Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen
15. März 2018
In diesem Artikel besprechen wir drei Gehirn-Präparate für die ganze Zelle Patch Clamp Aufzeichnung die Retinotectal Schaltung von Xenopus Laevis Kaulquappen zu studieren. Jede Vorbereitung, mit ihren eigenen spezifischen Vorteilen, trägt zur experimentellen Lenkbarkeit des Xenopus Kaulquappe als Vorbild für neuronale Schaltkreis-Funktion zu untersuchen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, elektrophysiologische Ganzzellaufnahmen von Neuronen des Kaulquappen-Optikum-Tectums zu erhalten, um mehr über ihr Konnektivitätsmuster während der Entwicklung zu erfahren und letztendlich zu verstehen, wie neuronale Schaltkreise entstehen und funktionieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der neuronalen Entwicklung zu beantworten, z. B. wie sich Neuronen im Laufe der Entwicklung verändern und wie Schaltkreise funktionieren, um Verhalten hervorzurufen. Der Hauptvorteil dieser Präparate besteht darin, dass sie die elektrophysiologische Aufzeichnung von Neuronen des optischen Tectum ermöglichen, um Aufschluss über die Funktion der sich entwickelnden neuronalen Schaltkreise zu geben.
Das Verfahren wird von Zhenyu Lui, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Bewegen Sie die anästhesierte Kaulquappe mit einer Entsorgungspipette in eine Dissektions-Aufzeichnungsschale, die eine externe Aufzeichnungslösung enthält. Befestigen Sie die betäubte Kaulquappe an einem untergetauchten Silikonblock auf dem Boden der Präparierschüssel.
Um eine klare Sicht auf das Gehirn zu erhalten, entfernen Sie die Haut über dem Gehirn, indem Sie mit einer sterilen 25-Gauge-Nadel einen oberflächlichen Schnitt entlang der Mittellinie vornehmen. Filetieren Sie das Gehirn entlang der gleichen Mittellinienachse, indem Sie die Nadel in das Neuralrohr einführen und vorsichtig nach oben ziehen, so dass der dorsale Teil des Rohrs sauber geschnitten wird, während die Bodenplatte intakt bleibt. Um das Gehirn zu isolieren, verwenden Sie zunächst eine 25-Gauge-Nadel, um das Hinterhirn zu durchtrennen.
Führen Sie dann die Nadel vorsichtig in kaudaler bis rostraler Richtung unter das Gehirn hindurch, um das gesamte laterale und ventrale Bindegewebe und die Nervenfasern zu durchtrennen. Befestigen Sie als Nächstes das Gehirn an einem Block aus Silikonelastomer, indem Sie einen Stift durch einen der Riechkolben und einen weiteren Stift durch das Hinterhirn stecken. Dies ist die optimale Konfiguration für die Aufzeichnung von tektalen Neuronen.
Bewegen Sie dann die Schale mit dem festgesteckten Ganzhirnpräparat aus dem Präparierfernrohr in das Elektrophysiologie-Rig. Entfernen Sie die Ventrikelmembran mit einer Pipette aus zerbrochenem Glas. Um die RGC-Axone direkt zu aktivieren, senken Sie eine bipolare Stimulationselektrode vorsichtig auf das Chiasma opticum, so dass sich eine kleine Delle im Gewebe bildet.
Die bipolare Stimulationselektrode sollte rostral und fast angrenzend an den großen Mittelventrikel sein, in dem sich das Chiasma opticum befindet. Die bipolare Elektrode wird von einem Impulsstimulator angetrieben, mit dem die Stärke der Stimulation präzise gesteuert werden kann. Um den horizontalen Hirnschnitt vorzubereiten, beginnen Sie mit der Vorbereitung des gesamten Gehirns.
Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um das seitlichste Viertel einer Seite eines optischen Tectums herauszuschneiden. Dieser Schnitt wird parallel zur rostralen Schwanzebene ausgeführt. Anschließend wird das Gehirn wieder an die Seite des Silikonelastomers geheftet, wobei die geschnittene Seite nach oben zeigt, so dass die Somata und das Neuropil für die Aufzeichnung direkt zugänglich sind, und die ventrikuläre Oberfläche des Gehirns vom Silikonelastomerblock abgewandt ist, so dass eine bipolare Elektrode auf dem Chiasma opticum platziert werden kann.
