Name: Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Lernen Sie die cDNA-Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung kleiner RNAs aus formalinfixierten, paraffineingebetteten Proben. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse von bis zu 18 archivierten Gewebeproben für Biomarkerforschung.

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Wir danken Dr. Thomas Tuschl, Leiter des Labors für Molekulare Biologie der RNA sowie Mitglieder von seinem Labor für ihre Unterstützung und für die gemeinsame Nutzung der Technologie entwickelt in seinem Labor und Zugriff auf die RNAworld-Pipeline. Wir danken auch Dr. Markus Hafner für sharing sein Protokoll und detaillierte Beschreibungen über alle biochemischen und enzymatische Schritte in seine ursprüngliche Verfahren verwendet.

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren Wünsche offen zu legen, dass eine Publikation enthält einige der Daten in dieser Handschrift von Loudig Et Al. International Journal of Molecular Sciences veröffentlicht wurde 21.

Ein hoch reproduzierbare und robuste cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll für NGS der kleinen RNAs in FFPE RNA-Proben archiviert wird in diesem Protokoll dargestellt, der eine modifizierte und optimierte Version des Verfahrens von Hafner Et Al. beschrieben ist 22
Alle Schritte dieses Protokolls wurden für den Einsatz mit älteren archiviert und kompromittierten Gesamt-RNS erholt aus FFPE-Proben optimiert. Der entscheidende Schritt dieses Protokolls für die Ver...

MiRNAs sind bemerkenswert gut in Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Exemplare1,2,3konserviert. Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass der Ausdruck dieser kurzen regulatorischen nichtcodierende einzelne gestrandeten RNA-Moleküle können erfolgreich mit Gesamt-RNS aus FFPE-Proben ausgewertet werden und liefern relevante Genexpressionsdaten im Vergleich zu den ursprünglichen frisch Gewebe4,5,6,7,8. Im Vergleich zu Großformat-Messenger-RNAs, die erwiesenermaßen FFPE Gewebe Verarbeitung (Formaldehyd, Hitze, Austrocknung, etc.), endogene RNases und das Alter der Proben, die geringe Größe der MiRNAs (~ 18 – 24 kritisch betroffen sein Nukleotide) wird angezeigt, damit sie resistent gegen Abbau und anfällig für langfristige Lagerung, auch durch MiRNA Ausdruck Studien, die Hochdurchsatz-mRNA Studien in archivierte Exemplare9übertreffen demonstriert. MiRNA Ausdruck Studien mit archivierten klinischen Proben, die vor allem in kleinen Analysen durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass einzelne oder Multiplex quantitative PCR-Assays, können verschiedene Arten von Microarray Technologien und zuletzt NGS verwendet werden, um den Ausdruck der erhaltenen MiRNAs nach der Optimierung von diesen Tests10,11,12,13,14bewerten.
Da die Dysregulation des MiRNA Ausdruck mit der Entwicklung einer Vielzahl von menschlichen Tumoren verbunden wurde und gibt es möglicherweise ein enormer Vorrat an klinisch Archivierte Exemplare kommentiert, klar geworden, dass diese kleine RNA Moleküle sind eine vielversprechende Quelle potentiellen Krebs Biomarker15,16,17,18. Die Verwendung einer Hochdurchsatz-Gen-Ausdruck-Technologie wie NGS hat den Vorteil, dass eine Gesamtbewertung aller MiRNA Transkripte im Vergleich zu gezielten Technologien wie PCR und/oder Microarrays19. Aus diesem Grund wurde eine optimierte, kostengünstige und leicht anwendbaren Protokoll für cDNA Bibliothek Vorbereitung der kleinen RNAs aus älteren Archivierte Exemplare auf NGS optimiert, um groß angelegte Retrospektive Studien20ermöglichen.
Wir zuvor etabliert eine gleichzeitige RNA/DNA Extraktion Protokoll für separate Wiederherstellung von RNA und DNA aus älteren Archivierte Exemplare, die wir gefunden, um zeitgenössischen kommerziellen Kits21übertreffen. Verwenden dieses Protokoll Extraktion, um total RNA aus FFPE Gewebe archiviert für längere Zeiten zu erhalten, haben wir optimiert die Vorbereitung der cDNA-Bibliotheken für NGS MiRNAs in klinischen Proben bis zu 35 Jahre lang aufzubewahren. Darüber hinaus in einer kürzlich veröffentlichten Studie, wo wir cDNA-Bibliotheken von klinisch klassifizierte duktalen Carcinoma in Situ (DCIS) Proben vorbereitet, identifizierten wir differentiell exprimierten MiRNAs, die durch quantitative PCR validiert wurden gekennzeichnet werden Veränderungen der spezifischen MiRNA nachweisbar bei DCIS Läsionen von Patienten, die an Brustkrebs im Vergleich zu DCIS Läsionen von Patienten, die nicht an Brustkrebs erkranken.
Betrachtet man die Kosten der kommerziellen Kits für die Zubereitung von kleinen RNA-cDNA-Bibliotheken, das Potenzial für ihre Einstellung, sowie die Verwendung von Copyright/patentrechtlich geschützte Reagenzien, die optimiert werden kann nicht, haben wir uns entschlossen ein zuvor veröffentlichten anpassen Labor-basierte und Kit-freie 3' Barcode cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll für NGS der kleinen RNAs archiviert in FFPE-Proben, Proben ermöglicht simultane Analyse von 1822. Dieses Protokoll bietet eine ideale und robuste schrittweise Prozedur mit optischen und technischen Bewertung Checkpoints, die entscheidend für die Anpassung an FFPE RNA-Proben waren, und hat ein starkes Potenzial für die Anwendung auf andere Quellen von gefährdeten oder schwer RNA-Material verwenden. Das ursprüngliche Protokoll Anwendbarkeit wurde verbessert, indem radioaktiv markierte Größe Marker mit Leuchtstofflampen (z. B.SYBR Gold) nachweisbar RNA-Größe-Markierungen, die bei der Auswahl der aufgespaltenen Bibliotheken auf große Polyacrylamid-Gel verwendet. Dieses optimierte Protokoll stützt sich auf die Unterbindung der Barcode Adapter 3' 18 einzelnen FFPE RNA-Exemplare, die sind dann gebündelt um 5' Adapter Ligatur zu unterziehen, Reverse Transkription und ein pilot PCR-Analyse für Verstärkung der endgültigen cDNA zugeschnitten Bibliothek vor großen PCR-Amplifikation, Reinigung und NGS auf einen hohen Durchsatz-Sequenzer.

