Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Proteasespezifität in mehreren Rohextrakten zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen zur Bestimmung der Proteasespezifität zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Proteasespezifität mehrerer Proben im Parlay identifizieren kann.

Kühle Lungengewebeproben von männlichen ICR-Mäusen in Eis. Homogenisieren Sie die Proben bei 20.000 U/min für 30 Sekunden in einem Mixer. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Proben vollständig homogen sind.

Nicht länger als eine Minute ununterbrochen homogenisieren, um einen Temperaturanstieg zu vermeiden. 1.000 Mikroliter des Homogenats werden in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und fünf Minuten lang bei 10.000 G bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Füllen Sie 500 Mikroliter des Überstands in ein neues 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen um.

Verwenden Sie 10 Mikroliter der Probe, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Mit Methoden wie dem Bicinchoninsäure-Assay oder dem Bradford-Assay. Um ein Einfrieren zu verhindern, fügen Sie den Proben 80 % Glycerin hinzu, um eine Endkonzentration von 50 % Glycerin zu erreichen.

Um den Unterschied in der Proteasespezifität in Abhängigkeit vom pH-Wert zu verdeutlichen, verwenden Sie Verdauungspuffer, die auf den pH-Wert drei, fünf, sieben und neun eingestellt sind. Geben Sie in 890 Mikroliter eines Verdauungspuffers entweder 10 Mikroliter 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter oder TPCK-Trypsin, 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter Staphylococcus aureus V8-Protease oder 10 Mikrogramm pro Mikroliter Gewebeextrakte. Bereiten Sie Negativkontrollen vor, indem Sie die Protease in Gewebeextrakten durch Inkubation und 10-minütiges Kochen von Wasser inaktivieren.

Geben Sie anschließend 10 Mikroliter MNO-Biotin-Markierungssubstrate zu den Proben und inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um sie zu verdauen. Nach der Inkubation den Aufschluss der Substrate mit kochendem Wasser für 10 Minuten stoppen. Zentrifugieren Sie die verdauten Substrate fünf Minuten lang bei 10.000 Mal G bei vier Grad Celsius.

Den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Geben Sie 50 Milliliter 50%Streptavidin-Sepharosekügelchen in einen molaren Trispuffer, der 0,1%Polyoxyethylenoctylphenylether enthält. Verwenden Sie pH-Testpapier, um sicherzustellen, dass die Lösung einen pH-Wert von etwa neun hat.

Es ist wichtig, den richtigen pH-Wert auf neun oder mehr einzustellen. Aminobiotin kann nicht in eine Abperlung beißen, es sei denn, es hat einen pH-Wert von neun oder höher. Wenn der pH-Wert der Lösung niedrig ist, stellen Sie ihn auf ungefähr pH neun ein, indem Sie mehr Puffer hinzufügen.

Zusätzlich kann ein molaren Tris-Puffer hinzugefügt werden, um den pH-Wert bei Bedarf zu erhöhen. Inkubieren Sie die Suspension über Nacht bei vier Grad Celsius mit kontinuierlichem, sanftem Mischen auf einem Rotatorrad, um die mit MNO-Biotin markierten Substrate an das Streptavidin zu binden. Die Kügelchen sollten während der gesamten Inkubation in der Schwebe bleiben.

Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang bei 10.000 Mal G bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Überstands waschen Sie die Kügelchen durch Zugabe von 1.000 Mikrolitern eines Waschpuffers. Dann 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubieren und dabei kontinuierlich sanft auf einem Rotator mischen.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen eine Minute lang bei 10.000 Mal G bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diese Wäsche viermal. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter 0,2 % Trifluoressigsäure zu den Kügelchen.

Verwenden Sie pH-Testpapier, um sicherzustellen, dass die Lösung unter pH zwei liegt. Wenn der pH-Wert der Lösung hoch ist, stellen Sie den pH-Wert durch Zugabe von 1 %iger Trifluoressigsäure auf unter zwei ein. Die Suspension wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem, sanftem Mischen auf einem Rotatorrad inkubiert.