Führen Sie dann die Ganzzell-Patch-Klemme oder die lokale Feldpotentialaufzeichnung durch. Hier ist das Schema, das die Konfiguration einer horizontalen Hirnschnittpräparation zeigt. Es ist zu beachten, dass, obwohl die Stimulationselektrode am Chiasma opticum verbleibt, die Aufzeichnungspipette jetzt so positioniert ist, dass sie auf Zellen über alle tektalen Schichten hinweg zugreifen kann, die durch die horizontale Hirnschnittpräparation freigelegt wurden.
Dabei handelt es sich um eine RGC-evozierte Reaktion eines Neurons, das sich in der oberflächlichen Schicht des Tectums befindet. In dieser Abbildung sind die aufgezeichneten Feldpotentiale über das Neuropil und die umgewandelten Stromquellendichten in einem Bilddiagramm dargestellt. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden und dauert in der Regel bis zu drei oder vier Stunden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Vorbereitung des gesamten Gehirns und der horizontalen Hirnschnitte für Ganzzellaufnahmen durchführen, um die elektrischen Eigenschaften der tektalen Neuronen und ihre Konnektivität zu quantifizieren.
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Übersicht
Diese Studie untersucht Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungstechniken, um die retinotektorale Schaltung in Xenopus laevis-Kaulquappen zu erforschen. Mithilfe unterschiedlicher Gehirnpräparationen zielt die Forschung darauf ab, die Konnektivitätsmuster von Neuronen im optischen Tektum der Kaulquappe während der Entwicklung sowie die Gesamtfunktion neuronaler Schaltkreise zu verstehen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Neuronale Schaltkreise
Hintergrund
- Untersuchung der Entstehung und Funktion von neuronalen Schaltkreisen in sich entwickelnden Organismen.
- Der retinotektonale Schaltkreis ist entscheidend für die visuelle Verarbeitung bei Amphibien.
- Xenopus-laevi-Keulenschwänze stellen ein wertvolles Modell zur Erforschung der neuronalen Vernetzung dar.
- Ganzzellableitungen liefern detaillierte Einblicke in die neuronale Aktivität.
Zweck der Studie
- Die Muster der Vernetzung zwischen Neuronen im Optischen Tektum verstehen.
- Untersuchen, wie sich Neuronen während der Entwicklung verändern.
- Erkunden, wie neuronale Schaltkreise zum Verhalten beitragen.
Verwendete Methoden
- Es wurden Ganzzell-Patch-Clamp-Methoden für elektrophysiologische Ableitungen verwendet.
- Das biologische Modell umfasste präparierte Froschlarvengehirne zur Untersuchung von Neuronen im Optischen Tectum.
- Es wurden keine Multiomik-Workflows erwähnt.
- Zu den spezifischen Schritten gehörten die Immobilisierung der Froschlarve, die Isolierung des Gehirns und die Durchführung gezielter Ableitungen.
- Mit den Methoden ist es möglich, innerhalb eines entscheidenden Zeitfensters von 10 Minuten Aufzeichnungen vorzunehmen, die typischerweise mehrere Stunden andauern.
Hauptergebnisse
- Die Präparationen ermöglichten erfolgreich die Aufzeichnung neuronaler Aktivität im Tectum.
- Elektrophysiologische Veränderungen, die auf neuronale Vernetzung hindeuten, wurden beobachtet.
- Die Ergebnisse führten zu Diskussionen über die funktionellen Implikationen der retinotektalen Schaltung.
- Die Befunde tragen zum Verständnis der Entwicklung neuronaler Schaltkreise bei.
Schlussfolgerungen
- Diese Forschung demonstriert wirksame Methoden zur Untersuchung der neuronalen Konnektivität in sich entwickelnden Kaulquappenhirnen.
- Die Studie vertieft das Verständnis der Funktion neuronaler Schaltkreise während der Entwicklung.