<table><tbody><tr><td>1% Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM ATP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTPs</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>20 nt Leiter</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20mg/ml Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X Titan Taq</td><td>Clontech Laboratories</td><td>639208</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL Vertikales Gelelektrophoresesystem mit Glasplatten und Kämmen</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mikrozentrifuge 5424R</td><td>USA scientific</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppndorf Thermomixer</td><td>USA scientific</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; Silikonisierte Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger Retention 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Gel Breaker Tube 0,5 ml</td><td>IST Engineering Inc,3388-100</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Gelelektrophoresegerät 7 cm x 10 cm - Mini-Sub Cell GT mit Gelschalen und Kämmen</td><td>Biorad</td><td>1704446</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge Doppelrotor-Personenzentrifuge</td><td>USA</td><td>wissenschaftlich 2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Modell V16 Polyacrylamid-Gelelektrophorese Geräte, Gläser, Kämme und Abstandshalter</td><td>Ciore Life Science</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotide</td><td>IDT</td><td>Definiert während der Bestellung</td><td></td></tr><tr><td>Eule EasyCast B2 Mini-Elektrophoresesystem - mit Gelschalen und Kämmen</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsenzym PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>RNasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Blaulicht-Transilluminator</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III reverse Transkriptionskit</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2 Verkürzter K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Themocycler mit beheiztem Deckel</td><td>Angewandtes Biosystem</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7,5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sequagel System Konzentrat, Verdünnungsmittel und Puffer</td><td>National Diagnose</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

retrospektive rna sequenzierung: komplementäre dna bibliothek vorbereitung protokoll mit formalin fixierten paraffin-eingebetteten rna-proben

