Name: Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Lernen Sie die Ganz-Zell-Patch-Clamp-Methode zur Aufzeichnung neuronaler Aktivität im Tectum opticum von Xenopus laevis Kaulquappen. Diese Technik ermöglicht detaillierte Einblicke in die Entwicklung neuronaler Schaltkreise.

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Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Wyoming genehmigt. Alle Verfahren, einschließlich elektrophysiologische Aufnahmen erfolgt bei Zimmertemperatur ca. 23 ° C. Alle hier beschriebene Methoden sind für die Aufzeichnung von tectal Neuronen von Kaulquappen zwischen Entwicklungsstadium 42 und 49 (inszeniert nach Neiuwkoop und Faber15) optimiert.
1. in-Vivo -Vorbereitung
<ol><li>Die Kaulquappe zu betäuben.<ol>
<li>Legen Sie die Kaulquappe in eine kleine Petrischale mit Steinbergs Lösung mit 0,01 % MS-222 für ca. 5 Minuten. Hinweis: MS-222 aka "Tricaine" ist eine gemeinsame Fische und Amphibien Narkose. Die Kaulquappen sind aufgewachsen in der Steinberg-Lösung in mM: 0,067 KCl, 0,034 Ca (NO3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.</li>
		<li>Sicherstellen Sie, dass die Kaulquappe tief betäubt (nicht mehr reagiert und nicht mehr schwimmen) bevor Sie mit Schritt 2 fortfahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sichern Sie den narkotisierten Kaulquappe zu einem versunkenen Silikon Block auf dem Boden der Schale sezieren/Aufnahme.<ol>
<li>Verwenden eine Einweg-Transferpipette narkotisierter Kaulquappe auf eine Dissektion/Aufnahme-Schale mit externen Aufzeichnungslösung verschieben (115 mM NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl2, 3 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM Glukose; justieren pH bis 7,25 mit 10 N NaOH, Osmolarität 255 mOsm).<ol>
<li>Zur Minimierung von spontanen Muskel zuckt, Hinzufügen der Acetylcholin-Rezeptor-Blocker, Tubocurarin (100 µM), die externe Lösung. (In der Regel geschieht dies durch die Verwendung einer 200 µL Pipette 10 mL externe Lösung 100 µL einer 10 mM Tubocurarin Aktie hinzu).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mit Hilfe der Insekten Pins, sichern die Kaulquappe, Rückenseite, einem untergetauchten Block aus Silikon-Elastomer (z. B. Sylgard 184, siehe Materialtabelle für Details), die hat auf den sezierenden Gericht Boden geklebt worden. Hinweis: Die Platzierung der Pins ist kritisch: Legen Sie sie auf beiden Seiten des Gehirns, zu vermeiden, durchbohrt die afferenten RGC Axone ausreichend kaudalen dieses Projekt aus dem Auge und geben das Gehirn nur anterior optic Tectum (Abb. 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filet im Gehirn entlang der Mittellinie.<ol>
<li>Entfernen Sie für eine klare Sicht auf das Gehirn die Haut über das Gehirn durch einen oberflächlichen Schnitt entlang der Mittellinie mit einer sterilen Nadel 25 G.</li>
		<li>Filetieren Sie und das Gehirn entlang der gleichen Mittellinie Achse durch Einsetzen der Nadel in das Neuralrohr und ziehen sanft nach oben (dorsal) solche, die der dorsale Teil des Rohres sauber (abgetrennten) geschnitten wird beim Verlassen der Bodenplatte intakt (Abbildung 1B). Hinweis: Es ist wichtig, dass die Bodenplatte des Neuralrohrs intakt gelassen werden, weil die afferenten sensorischen Inputs über die Bodenplatte der Tectum eingeben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die transparente ventrikuläre Membran, die die tectal Neuronen deckt.<ol>
<li>Bewegen Sie die Aufnahme Schale Elektrophysiologie-Rig und eine zerbrochenes Glas-Pipettenspitze, um ventrikuläre Membran darüberliegenden tectal Neuron Zelle stellen zu entfernen. Brechen Sie die Spitze von leicht über eine heikle Aufgabe Scheibenwischer ziehen.</li>
		<li>Schrauben Sie die Pipette in die Pipette Halterung und senken Sie es hinunter die optic Tectum über dem Mikromanipulator.</li>
