAMPs). Muster-Anerkennung-Rezeptoren (PRR), einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder oligomerize auf den Nachweis dieser PAMPs und DAMPs. Dies löst die Bildung eines Multi-Protein-Komplex bezeichnet die Inflammasome, die die PRR, Adapter Protein Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein mit einer C-terminalen Caspase Recruitment Domain (Karte) (ASC) und pro-Form enthält Caspase-13,4. Diese Anlage ermöglicht Nähe-induzierte Auto-Aktivierung von Caspase-1. Aktive Caspase-1 führt dann zu einer Reihe von Ereignissen, die charakteristisch für die entzündliche Zelle Tod Weg Pyroptosis. Zu diesen Ereignissen gehören: die Spaltung und die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-18, Lysosomen Exozytose mit Freisetzung von lysosomalen Inhalts in den Extrazellulärraum, nukleare Kondensation und Gasdermin D Dekolleté. Die freigesetzte N-terminale Domäne des Gasdermin D fügt in der Plasmamembran, Bildung von Poren, die dazu führen, dass die Plasmamembran Bruch und Freisetzung von entzündlichen Inhalt, zusätzlich eine schützende Nische für Erreger Replikation5, wegnehmen 6 , 7.
Hier konzentrieren wir uns auf den gut untersuchten NLRP3-Inflammasome. Die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome erfolgt durch einen zweistufigen Prozess8. Der erste "Priming" Schritt erfolgt durch die Anerkennung von Toll-Like-Rezeptoren (TLR) eines mikrobiellen Produkts. Dies wird in der Laborumgebung repliziert, mithilfe von LPS, um TLR4 zu stimulieren. Diese Stimulation reguliert NLRP3 und Pro-IL-1β durch NF-κB-Signalisierung. Grundierung zusätzlich Lizenzen NLRP3 durch nicht-transcriptional Mechanismen durch Induktion der Deubiquitination9,10 und Phosphorylierung oder Dephosphorylation bestimmte Rückstände11,12.
Das zweite Signal für NLRP3 Aktivierung wird gedacht, um mitochondrialen Faktoren, reaktive Sauerstoffspezies, Kalium Ausfluss und Kalzium-Signalisierung, beinhalten ein einheitlicher Mechanismus für NLRP3 Aktivierung schwer fassbaren8bleibt. Aktivierte NLRP3 durch Interaktionen zwischen seinen NACHT-Domains oligomerizes und ASC über Bindung von Pyrin (PYD) Domänen13Rekruten. In jeder Zelle bilden diese makromolekulare Komplexe einen einzigen mikroskopisch sichtbaren Fokus. ASC wurde ursprünglich als ein 22 KDa-Protein, das einen "Fleck" während der Apoptose von menschlichen Leukämie-Zellen bildet und benannte Apoptose-assoziierten Speck-Like Protein enthält eine Karte14identifiziert. Es wurde später festgestellt, dass ASC Pro-Caspase-1 durch das Zusammenspiel der Karte des ASC mit der Karte von Pro-Caspase-1, bilden die Inflammasome15Rekruten.
Nicht alle NLRs erfordern das Vorhandensein der ASC induzieren Caspase-1 Aktivierung. Im Gegensatz zu NLRP3 NLRC4 und NLRP1b Karte Domänen und Pro-Caspase-1 über Karte Interaktionen induzieren Caspase-1 Aktivierung direkt einstellen können. In Ermangelung von ASC aktive Caspase-1 bleibt diffus in die Zellflüssigkeit und bildet keinen einzigen Fokus. Diese diffuse aktive Caspase-1 ist ausreichend, um Pyroptotic Zelltod induzieren, aber ist nicht in der Lage, Pro-IL-1β13,16zu verarbeiten.
In diesem Manuskript besprechen wir zwei Möglichkeiten zur Aktivierung der Inflammasome zu beurteilen. Die erste verwendet die fluoreszierende Aktivität Sonde, FAM-YVAD-FMK, die die Caspase-1-Familie von Proteasen bindet. Diese Familie umfasst Caspase-1, aber auch Maus Caspase-11 und menschlichen Caspase-4 und Caspase-5. Makrophagen von Caspase-1/11 mangelhaft Mäuse in allen Experimenten verwenden, wird die Spezifität dieser Sonde angesprochen werden. Diese Methode kann kombiniert werden mit Antikörper Kennzeichnung von Inflammasome Komponenten, die wir auch beschreiben. Mikroskopische Visualisierung ermöglicht die Identifizierung von einzelnen Zellen, die aktive Caspase-1 und oligomerized ASC. Forscher werden mit dieser Methode feststellen, wo in der Inflammasome-Bildung-Kaskade ihren Manipulationen der Wirtszelle oder pathogener Organismus unter Studie auswirken. Zum Beispiel kann man unterscheiden, ob eine bestimmte Intervention verhindert, die Rekrutierung von ASC, komplexe NLRP3 dass oder richtet sich an die nachfolgenden Rekrutierung und Aktivierung von Caspase-117. Ergebnisse der Caspase-1 Aktivierung wie IL-1β-Sekretion zu prüfen wäre nicht in der Lage sein, zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden. Auch, könnte die Sekretion von IL-1β geändert werden, ohne dass die Fähigkeit der Zellen zur Aktivierung der Caspase-1 und Pyroptotic Zelle Tod16zu unterziehen.
Die zweite Methode misst die Freisetzung von Laktat-Dehydrogenase (LDH) in die Zelle überstand, die auftritt, während Pyroptotic Makrophagen Lyse nach Aktivierung der Caspase-1, wie oben beschrieben. Diese zweite Methode ist eine bevölkerungsbezogene Ansatz wie die Freisetzung von LDH im gesamten gut gemessen wird. Dieser einfache Ansatz ermöglicht die schnelle Analyse von Proben (30 min Inkubation Zeit) um festzustellen, ob es Caspase-1-vermittelte Zelltod gibt und kann in einem 96-Well-Plattenformat durchgeführt werden.
Diese Methoden sind komplementär, jeweils mit verschiedenen Vorteilen, und beide sind Modifikationen leicht zugänglich. Beispielsweise kann Makrophagen Behandlung mit gezielten kleinen Molekulargewicht Verbindungen vor Inflammasome Stimulation verwendet werden, untersuchen die Rolle sicher, dass Proteine auf Entzündungsreaktionen Steuern haben können.