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

– Archiviert, klinisch klassifiziert Formalin fixierten bieten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe Nukleinsäuren Retrospektive Molekulare Studien der Krebsentstehung. Durch die Verwendung nicht-invasive oder Pre-maligner Läsionen von Patienten, die später invasive Erkrankungen entwickeln, helfe Genexpressionsanalysen frühe molekulare Veränderungen zu identifizieren, die für Krebsrisiko prädisponieren. Es wurde gut beschrieben, dass Nukleinsäuren FFPE Gewebe erholt unterzogen haben, schwere körperliche Schäden und chemischen Veränderungen, die ihre Analyse schwierig und erfordert in der Regel angepasst Assays. Micro-RNAs (MiRNAs), jedoch die repräsentieren eine kleine Klasse von RNA-Molekülen überspannt nur bis zu ~ 18 – 24 Nukleotide, haben gezeigt, dass langfristigen Lagerung standhalten und wurden erfolgreich in FFPE-Proben analysiert. Hier präsentieren wir Ihnen ein 3' Barcode komplementäre DNA (cDNA) Bibliothek Vorbereitung Protokoll speziell optimiert für die Analyse von kleinen RNAs extrahiert aus den archivierten Geweben, die kürzlich unter Beweis gestellt wurde, robust und hoch reproduzierbare wenn mit archiviert klinische Proben bis zu 35 Jahre lang aufbewahrt. Diese Bibliothek Vorbereitung ist gut geeignet für die Multiplex-Analyse von Material beeinträchtigt/beeinträchtigt, wo RNA-Proben (bis 18) mit einzelnen 3' Barcode Adapter ligiert und dann gebündelt für nachfolgende enzymatische und biochemischen Vorbereitungen vor der Analyse. Alle Reinigungen erfolgen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), die Größe-spezifische Auswahl und Bereicherungen des Barcodes kleine RNA-Spezies ermöglicht. Diese cDNA-Bibliothek-Vorbereitung ist gut angepasst an winzige RNA-Eingänge, wie eine pilot Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Bestimmung eines bestimmten Verstärkung-Zyklus zur optimale Mengen an Material für Next Generation Sequencing (NGS) produzieren erlaubt. Dieser Ansatz wurde optimiert für den Einsatz von degradierten FFPE-RNA aus Proben, die bis zu 35 Jahre archiviert und hoch reproduzierbare NGS-Daten bietet.

Wie in der Methode hier insgesamt 18 einzelnen FFPE RNA-Proben beschrieben (100 ng jeder) befinden sich in getrennten Röhren 3' Adenylated Barcode Oligonukleotid T4 Ligatur über Nacht zu unterziehen. Am nächsten Tag sind die enzymatischen Reaktionen Hitze deaktiviert, kombiniert und in einem einzigen Rohr ausgefällt. Die RNA-Pellet Nukleinsäuretablette und der aufgespaltenen RNA-Moleküle sind auf 15 % denaturierenden Polyacrylamid-Gel (Seite), wo RNA Oligonukleotid Größe Marker, die in be...

Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Proben stellen eine wertvolle Quelle der molekularen Biomarker der menschlichen Krankheiten. Hier präsentieren wir ein Labor-basierte cDNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll, zunächst mit frisch gefrorene RNA entworfen und optimiert für die Analyse von archivierten Mikrornas aus Geweben bis zu 35 Jahre gespeichert.

