Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

Das übergeordnete Ziel dieser CDNA-Bibliotheksvorbereitung ist es, eine erfolgreiche Sequenzierung kleiner RNAs zu ermöglichen, die in formalen und fixierten Paraffin-eingebetteten Geweben gelagert wurden. Diese Methode ist sehr nützlich für die Analyse von formalen und fixierten, in Paraffin eingebetteten Proben. Sie extrahieren RNA aus bis zu 18 Proben, analysieren den Gehalt aller Proben und erhalten ein Profil der gesamten microRNase für alle Proben.

Zu Beginn des Protokolls fügen Sie jeder der 18 einzeln aliquotierten FFPERNA-Proben 8,5 Mikroliter des zuvor vorbereiteten Ligations-Mastermixes hinzu. Schnippen Sie vorsichtig mit den Röhrchen und zentrifugieren Sie zwei Sekunden lang. Lagern Sie die Röhrchen nach dem Zentrifugieren auf Eis.

Verwenden Sie eine Drei-Mikroliter-Pipette, um einen Mikroliter jedes Adapters auf die entsprechenden FFPERNA-Proben zu übertragen, die RNA und Ligations-Mastermix enthalten. Pipettieren Sie nicht auf und ab und wechseln Sie die Spitzen zwischen den FFPERNA-Proben. Schließen Sie jedes Röhrchen, schnippen Sie es zum Mischen und zentrifugieren Sie es zwei Sekunden lang.

Lege die Röhren auf Eis. Denaturieren Sie die Reaktionen, indem Sie die Röhren eine Minute lang bei 90 Grad Celsius auf einen Heizblock legen und dann sofort auf Eis legen. Verwenden Sie anschließend eine Drei-Mikroliter-Pipette, um einen Mikroliter des verdünnten Ligationsenzyms in jede der 18 RNA-Proben zu übertragen.

Legen Sie die Ligaturen auf Eis und legen Sie sie für eine Inkubation von 18 Stunden über Nacht in einen vier Grad Celsius kalten Raum. Legen Sie die Röhrchen eine Minute lang bei 90 Grad Celsius auf einen Heizblock, um die Ligationsreaktion zu deaktivieren, und stellen Sie sie dann für mindestens zwei Minuten zum Abkühlen wieder auf Eis. Füllen Sie 1,2 Mikroliter des Fällungs-Mastermixes in jedes Röhrchen um.

Fügen Sie 63 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzu. Schließen Sie jedes Röhrchen, schnippen Sie die Röhrchen, um sie zu mischen, und zentrifugieren Sie sie zwei Sekunden lang. Lege die Röhren auf Eis.

Kombinieren Sie den Inhalt aller 18 Röhrchen in einem einzigen 1,5 Milliliter silikonisierten Röhrchen und drehen Sie es dreimal um, um es zu mischen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen zwei Sekunden lang und legen Sie sie 60 Minuten lang auf Eis, um sie auszufällen. Nach der Fällung zentrifugieren Sie das 1,5-Milliliter-Röhrchen mit den gepoolten Ligaturen.

Entfernen Sie anschließend den Überstand mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze, lassen Sie aber etwas Flüssigkeit am Boden. Kippen Sie das Röhrchen und verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Pipette, um den restlichen Überstand zu entfernen. Saugen Sie den Überstand mit einer Pasteur-Pipette mit einer 10-Mikroliter-Spitze im Vakuum ab und resuspendieren Sie dann das RNA-Pellet in 20 Mikrolitern RNase-freiem Wasser, indem Sie das Röhrchen schnippen.

Fügen Sie 20 Mikroliter PAA-Gelladelösung hinzu, um die RNA zu resuspendieren. Schnippen Sie das Röhrchen, zentrifugieren Sie das Röhrchen zwei Sekunden lang bei Raumtemperatur und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Ersetzen Sie die zuvor vorbereiteten 0,5 XTBE des Gelapparats durch frische 0,5 XTBE und laden Sie letzteres, Größenmarker und ligierte RNase in die Mitte des Gels, wobei auf beiden Seiten zwei leere Vertiefungen verbleiben.