Nachdem Sie die Kügelchen wie zuvor zentrifugiert haben, wird der Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt. Pipettieren Sie 20 Mikroliter Acetonitril auf ein C18-Harz, um es zu aktivieren. Entfernen Sie das gebrauchte Acetonitril und wiederholen Sie diesen Aktivierungsschritt dreimal.

Äquilibrieren Sie dann das C18-Harz mit 20 Mikrolitern 0,1 % Trifluoressigsäure. Entfernen Sie das Eluant und wiederholen Sie diesen Gleichgewichtsschritt dreimal. Um die Proben zu laden, binden Sie sie mit einer Pipette an das Harz.

Waschen Sie das Harz mit 20 Mikrolitern 0,1%iger Trifluoressigsäure. Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal. Eluieren Sie die Proben mit drei Mikrolitern 60 % Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure.

Pipettieren Sie das Eluans auf eine Zielplatte für die MALDI-TOF-Massenspektromitrie. Sofort CHCA-Lösung zugeben, die mit 50 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure gesättigt ist. Kristallisieren Sie die Mischung durch Lufttrocknung.

Erfassen Sie Massenspektren von Proben gemäß dem Protokoll des Geräteherstellers, wobei Sie genau auf die Massenspektren von 700 bis 900 Dalton für die gespaltene Form der Biotin-Etikettensubstrate achten. Hier sind Massenspektren von synthetischen Substraten dargestellt. Peaks, die dem Molekulargewicht der Vorläufer entsprechen, wurden zwischen 850 und 1.050 detektiert.

Die gespaltenen Fragmente werden im Bereich von 700 bis 850 detektiert. Hier sind die Spektren für MNO-Biotin-markierte Substrate dargestellt, die mit TPCK-Trypsin behandelt wurden. Die Peaks von 839,81 Dalton und 796,76 Dalton entsprechen den Fragmenten, die vom C-Terminus von Lysin bzw. Arginin abgespalten wurden.

Hier sind die Massenspektren von synthetischen Substraten dargestellt, die mit V8-Protease verdaut wurden. Die Peaks von 769,78 Dalton und 755,62 Dalton entsprechen den Fragmenten, die vom C-Terminus der Glutaminsäure bzw. Asparaginsäure abgespalten wurden. Hier sind die Spektren für MNO-Biotin-markierte Substrate dargestellt, die mit einem Lungengewebeextrakt bei verschiedenen pH-Bedingungen behandelt wurden.

Im sauren Zustand, bei pH fünf, betrug das Molekulargewicht eines gespaltenen Fragments 770,13 Dalton und 826,66 Dalton, was auf eine Spaltung von Glutaminsäure und Tryptophan am C-Terminus hinweist. Im neutralen und basischen Zustand, bei pH sieben und neun, war das Molekulargewicht eines gespaltenen Fragments an der Spitze von 767 Dalton und 840 Dalton erhöht, was auf eine Spaltung am C-Terminus von Arginin und Lysin hinweist. Umgekehrt wurden die Peaks von Glutaminsäure und Tryptophan verringert.

Darüber hinaus kann diese Methode keine gespaltenen Fragmente mit inaktivierten Extrakten nachweisen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, mit Ausnahme der Synthese des Substrats. Darüber hinaus kann das Substrat, sobald es synthetisiert ist, in mehreren Proben gemessen werden. Warum?

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, bei einem Puffer-pH-Wert von etwa neun zu arbeiten. Im Allgemeinen ist die Reaktion des Avidin Aminobiotin Komplexes. Nach diesem Verfahren ist es möglich, die Enzymaktivität durch die Durchführung eines CMS zu quantifizieren.

Diese Methode wird es Forschern auf dem Gebiet des Proteons ermöglichen, den Weg für die Erforschung der Proteaseexpression unter verschiedenen Bedingungen zu ebnen.