- Die Ergebnisse haben weiterreichende Implikationen für die Untersuchung neurologischer Prozesse und Verhaltensweisen bei Amphibien.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mit der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung an Xenopus laevis-Kaulquappen ist eine hochauflösende Untersuchung der Bildung und Funktion neuronaler Schaltkreise möglich, wodurch mechanistische Einblicke in die synaptische Vernetzung und neuronale Erregbarkeit während der Entwicklung gewonnen werden. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung in der Neurowissenschaft, indem er die direkte Messung neuronaler Antworten auf definierte Reize ermöglicht, beispielsweise die von Ganglienzellen der Retina ausgelöste Aktivität im Optischen Tectum. Die Anpassungsfähigkeit dieser Methode an in-vivo-, Ganzhirn- und horizontale Schnittpräparationen verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für die präklinische Risikominderung bei neurodevelopmentalen Zielstrukturen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung neuronaler Reaktionen auf sensorische Reize und klärt die funktionelle Konnektivität in sich entwickelnden Schaltkreisen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte elektrophysiologische Messungen neuronaler Aktivität und verringert damit die Uneindeutigkeit bei der Zielstrukturenbindung.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Priorisierung von Projektportfolios, indem genetische oder pharmakologische Störungen mit messbaren Veränderungen der Erregbarkeit tectaler Neuronen und ihrer synaptischen Integration verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening vor, indem stabile, aufzeichnungsfähige neuronale Präparationen mit definierten Stimulus-Reaktions-Eigenschaften etabliert werden.
- Quantitative Ausgangsgrößen: Erzeugt elektrophysiologische Messungen wie postsynaptische Ströme und Feldpotentiale, die Dosis-Wirkungs-Analysen und die Quantifizierung von Substanzeffekten ermöglichen.
- Plattform-Wiederverwendung: Die horizontale Hirnschnitt-Präparation erlaubt die Ableitung aus allen Tektumschichten, wodurch die Durchsatzrate und Konsistenz bei wiederholten Experimenten erhöht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert neurodevelopmentale Prozesse, die für Störungen mit fehlerhafter Verschaltung von neuronalen Schaltkreisen relevant sind, und unterstützt die Erforschung translationaler Biomarker.
- Präklinische Kontinuität: Verbindet Entdeckung und Validierung, indem konsistente Aufzeichnungen neuronaler Funktionen über verschiedene Entwicklungszeitpunkte hinweg ermöglicht werden.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Kriterien basierend auf elektrophysiologischen Phänotypen und verringert so das Risiko spätzeitiger Fehlschläge in neurodevelopmentalen Programmen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie eine funktionelle Validierung neuronaler Zielstrukturen vor der Leitstruktur-Optimierung ermöglicht, wobei die Ergebnisse sowohl die Zielstrukturauswahl als auch das mechanistische Verständnis beeinflussen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Aufzeichnung evozierter Antworten tectaler Neurone nach Stimulation der Axone retinaler Ganglienzellen.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch reproduzierbare Ganzhirn- und Schnittpräparationen, die quantifizierbare elektrophysiologische Messgrößen für die Wirkstoffprüfung liefern.
- Analytik: Bietet quantitative Messungen abhängiger Variablen wie Stromamplituden und Latenzzeiten und ermöglicht so den Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Validität, indem krankheitsrelevante Schaltkreiseigenschaften über verschiedene Präparationen hinweg erhalten bleiben und die Abstimmung von Biomarkern unterstützt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare elektrophysiologische Plattform, die an verschiedene experimentelle Kontexte angepasst werden kann und somit redundante Methodenentwicklungen reduziert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unschärfen durch direkte neuronale Ableitungen verringert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung zwischen Laboren durch definierte Präparationsprotokolle für in-vivo-, Ganzhirn- und Schnittpräparat-Methoden.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem eine frühzeitige Erkennung unwirksamer Substanzen ermöglicht wird und somit Investitionen in nicht tragfähige Targets vermieden werden.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem elektrophysiologische Ergebnisse mit der Funktion auf Schaltkreisebene verknüpft werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Elektrophysiologie und mikrochirurgischen Dissektionstechniken für eine konsistente Gehirnpräparation.
- Ist abhängig von stabilen extrazellulären Ableitungslösungen und funktionstüchtiger Stimulationsausrüstung für zuverlässige evozierte Antworten.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Stimulusparametern und Ableiteinstellungen, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Kann je nach Modellsystem Anpassungen der Dissektions- und Plattiertechniken aufgrund von Gehirngröße und Zugänglichkeit notwendig machen.
- Praktische Einschränkungen umfassen vom Operateur abhängige Erfolgsraten und die Stabilität der Präparation über längere Ableitsitzungen hinweg.