Lassen Sie dann das Gel laufen. Nachdem Sie das Gel laufen lassen, lösen Sie die 15%-Seite, indem Sie eine der Glasplatten entfernen. Besprühen Sie das auf der Glasplatte liegende Gel leicht mit 10 Mikrolitern fluoreszierender Farbstofflösung und 25 Millilitern 0,5 XTBE und lassen Sie es fünf Minuten lang im Dunkeln flach einwirken.

Legen Sie das Glas mit dem Gel auf einen Blaulicht-Transilluminator und richten Sie sowohl 19 Nukleotid- als auch 24 Nukleotidgrößenmarker mit einem Lineal aus, um die Exzision der ligierten kleinen RNAs zu steuern. Schneiden Sie dann das Gel heraus. Geben Sie das exzidierte Gel in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen, das für die Fragmentierung von Gelscheiben ausgelegt ist, und positionieren Sie es sicher in einem silikonisierten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie das Gel bei 16 Tausend G für drei Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie das fragmentierte Gel mit 300 Mikrolitern 400 millimolare Natriumchloridlösung. Verschließen Sie die Tube und verschließen Sie sie mit Paraffinfolie.

Rühren Sie den Inhalt auf einem Thermomischer bei 11 U/min in einem vier Grad Celsius kalten Raum für eine Inkubation über Nacht. Nehmen Sie am nächsten Tag das Röhrchen aus dem Thermomischer und geben Sie die Lösung mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf ein Fünf-Mikrometer-Filterröhrchen, das in ein silikonisiertes, RNasefreies 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen eingeführt wird. Das Röhrchen wird drei Minuten lang bei 23-facher Temperatur G bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Entsorgen Sie das Filterrohr, geben Sie 950 Mikroliter 100%iges Ethanol in das Auffangröhrchen mit der gefilterten Lösung und drehen Sie das Röhrchen um, um es zu mischen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen zwei Sekunden lang und legen Sie es 60 Minuten lang auf Eis. Fälchen Sie dann das RNA-Pellet aus.

Trocknen Sie anschließend das RNA-Pellet, indem Sie die Kappe öffnen und den Überstand vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette entfernen, während Sie etwas Flüssigkeit am Boden belassen. Verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Pipette, um den gesamten restlichen Überstand zu entfernen, ohne das Pellet zu berühren. Kippen Sie das Rohr so, dass sich die verbleibende Lösung auf die gegenüberliegende Seite des Pellets bewegt.

Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um den Überstand abzusaugen und das Pellet mit einem Vakuum zu trocknen. Resuspendieren Sie das RNA-Pellet in 5,6 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Tauen Sie die reversen Transkriptionsreagenzien 15 Minuten lang auf Eis auf.

Richten Sie eine reverse Transkriptionsreaktion ein, indem Sie drei Mikroliter 5-fachen Puffer, 4,2 Mikroliter 10-faches Dioxynukleotidtriphosphat (DNTP) und 1,5 Mikroliter Dithiothreitol (DTT) hinzufügen. Schnippen Sie vorsichtig mit dem Röhrchen, um die Reaktion zu mischen, und zentrifugieren Sie zwei Sekunden lang, um die Lösung aufzufangen. Nachdem die Reaktion genau 30 Sekunden lang auf einem Heizblock bei 90 Grad Celsius stattgefunden hat, übertragen Sie sie zwei Minuten lang direkt in einen Thermomischer bei 50 Grad Celsius, um die Temperatur auszugleichen.

Geben Sie 0,75 Mikroliter des reversen Transkriptionsenzyms direkt in die Lösung. Zum Mischen vorsichtig schnippen und die Tube sofort für 30 Minuten wieder auf 50 Grad Celsius auf den Thermomixer stellen. Übertragen Sie das Röhrchen nach 30 Minuten für eine Minute in einen Wärmeblock bei 95 Grad Celsius, um die reverse Transkription zu stoppen.