		<li>Verwenden Sie die defekte Pipette um zu schälen die ventrikuläre Membran von der Tectum. Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Membran aus der gesamten Tectum entfernen; ein kleines Fenster wird genügen und den Zugriff auf viele Neuronen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erhalten Sie die gesamte Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen. Hinweis: Der Ansatz von diesem Punkt an ist ähnlich Durchführung ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von Maus Gehirnscheiben beschriebenen Segev, Et al. 16 (Abbildung 1C).</li>
	<li>Zeichnen Sie die tectal Neuron Antworten auf ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut projiziert.<ol>
<li>Um ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut zu projizieren, platzieren Sie eine Glasfaser neben der Kaulquappe Auge. Am anderen Ende der optischen Faser ist eine LED im Einklang mit einem Variablen Widerstand, der für die leichte Leuchtdichte kontrolliert werden kann. Auslöser der LED durch den digitalen Ausgang des Verstärkers. Auf diese Weise aufgezeichnet ganze Feld, das Lichtblitze unterschiedlicher Intensität des Lichts werden können (Abb. 4A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ganzes Gehirn Vorbereitung
<ol><li>Führen Sie Schritte 1.1 bis 1.3. Hinweis: Gibt es keine Notwendigkeit für Tubocurarin in die externe Lösung für dieses Präparat.</li>
	<li>Das Gehirn zu isolieren.<ol>
<li>Verwenden Sie eine 25-G-Nadel Hinterhirn (Abb. 2A) zu durchtrennen.</li>
		<li>Um das ganze Gehirn von der Kaulquappe zu isolieren, führen Sie die Nadel sanft unter das Gehirn in einer kaudalen, rostral Richtung alle lateralen und ventralen Bindegewebe und Nervenfasern zu durchtrennen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sichern Sie das Gehirn in einen Block aus Silikon-Elastomer.<ol>
<li>Sobald völlig befreit, sichern Sie das Gehirn in einen Block aus Silikon-Elastomer indem man eine Nadel durch eines der olfaktorischen Birnen und einem anderen Stift durch das Hinterhirn (Abbildung 2B). Dies ist die optimale Konfiguration für die Aufnahme von tectal Neuronen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verschieben Sie die Schale mit der fixierten ganze Gehirn Vorbereitung vom sezierenden Anwendungsbereich der Elektrophysiologie-Rig. Entfernen Sie die ventrikuläre Membran mit einer Pipette Glasscherben, wie unter Punkt 1.4 beschrieben.</li>
	<li>Legen Sie eine bipolare Elektrode anregendste auf Optik Chiasmus (wo kreuzen die Axon-Traktate von jedem Auge im Mittelhirn) um die RGC Axone direkt zu aktivieren.<ol>
<li>Ort der bipolaren anregende Elektrode rostral und fast neben dem großen mittleren Ventrikel. Die Optik Chiasmus befindet sich unmittelbar rostral zum großen mittleren Ventrikel (Abbildung 2B).<ol>
<li>Senken Sie sanft die anregende Elektrode nach unten auf die Optik Chiasmus derart, dass eine kleine Delle im Gewebe gebildet wird. Die bipolare Elektrode treibt ein Puls-Stimulator ermöglicht die Stärke der Stimulation genau kontrolliert werden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme (Abbildung 2C), wie durch Segev, Et Al. beschrieben 16
</li>
</ol>3. horizontale Gehirn Slice Vorbereitung
<ol><li>Führen Sie Schritte 2.1 bis 2.3.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Rasierklinge, Verbrauchsteuern am seitlichen viertes (welche in Vivo am dorsalen vierten entspricht) von einer Seite von einem optic Tectum. Dieser Schnitt erfolgt parallel zur rostral-kaudalen Ebene, wie in Abbildung 3dargestellt.</li>
	<li>Neu pin das Gehirn auf die Seite der Silikon-Elastomer mit den in Scheiben geschnittenen Seite nach oben (so dass die Somata und Neuropil direkt für die Aufnahme zur Verfügung steht) und die ventrikuläre Oberfläche des Gehirns abgewandten des Silikon-Elastomer-Blocks (Abbildung 3 B) (so, dass eine bipolare Elektrode auf die Optik Chiasmus platziert werden kann).</li>
	<li>Durchführen Sie die ganze Zelle Patch Clamp oder lokale eingereichten mögliche Aufzeichnung (Abb. 3C), wie beschrieben durch Segev, Et al. 16
</li>
</ol>