<table><tbody><tr><td>E-MEM</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td>Für die Züchtung von L929-Zellen</td></tr><tr><td>NCRC-Klon 929 (L929)</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Fixierungs-/Permeabilisierungskit</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Enthält Fixierungs- und Permeabilisierungslösung sowie Waschpuffer. Proprietäre Formulierungen. Enthält 4,2 % Formaldehyd</td></tr>, <tr><td>Glycin,</td><td>Biorad</td><td>161-0718</td><td></td></tr>, <tr><td>Cytotox96, nicht-radioaktiver Zytotoxizitätsassay</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-G1780</td><td>Enthält eine Substratmischung und einen Assay-Puffer; Proprietäre Formulierungen. Stopplösung ist 1 M Essigsäure</td></tr><tr><td>FAM-YVAD-FMK</td><td>Immunocytochemistry Technologies</td><td>98</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hohe Glukose, kein Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hohe Glukose, kein Glutamin, kein Phenolrot</td><td>Invitrogen</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS, kein Kalzium, kein Magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum, qualifiziert,</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td> aus den USA Hitze <td>inaktiviert bei 55°; C für 50 min</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Eindeckmedium</td><td>Invitrogen</td><td>p36934</td><td>Proprietäre Formulierung. Aushärtendes Einbettmedium. Härtet gegen den Refraktärindex von 1,46</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-ALEXA555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodid</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>dunkelrot fluoreszierend Nukleinsäure-Färbung</td></tr><tr><td>C57BL/6J Maus</td><td>Jackson Laboratoy</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-1/11-/- Maus</td><td>Jackson Laboratory</td><td>016621</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8X Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LPS aus Salmonella minnesota R595 (Re)</td><td>List Biologicals</td><td>434</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ASC Klon 2EI-7</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-417</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Mercapto-Ethanol</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E5391</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax M3 Plattenleser</td><td>Molecular Devices</td><td>5000414</td><td></td></tr></tbody></table>

erkennung von inflammasome aktivierung und pyroptotic zelltod in murinen makrophagen knochenmark abgeleitet