Geben Sie 95 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt zur reversen Transkription. Schnippen Sie mit der Tube, um sie zu mischen, und stellen Sie sie zwei Minuten lang direkt auf Eis. Bauen Sie die Pilot-PCR-Reaktion zusammen und richten Sie zwei PCR-Zyklen auf dem Thermocycler ein.

Richten Sie die Pilot-PCR-Reaktion auf dem Thermocycler ein und starten Sie die erste Datei. Am Ende der ersten Datei verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Pipette, um 12 Mikroliter aus der Pilot-PCR-Reaktion in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen, das drei Mikroliter 5X-Gelladefarbstoff enthält. Mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren.

Und beschriften Sie es mit 10 Zyklen. Schließen Sie das Pilot-PCR-Röhrchen und starten Sie die zweite Akte auf dem Thermocycler. Am Ende der zweiten Akte überführen Sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette 12 Mikroliter Lösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit drei Mikrolitern 5X Gelladefarbstoff und beschriften Sie es mit 12 Zyklen.

Wiederholen Sie die obigen Schritte, um 12 Mikroliter PCR-Produkte aus der Pilot-PCR-Reaktion in den PCR-Zyklen 14, 16, 18 und 20 zu sammeln. Geben Sie dann drei Mikroliter 5X-Gelladefarbstoff zu jedem der 12-Mikroliter-PCR-Aliquots und zur 20-Nukleotid-Leiter, die drei Mikroliter Leiter und neun Mikroliter RNase-freies Wasser enthält. Nachdem Sie die Proben auf einem Agarosegel mit 0,5 XTBE laufen lassen, bewerten Sie das Gel auf einer UV-Box, um den optimalen PCR-Zyklus zu identifizieren.

Richten Sie dann die großflächigen PCR-Reaktionen für die Aufreinigung der Agarose-Gelbibliothek ein. Nach der PCR-Amplifikation werden neun Mikroliter aus jedem PCR-Röhrchen in sechs 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, die drei Mikroliter 5X Gelladefarbstoff enthalten. Bereiten Sie eine 20-Nukleotid-Leiter vor.

Laden Sie die Leiter, die negative PCR-Kontrolle und sechs PCR-Produkte auf das Agarose-Gel und lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei 120 Volt laufen. Überprüfen Sie die Einheitlichkeit der PCR-Implifikationen zwischen den Spuren auf einer UV-Box und nehmen Sie ein Bild auf. Kombinieren Sie drei PCR-Reaktionen in zwei silikonisierte 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 27 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid und 950 Mikroliter 100 % Ethanol hinzu.

Drehen Sie die Röhrchen zum Mischen um und stellen Sie sie über Nacht auf 20 Grad Celsius ein, um die PCR-Produkte auszufällen. Mit Hilfe des Protokolls wurde die Mikro-RNA-Expressionskorrelation zwischen den beiden frisch gefrorenen Tumor-RNA und ihren spezifischen FFPERNA-Proben-Gegenstücken ermittelt. Die Diagramme zwischen passender frischgefrorener und FFPE-microRNA deuten darauf hin, dass die CDNA-Bibliotheksvorbereitung eine gute Reproduzierbarkeit bietet, da eine hohe Korrelation zwischen der nachgewiesenen microRNA in unterschiedlich verarbeiteten Proben besteht.

Um festzustellen, ob das optimierte Protokoll zur Vorbereitung der CNDA-Bibliothek mit zunehmend älteren FFPE-Proben anwendbar und reproduzierbar ist, wurden Mikro-RNA-Expressionsprofile aus FFPE-Geweben erstellt, die für 18, 20, 22, 27, 30 und 35 Jahre archiviert wurden. Der Korrelationskoeffizient blieb unabhängig vom Alter der Probe oder der Vorbereitungswoche der Bibliothek über 0,96. Daher bietet das optimierte CDNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll ein robustes Werkzeug für die reproduzierbare Analyse von FFPE-Proben, unabhängig von ihrer Archivierungszeit.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre kleinen RNA-Bibliotheken vorbereiten und ein vollständiges Mikroinexpressionsprofil all Ihrer wertvollen formalen und fixierten Paraffin-eingebetteten Proben erhalten.