<ol><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).</li>
<li>Pratt, K. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s40139-015-0075-1">Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole.</a> Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).</li>
<li>Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+function+of+the+Xenopus+tadpole+retinotectal+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).</li>
<li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+regulation+of+voltage-gated+intrinsic+currents+in+the+developing+optic+tectum+of+the+Xenopus+tadpole%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole.</a> J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).</li>
<li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+transmission+in+a+developing+visual+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit.</a> J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).</li>
<li>Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+analysis+of+electrophysiological+diversity+of+Xenopus+visual+neurons+during+development+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity.</a> Elife. 4, 11351(2015).</li>
<li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li>
<li>Wu, G., Malinow, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8875937">Cline H.T. of a central glutamatergic synapse.</a> Science. , 972-976 (1996).</li>
<li>Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory-evoked+spiking+behavior+emerges+via+an+experience-dependent+plasticity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism.</a> Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).</li>
<li>Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transcription+of+BDNF+enhances+visual+acuity+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development.</a> Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).</li>
<li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705(2008).</li>
<li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+avoidance+in+Xenopus+tadpoles+is+correlated+with+the+maturation+of+visual+responses+in+the+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum.</a> J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li>
<li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+horizontal+brain+slice+preparation%3A+a+novel+approach+for+visualizing+and+recording+from+all+layers+of+the+tadpole+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum.</a> J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland. New York. (1994).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).</li>
<li>Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Relationships+Impact+Neuronal+Tuning+within+a+Phylogenetically+Ancient+Vertebrate+Brain+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure.</a> Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).</li>
<li>Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+and+inhibition+in+recurrent+networks+mediate+collision+avoidance+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles.</a> Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).</li>
<li>Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+to+see%3A+patterned+visual+activity+and+the+development+of+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function.</a> Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).</li>
<li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+integration+in+mesencephalic+trigeminal+neurons+in+Xenopus+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles.</a> J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Alle in dieser Arbeit beschriebene Methoden sind für die Aufzeichnung von tectal Neuronen von Kaulquappen zwischen Entwicklungsstadium 42 und 49 (inszeniert nach Neiuwkoop und Faber15) optimiert. Stufe 42, die Kaulquappen sind groß genug und ausreichend entwickelt, dass die Insekten Pins auf beiden Seiten des Gehirns für in-Vivo -Aufnahmen und für die Durchführung des gesamten Gehirns Dissektion platziert werden können. In früheren Stadien, wenn die Kaulquappen im wesentlichen zweidimensi...

Die Retinotectal-Schaltung ist der Hauptbestandteil des Sehsystems Amphibien. Es umfasst die Routinggruppenconnectors im Auge, die ihre Axone, die optic Tectum Projekt wo sie synaptische Verbindungen mit tectal postsynaptischen Neuronen bilden. Die Xenopus Kaulquappe Retinotectal Schaltung ist ein beliebtes Entwicklungs Modell Untersuchung neuronaler Schaltkreis Bildung und Funktion. Es gibt viele Attribute dieser Kaulquappe Retinotectal Schaltung, die es ein leistungsfähiges experimentellen Modell1,2,3machen. Ein wichtiges Attribut, und der Schwerpunkt dieses Artikels ist die Möglichkeit, ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen aus tectal Neuronen, in Vivo oder über eine ganze Gehirn Vorbereitung durchzuführen. Mit einem Elektrophysiologie Rigg ausgestattet mit einem Verstärker, der Spannung und Strom-Klemme Aufnahmemodi unterstützt, können ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen eines Neurons Elektrophysiologie bei hoher Auflösung charakterisiert werden. Infolgedessen haben ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von tectal Neuronen über die wichtigsten Phasen der Retinotectal Schaltung Bildung ein detailliertes und umfassendes Verständnis für die Entwicklung und Plastizität der intrinsischen4,5 zur Verfügung gestellt , 6 , 7 und synaptischen8,9,10,11 Eigenschaften. Kombinieren ganze Zelle Patch Clamp tectal Neuron Aufnahmen, fördert die Möglichkeit, Gene oder Morpholinos Interesse an diesen Neuronen12und eine Methode, um visuelle Führung Verhalten über eine etablierte visuellen Vermeidung Test13 beurteilen die Identifizierung von Verbindungen zwischen Molekülen, Kreislauf-Funktion und Verhalten.
Es ist wichtig zu beachten, dass die hohe Auflösung, die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen gewonnenen Daten nicht mit neueren bildgebenden Ansätze wie die genetische Kalzium-Anzeige GCaMP6, da geht obwohl Kalzium Indikatoren mit die Bildgebung erlaubt von Calcium Dynamik über große Populationen von Neuronen gleichzeitig, es gibt keine direkte oder naheliegender Weise, dass die spezifischen elektrischen Parameter erhalten Sie durch die Messung der Fluoreszenz-Delta in den Somata, und es keine Möglichkeit, Spannung gibt Klemme das Neuron nach Maß Strom-Spannungs-Beziehungen. Klar, diese zwei unterschiedliche Ansätze, elektrophysiologische Aufnahmen und Kalzium Imaging, besitzen nicht überlappende stärken und erzeugen verschiedene Arten von Daten. Somit hängt der beste Ansatz von experimentellen konkret in Angriff genommen.
Hier beschreiben wir unsere Methode für den Erwerb der ganze Zelle Patch Clamp Aufnahmen von Neuronen der Kaulquappe optic Tectum mit einer in Vivo -Vorbereitung, ganze Gehirn Vorbereitung und eine neuere verändert ganze Gehirn-Vorbereitung, die in unserem Labor14 entwickelt wurde . Im Abschnitt Vertreter Ergebnisse zeigen wir die experimentelle Vorteile jeder Vorbereitung und die verschiedenen Arten von Daten, die abgerufen werden können. Die Grenzen und Stärken der verschiedenen Zubereitungen, sowie Tipps zur Fehlerbehebung, sind in die Diskussion Abschnitt enthalten.