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes sind angeborene immun Signalisierung Plattformen, die für die erfolgreiche Bekämpfung vieler pathogenen Organismen sind erforderlich, sondern auch fördern entzündliche und Autoimmun-Krankheiten. Inflammasomes werden durch cytosolische Muster Anerkennung Rezeptoren, einschließlich derjenigen der NOD-Like-Rezeptor (NLR) Familienmitglieder aktiviert. Diese Rezeptoren oligomerize auf den Nachweis der mikrobiellen oder Schäden verbundenen Reize. Nachträgliche Einstellung des Adapter-Proteins ASC bildet eine mikroskopisch sichtbaren Inflammasome Komplex, die Caspase-1 durch Nähe-induzierte Auto-Aktivierung aktiviert. Nach der Aktivierung spaltet Caspase-1 Pro-IL-1β und Pro-IL-18, zur Aktivierung und Sekretion dieser Pro-inflammatorische Zytokine. Caspase-1 vermittelt auch entzündliche Form des Zelltods bezeichnet Pyroptosis, verfügt über den Verlust der Membran Integrität und Zell-Lyse. Caspase-1 spaltet Gasdermin D, die N-terminale Fragment, das Plasmamembran Poren bildet die Freigabe zu osmotische Lyse.
In Vitro, die Aktivierung von Caspase-1 kann durch Knochenmark stammenden Makrophagen mit der Caspase-1 Aktivität Sonde FAM-YVAD-FMK Kennzeichnung und Etikettierung der Zellen mit Antikörpern gegen das Adapter-Protein ASC ermittelt werden. Diese Technik ermöglicht die Identifikation von Inflammasome Bildung und Aktivierung der Caspase-1 in einzelnen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Pyroptotic Zelltod kann durch Messung der Veröffentlichung der cytosolischen Laktat-Dehydrogenase in das Medium erkannt werden. Dieses Verfahren ist einfach, kostengünstig und in einer 96-Well-Platte-Format, so dass die Anpassung für das Screening durchgeführt. In dieser Handschrift zeigen wir, dass die Aktivierung des NLRP3-Inflammasome von Nigericin bis zur Co Lokalisierung der Adapter Protein ASC und aktive Caspase-1, führt zu Pyroptosis.

Um Caspase-1 Aktivierung nach der Exposition gegenüber Nigericin zu erkennen, wurden die Zellen verarbeitet, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. Wir kombinierten FAM-YVAD-FMK und ASC Etikettieren Antikörper um zu zeigen, dass ASC und aktive Caspase-1 Co lokalisieren nach Aktivierung des NLRP3-vermittelten Inflammasome. Abbildung 1A zeigt, dass Wildtyp Makrophagen ausgesetzt 5 μM Nigericin Bildung von einer ASC-Fokus in der perinukleären Region. Diese Schw...

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Die übergeordneten Ziele dieses Protokolls sind die Untersuchung der Inflammasom-Aktivierung auf Einzelzellebene mittels Fluoreszenzmikroskopie und die Messung der Lyse während der Pyroptose mit einem Laktatdehydrogenase oder LDH-Freisetzungsassay. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Inflammasoms zu beantworten, z. B. wie die Aktivierung von Caspase-1 reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie es dem Benutzer ermöglichen, mehrere Schritte des Inflammasom-Aktivierungs- und Pyroptose-Signalwegs zu untersuchen.Das Verfahren wird Andreas den Hartigh, ein Forscher aus meinem Labor, vorführen. Beginnen Sie damit, das Medium aus LPS-geprimten Makrophagen aus dem Knochenmark zu ersetzen, die auf Glasdeckgläsern ausgesät wurden, durch 290 Mikroliter DMEM 5-Medium, ergänzt mit fünf mikromolaren Nigericin und fünf millimolaren Glycin, pro Well. Stellen Sie die 24-Well-Platte für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Zellkultur-Inkubator zurück und fügen Sie nach den ersten 15 Minuten 10 Mikroliter 30X FAM-YVAD-FMK hinzu.Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter kaltem PBS pro Vertiefung, dreimal

detection-inflammasome-activation-pyroptotic-cell-death-murine-bone

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine Methode zum Nachweis der NLRP3-Inflammasomaktivierung in Makrophagen mit Hilfe von fluoreszierenden Reportersonden. Die Zellen werden mit Kaliumionophoren und Glycin behandelt, um die Inflammasom-Assemblierung und die Caspase-1-Aktivierung zu induzieren. Fluoreszierende Reportersonden visualisieren aktivierte Caspase-1, und Zellen werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, um die Zellkerne sichtbar zu machen.

