Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Die übergeordneten Ziele dieses Protokolls sind die Untersuchung der Inflammasom-Aktivierung auf Einzelzellebene mittels Fluoreszenzmikroskopie und die Messung der Lyse während der Pyroptose mit einem Laktatdehydrogenase oder LDH-Freisetzungsassay. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Inflammasoms zu beantworten, z. B. wie die Aktivierung von Caspase-1 reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie es dem Benutzer ermöglichen, mehrere Schritte des Inflammasom-Aktivierungs- und Pyroptose-Signalwegs zu untersuchen.

Verfahren wird Andreas den Hartigh, ein Forscher aus meinem Labor, vorführen. Beginnen Sie damit, das Medium aus LPS-geprimten Makrophagen aus dem Knochenmark zu ersetzen, die auf Glasdeckgläsern ausgesät wurden, durch 290 Mikroliter DMEM 5-Medium, ergänzt mit fünf mikromolaren Nigericin und fünf millimolaren Glycin, pro Well. Stellen Sie die 24-Well-Platte für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Zellkultur-Inkubator zurück und fügen Sie nach den ersten 15 Minuten 10 Mikroliter 30X FAM-YVAD-FMK hinzu.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter kaltem PBS pro Vertiefung, dreimal für fünf Minuten pro Waschgang und fixieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern 2%-Paraformaldehyd pro Vertiefung für 30 Minuten auf lichtgeschütztem Eis, wobei Sie die Zellen in den letzten fünf Minuten mit einem geeigneten Fluoreszenzkernfarbstoff markieren. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit kaltem PBS, wie gerade gezeigt, und beladen Sie jeden Objektträger mit sieben Mikrolitern Anti-Fade-Einbettmedium. Legen Sie auf jeden Objektträger ein Deckglas und lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht aushärten, bevor Sie die Deckgläser mit Nagellack versiegeln.

Um die Zellen durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie abzubilden, legen Sie den unbehandelten Objektträger auf den Mikroskoptisch und fokussieren Sie manuell auf die Zellen. Passen Sie mit den Einstellungen der Mikroskop-Nachschlagetabelle den Versatz an, bis in den unbehandelten Zellen keine positive Sondenfärbung mehr beobachtet wird. Als nächstes lokalisieren Sie unter Verwendung einer mit Nigericin behandelten Probe ein Feld, das Zellen enthält, die sowohl positiv als auch negativ für die Sondenfärbung sind, und stellen Sie die Bildgebungsebene des Sondenkanals auf die Ebene ein, die die höchste Intensität der positiven Färbung aufweist.

Passen Sie dann die Verstärkung an, bis die Brennpunkte in den Zellen mit kondensierten Kernen sichtbar sind, und erhalten Sie Bilder von fünf zufällig ausgewählten Feldern pro Objektträger bei einer 100-fachen Gesamtvergrößerung. Für die immunfluorchemische Analyse der mit Nigericin behandelten Zellen waschen Sie die Prop-markierten Zellen wie gerade gezeigt und inkubieren Sie die Zellen in 250 Mikrolitern Fixierungs- und Permeabilisierungslösung pro Vertiefung für 30 Minuten auf Eis, geschützt vor Licht. Waschen Sie die Makrophagen noch dreimal mit frischem Waschpuffer und markieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern Primärantikörper gegen ein Ptosis-assoziiertes speckartiges Protein, das eine C-terminale Caspase-Rekrutierungsdomäne (ASC) pro Vertiefung enthält, für eine Stunde auf Eis.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation und markieren Sie die Proben mit 250 Mikrolitern des entsprechenden Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörpers für eine weitere Stunde auf Eis, wobei Sie in den letzten fünf Minuten vier Mikroliter eines geeigneten Fluoreszenz-Kernfärbefarbstoffs hinzufügen. Nachdem Sie die Zellen dreimal in Kaltwaschpuffer gewaschen haben, montieren Sie Deckgläser mit sieben Mikrolitern Anti-Fade-Eindeckmedium auf die Objektträger, wie gezeigt, und bilden Sie die Makrophagen durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie ab. Um einen LDH-Freisetzungsassay durchzuführen, geben Sie 50 Mikroliter DMEM 5-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren Nigericin, in jede Versuchsvertiefung und 50 Mikroliter DMEM 5 in die spontane und 100%ige Lysekontrollvertiefung für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Geben Sie nach 30 Minuten 10 Mikroliter 10X Lysepuffer in die 100%-Lysekontrollvertiefungen und geben Sie 10 Mikroliter Medium in die anderen Vertiefungen. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Platte und überführen Sie 50 Mikroliter Überstand aus jeder Vertiefung auf eine durchsichtige Platte mit flachem Boden. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter frisch aufgetautes und vorbereitetes Substrat für eine 30-minütige Inkubation im Dunkeln in jede Vertiefung und überprüfen Sie die Platte nach 15 Minuten, um sicherzustellen, dass das Signal die Nachweisgrenze des Plattenlesers nicht überschreitet.

Am Ende der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter Stopplösung in jede Vertiefung und messen Sie den OD490 auf einem geeigneten Plattenlesegerät, um die Berechnung des prozentualen Anteils der Zelllyse pro Vertiefung zu ermöglichen. Während Typ-Makrophagen, die Nigericin ausgesetzt waren, die Bildung eines ASC-Fokus in der perinukleären Region zeigen, die auch aktive Caspase-1 enthalten, was darauf hindeutet, dass diese Zellen einer Pyroptose unterzogen werden. Während Makrophagen von Caspase-111-defizienten Mäusen ebenfalls einen ASC-Fokus erzeugen, haben diese Zellen kein aktives Caspase-1, das mit diesem Fokus assoziiert ist, was durch das Fehlen einer FAM-YVAD-FMK-Färbung angezeigt wird.

Auch sind die Zellkerne dieser Zellen nicht kondensiert, was auf das Fehlen eines pyroptotischen Zelltods hinweist. Darüber hinaus erleidet ein großer Prozentsatz der Wildtyp-Makrophagen nach Nigericin-Exposition den Zelltod, gemessen durch LDH-Freisetzungsanalyse ihrer Kulturüberstände, während Makrophagen mit einem Mangel an Caspase-1 kein LDH in den Überstand abgeben, was darauf hindeutet, dass die Zellen noch intakt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Bildung von Inflammasom durch Fluoreszenzmikroskopie visualisieren und den Grad der Zelllyse durch Messung der LDH-Freisetzung bestimmen können.

Dieses Verfahren kann für die Verwendung anderer Inflammasom-Reize oder Interventionen modifiziert werden, die die Inflammasomaktivierung oder Pyroptose verändern.