<table><tbody><tr><td>Stemi Stereo 508</td><td>Zeiss</td><td>495009-0006-000&nbsp;</td><td>Präpariermikroskop</td></tr><tr><td>MS-222 "Tricane"</td><td>Finquel</td><td>ARF5G</td><td>Amphibisches Vollnarkosemittel</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Zur Herstellung der Stienbergschen Lösung und der externen Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Zur Herstellung der Stienbergschen Lösung und der externen Lösung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td>Wird zur Herstellung der Stienberg-Lösung und der externen Lösung</td></tr> verwendet <tr><td>Calciumnitrattetrahyrat (Ca(NO3)&bull; 4H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124-500G</td><td>Wird zur Herstellung der Stienberg-Lösung verwendet&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (MgSO4)</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Zur Herstellung der Steinberg-Lösung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>Zur Herstellung der externen Aufnahmelösung</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-01</td><td>Zur Herstellung der externen Aufnahmelösung</td></tr><tr><td>D-Glukose wasserfrei</td><td>Mallinckrodt Chemikalien</td><td>6066-04</td><td>Wird zur Herstellung einer externen Aufzeichnungslösung</td></tr><tr><td>verwendet Tubocurarinhydrochlorid Pentahydrat</td><td>Sigma</td><td>T2379</td><td>Nikotinischer Acetylcholinrezeptor-Antagonist</td></tr><tr><td>Insektenstifte</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Edelstahlstifte mit 0,1 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td>761028</td><td>Vorgewogenes Monomer- und Härter-Kit</td></tr><tr><td>Sterile Petrischale aus Polystyrol - 60x15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4052</td><td>Kleine Petrischalen</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Nadel 25Gx5/8 (0,5 mm x 16 mm)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Spritzennadeln</td></tr><tr><td>1 ml Slip Tip Tuberkulinspritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td>sterile Einwegspritzen</td></tr><tr><td>Borosilikat-Pipette Glas</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10HP</td><td>Mit der Pipettenziehmaschine auf die gewünschten Spezifikationen gezogen</td></tr><tr><td>Flammen-/Braun-Mikropipetten-Abzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Stellt Mikropipetten für elektrophysiologische Aufzeichnungen</td></tr><tr><td>her Kimwipes Kimtech-Tücher</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>Delicate Axon</td></tr><tr><td>Instruments MultiClamp 700B Kopftisch CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td>Stromzange und Spannungszange Kopftisch</td></tr><tr><td>MP-285 Motorisierter Manipulator mit Tischregler</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285/T</td><td>Steuerung für den Kopftisch auf dem Elektrophysiologie-Rig</td></tr><tr><td>Fasergekoppelte LED (grün)</td><td>Thorlabs</td><td>M530F2</td><td>Lichtwellenleiter gepaart mit grüner LED</td></tr><tr><td>Bipolare Cluster-Elektrode (25&Mikro; m Durchmesser)</td><td>FHC</td><td>30207</td><td>Bipolare Stimulationselektrode</td></tr><tr><td>ISO-Flex Stimulator</td><td>A.M.P.I. (Israel)&nbsp;</td><td>Flexibler</td><td>Stimulus-Isolator</td></tr><tr><td>Axon Instruments 700B Multipatch-Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Verstärker für Spannungs- und Strom-Clamp-Aufzeichnung&nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1322A Digitalisierer</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-135</td><td>Datenerfassungssystem für die elektrophysiologische Aufzeichnung</td></tr><tr><td>Axio Examiner.A1</td><td>Zeiss</td><td>491404-0001-000&nbsp;</td><td>Mikroskop für Elektrophysiologie</td></tr><tr><td>Micro-g Labortisch</td><td>TMC</td><td>63-533</td><td>Lufttisch für Elektrophysiologie-Mikroskop</td></tr><tr><td>Inspiron 620 Personal Desktop-Computer mit Windows 7 64-Bit</td><td>Dell</td><td>D06D001</td><td>Computer mit Elektrophysiologie-Software</td></tr><tr><td>c2400 CCD-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>70826-5</td><td>Kamera mit Ladungsgekoppeltem Gerät für elektrophysiologische Bildgebung</td></tr><tr><td>7 Uhr Super Platinum Edelstahl Rasierklingen</td><td>Gillette</td><td>CMM01049</td><td>Platinbeschichtete Edelstahl-Rasierklingen</td></tr><tr><td>Transferpipetten Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Einweg-Transferpipetten aus Polyethylen</td></tr></tbody></table>