Nachweis der Inflammasomaktivierung mittels Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Untersuchung der Bildung von Inflammasomen der NOD-ähnlichen Rezeptorfamilie Pyrin Domain-containing 3 (NLRP3) in primären Makrophagen mittels Immunfluoreszenz. Die Makrophagen werden zunächst mit bakteriellen Lipopolysacchariden (LPS) geprimt, um die NLRP3-Proteinexpression hochzuregulieren. Die Exposition der Makrophagen gegenüber Nigericin – einem Kaliumionophor – führt zur Aktivierung von NLRP3 und zur Bildung von Inflammasomen, die mittels...

Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung der Bildung von Inflammasom-Komplexen in Makrophagen

Dieses Video zeigt den Laktat-Dehydrogenase-Assay zum Nachweis des Inflammasom-vermittelten Makrophagen-Todes. Die Makrophagen werden zum Priming Lipopolysaccharid ausgesetzt, gefolgt von einer Exposition gegenüber Nigericin, um einen Inflammasom-induzierten Zelltod zu verursachen, der durch den Laktatdehydrogenase-Assay bestimmt wird.

Ein Laktat-Dehydrogenase-Freisetzungsassay zum Nachweis des Todes von Makrophagen nach Nigericin-Exposition

Dieses Video zeigt die Bewertung mehrerer Caspase-Aktivierungen in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen durch Stimulation mit dem Influenzavirus. Nach der Makrophagenlyse, der Hitzeinaktivierung von Lysat und der Zentrifugation werden intrazelluläre Caspasen für die anschließende immunologische Analyse gesammelt.

Bewertung der Aktivierung multipler Caspasen in Makrophagen

Der Artikel beschreibt eine leicht einfach...

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

Dendritische Zellen (DCs) sezernieren IL-1β in Reaktion auf TLR8 Anerkennung von synthetischen Purin, R848, gefolgt von NLRP3 Inflammasom Aktivierung mit Nigericin daher, IL-1β kann verwendet werden, um NLRP3 Inflammasom Aktivität zu messen. Die intrazelluläre Zytokin-Färbung, Immunoblotting und ELISA werden verwendet, um NLRP3 Inflammasom Grundieren und Aktivierung über IL-1β Ausdruck genau zu messen.

Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Dieses Protokoll stellt ein effizientes und zuverlässiges Verfahren zum humanen THP-1 Makrophagen mit siRNA oder Plasmid-DNA durch Elektroporation mit hohen Transfektionseffizienz transfizieren während eine hohe Vitalität der Zellen und Makrophagen volle Kapazität für die Differenzierung und Polarisation.

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Dieses Protokoll bietet Forschern eine schnelle, indirekte Methode zur Messung der TLR-abhängigen NF--B/AP-1-Transkriptionsfaktoraktivität in einer murinen Makrophagenzelllinie als Reaktion auf eine Vielzahl von polymeren Oberflächen und adsorbten Proteinschichten, die die Mikroumgebung des Biomaterials Implantate modellieren.

Ein Makrophagen-Reporter-Zell-Assay zur Untersuchung der toll-like Receptor-vermittelten NF-kB/AP-1-Signalisierung auf adsorbierten Proteinschichten auf polymeren Oberflächen

Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) aus menschlichen Blutproben, eine einfache Methode zur effizienten Einführung von BiFC-Reportern (Bimolecular Fluorescence Complementation) in das menschliche MDM, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen, und einen bildgebenden Ansatz zur Messung der entzündlichen Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode zur Beurteilung der Caspase-Aktivierung (Caspase-1, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-11) als Reaktion auf In-vitro - und In-vivo-Modelle (in Mäusen) von Infektionen, sterilen Beleidigungen und Krebs, um die Initiierung von Zelltodwegen wie Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose zu bestimmen.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Dieses Protokoll basiert auf LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen. Wir verwenden die Durchflusszytometrie zur Analyse von Annexin V und 7-AAD-Doppelfärbung, um den Zelltod zu erkennen, wobei wir die gesamte Zelle verwenden und Rasterelektronenmikroskopie einsetzen, um die Zellmembranmorphologie zu beobachten.

LPS und ATP-induzierter Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und deren Validierung

Erfahren Sie, wie Sie NLRP3-Inflammasom-Aktivierung und pyroptotischen Zelltod in murinen Knochenmark-Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie und LDH-Freisetzungsassay nachweisen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einzelner Schritte der Inflammasom-Aktivierung.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

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