vorbereitungen und protokolle für die ganze zelle patch clamp aufnahme von xenopus laevis tectal neuronen

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Die Xenopus Kaulquappe Retinotectal Schaltung, bestehend aus der retinalen Ganglienzellen (Routinggruppenconnectors) in das Auge, welches Formular direkt auf Neuronen in der optic Tectum Synapsen, ist ein beliebtes Modell, wie neuronale Schaltkreise zu studieren selbst zusammensetzen. Die Fähigkeit zur Durchführung der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahmen vom tectal Neuronen und zum Rekord RGC-evozierten Antworten, entweder in Vivo oder mit einer ganzen Gehirn Zubereitung, hat einen großen Körper der hochauflösenden Daten über die normalen Mechanismen erzeugt , und abnorme, Schaltung Bildung und Funktion. Hier beschreiben wir in Vivo Vorbereitung, die ursprüngliche ganze Gehirn-Vorbereitung, Durchführung und mehr vor kurzem horizontalen Gehirn Slice Vorbereitung für den Erhalt der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahmen von tectal Neuronen. Jede Vorbereitung hat einzigartige experimentelle Vorteile. Die in Vivo -Vorbereitung ermöglicht die Aufzeichnung der direkte Reaktion des tectal Neuronen auf visuelle Reize, die auf das Auge projiziert. Die ganze Gehirn Vorbereitung ermöglicht die RGC Axone sehr kontrollierte Art und Weise aktiviert werden, und die horizontalen Gehirn Slice Vorbereitung ermöglicht die Aufnahme von über alle Ebenen der Tectum.

Um Licht-evozierten Antworten zu erfassen ist ein ganzes Feld Lichtblitz auf die Netzhaut projiziert, während die resultierende Reaktion von einzelnen tectal Neuronen (Abb. 4A) erfasst wird. Dieses besondere Protokoll wurde entwickelt, um sowohl die Reaktion des Neurons, das Licht einschalten ("On" (Antwort) und dann ausschalten 15 Messen s später zu messen, die "Off-Antwort." Tectal Neuronen weisen in der Regel robuste ein- und Ausschalten A...

In diesem Artikel besprechen wir drei Gehirn-Präparate für die ganze Zelle Patch Clamp Aufzeichnung die Retinotectal Schaltung von Xenopus Laevis Kaulquappen zu studieren. Jede Vorbereitung, mit ihren eigenen spezifischen Vorteilen, trägt zur experimentellen Lenkbarkeit des Xenopus Kaulquappe als Vorbild für neuronale Schaltkreis-Funktion zu untersuchen.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, elektrophysiologische Ganzzellaufnahmen von Neuronen des Kaulquappen-Optikum-Tectums zu erhalten, um mehr über ihr Konnektivitätsmuster während der Entwicklung zu erfahren und letztendlich zu verstehen, wie neuronale Schaltkreise entstehen und funktionieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der neuronalen Entwicklung zu beantworten, z. B. wie sich Neuronen im Laufe der Entwicklung verändern und wie Schaltkreise funktionieren, um Verhalten hervorzurufen. Der Hauptvorteil dieser Präparate besteht darin, dass sie die elektrophysiologische Aufzeichnung von Neuronen des optischen Tectum ermöglichen, um Aufschluss über die Funktion der sich entwickelnden neuronalen Schaltkreise zu geben.Das Verfahren wird von Zhenyu Lui, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Bewegen Sie die anästhesierte Kaulquappe mit einer Entsorgungspipette in eine Dissektions-Aufzeichnungsschale, die eine externe Aufzeichnungslösung enthält. Befestigen Sie die betäubte Kaulquappe an einem untergetauchten Silikonblock auf dem Boden der Präparierschüssel.Um eine klare Sicht auf das Gehirn zu erhalten, entfernen Sie die Haut über dem Gehirn

preparations-protocols-for-whole-cell-patch-clamp-recording-xenopus

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dies ist als eine Einführung in die Klemme Aufnahme von Xenopus laevis Oozyten Patch soll. Es deckt Dotterhaut Entfernung, Bildung einer Gigaohm Dichtung (Gigaseal) und die optionale Konvertierung der Patch auf die outside-out-Topologie.

Patch Clamp Recording von Ionenkanälen in Xenopus Oozyten exprimiert

Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in...

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik namens Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Mauthner-Neuronen und anderen retikulospinalen Zellen in Zebrafischembryonen ist.

Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

Dieses Video zeigt eine Ganzzell-Patch-Clamp-Technik für die elektrophysiologische Aufzeichnung von einer flach montierten Mausnetzhaut. Eine dünne Glaspipette mit einer Elektrode wird verwendet, um sich den Starburst-Amakrinzellen (SACs) innerhalb der Netzhaut zu nähern. Nach dem Formen einer Versiegelung wird ein Sog angewendet, um die Membran zu brechen und die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration zu bilden. Schließlich wird der Fluss von Ionen durch die synaptischen SAC-Rezeptoren anhand der...

Etablierung einer Ganzzell-Patch-Klemme für die elektrophysiologische Aufzeichnung von einer flach montierten Maus-Netzhaut

Das Video demonstriert eine Methode zur Untersuchung der Erregbarkeit von neuronalen Zellen, die fluoreszierendes Protein exprimieren, mit einer Ganzzell-Patch-Stromklemme. Im Strom-Clamp-Modus werden Aktionspotentiale erzeugt, die auf neuronale Erregbarkeit hinweisen.

Untersuchung der Erregbarkeit fluoreszierender Neuronen mit einer Ganzzell-Patch-Klemme

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Durchführung elektrophysiologischer Aufzeichnungen in Substantia gelatinosa (SG)-Neuronen von Rückenmarksschnitten, wobei Ganzzell-Patch-Clamp-Techniken verwendet werden, um die Feuermuster von Neuronen zu analysieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Reaktionen auf Reize in SG-Neuronen des Rückenmarks.

Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme in einem Substantia gelatinosa-Neuron eines Rückenmarksschnitts

Dieses Video zeigt die Untersuchung der Erregbarkeit sensorischer Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien unter Verwendung der Patch-Clamp-Technik, um die Rheobase und das Membranpotential zu messen und die Reaktionen der Neuronen auf inkrementelle Strominjektionen zu analysieren.

Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an intakten Spinalwurzelganglien der Ratte

Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Erlangung weite Strecken der aktuellen Aufnahme von einem Ionenkanal mit der Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik. Diese Methode erlaubt die Beobachtung in Echtzeit, das Muster der Öffnungs-Schließ-Kanal-Konformationen, die die biologische Signal zugrunde liegen. Diese Daten informieren über Kanaleigenschaften in ungestörten biologischen Membranen.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

Wir präsentieren ein Protokoll, das Zellisolation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung kombiniert, um die elektrischen Eigenschaften der primär dissoziierten Epithelzellen aus den Ratten-Cauda-Epididymiden zu messen. Dieses Protokoll erlaubt die Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von primären epididymalen Epithelzellen, um die physiologische Rolle des Nebenhodens weiter zu erforschen.

Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

Lernen Sie die Ganz-Zell-Patch-Clamp-Methode zur Aufzeichnung neuronaler Aktivität im Tectum opticum von Xenopus laevis Kaulquappen. Diese Technik ermöglicht detaillierte Einblicke in die Entwicklung neuronaler Schaltkreise.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

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