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Das übergeordnete Ziel dieser CDNA-Bibliotheksvorbereitung ist es, eine erfolgreiche Sequenzierung kleiner RNAs zu ermöglichen, die in formalen und fixierten Paraffin-eingebetteten Geweben gelagert wurden. Diese Methode ist sehr nützlich für die Analyse von formalen und fixierten, in Paraffin eingebetteten Proben. Sie extrahieren RNA aus bis zu 18 Proben, analysieren den Gehalt aller Proben und erhalten ein Profil der gesamten microRNase für alle Proben.Zu Beginn des Protokolls fügen Sie jeder der 18 einzeln aliquotierten FFPERNA-Proben 8,5 Mikroliter des zuvor vorbereiteten Ligations-Mastermixes hinzu. Schnippen Sie vorsichtig mit den Röhrchen und zentrifugieren Sie zwei Sekunden lang. Lagern Sie die Röhrchen nach dem Zentrifugieren auf Eis.Verwenden Sie eine Drei-Mikroliter-Pipette, um einen Mikroliter jedes Adapters auf die entsprechenden FFPERNA-Proben zu übertragen, die RNA und Ligations-Mastermix enthalten. Pipettieren Sie nicht auf und ab und wechseln Sie die Spitzen zwischen den FFPERNA-Proben. Schließen Sie jedes Röhrchen, schnippen Sie es zum Mischen und zentrifugieren Sie es zwei Sekunden lang.Lege die Röhren auf Eis. Denaturieren Sie die Reaktionen, indem Sie die Röhren

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir beschreiben eine zielgerichtete RNA-Sequenzierungsmethode, die die Vorbereitung indizierter cDNA-Bibliotheken, Hybridisierung und Erfassung mit benutzerdefinierten Sonden und Datenanalyse umfasst, um ausgewählte Transkripte auf Genexpression, Mutationen und Genfusionen zu untersuchen. Targeted RNAseq ermöglicht die kostengünstige und schnelle Auswertung ausgewählter Transkripte auf einem Desktop-Sequenzierer.

RNA-Sequenzierung Assay Gezieltes Genexpression und Genomic Änderungen an Charakterisieren

Dieses modifizierte Extraktionsprotokoll verbessert RNA und DNA-Ausbeuten von gezieltere Regionen von Interesse in histopathologischen Gewebeblöcke.

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Dieses Protokoll bietet einen Überblick über Verfahren zur Isolierung von RNA für die transkriptomischen Profilierung der Lymphknoten Gewebe von großen Tieren, einschließlich Schritte bei der Identifizierung und Entfernung der Lymphknoten von Vieh und Wildtiere, Probenahme Ansätze Konsistenz über mehrere Tiere, und Überlegungen sowie repräsentative Ergebnisse für die Post-Sammlung, Erhaltung und Verarbeitung für RNA-Analyse zu schaffen.

Erhebung und Verarbeitung von Lymphknoten von großen Tieren für RNA-Analyse: Vorbereitung auf Lymphknoten Transkriptomischen Studien der großen Tierarten

Dieses Protokoll bietet Forschern mit einem neuen Tool um die Treue der Transkription in mehrere Modellorganismen zu überwachen.

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Circular RNAs (circRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die eine Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen können. Nach Der Bewertung verschiedener Parameter für den Aufbau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken wurde ein Protokoll unter Verwendung der gestrandeten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitung mit RNase R-Vorbehandlung erstellt und hier vorgestellt.

Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

Wir präsentieren ein detailliertes reparaturbasiertes Analyseprotokoll für kleine RNA-Bibliotheken mit weniger Voreingenommenheit als Standardmethoden und einer erhöhten Empfindlichkeit für 2'-O-Methyl-RNAs. Dieses Protokoll kann mit hausgemachten Reagenzien befolgt werden, um Kosten zu sparen oder Kits für die Bequemlichkeit zu verwenden.

Verbesserung der kleinen RNA-Seq: Weniger Voreingenommenheit und bessere Detektion von 2'-O-Methyl RNAs

Therapieresistenz entwickelt sich oft bei Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs, und in einigen Fällen entwickelt sich Krebs zu einem tödlichen Subtyp namens neuroendokrine minale Prostatakrebs. Die Bewertung der kleinen nicht-kodierenden RNA-vermittelten molekularen Veränderungen, die diesen Übergang erleichtern, würde eine bessere Krankheitsschichtung und Identifizierung von kausalen Mechanismen ermöglichen, die zur Entwicklung von neuroendokrinem Prostatakrebs führen.

Sequenzierung kleiner nicht-kodierender RNA aus formalinfixierten Geweben und Serum-abgeleiteten Exosomen von kastrationsresistenten Prostatakrebspatienten

Wir beschreiben eine Technik zur Profilierung von microRNAs in frühen Mausembryonen. Dieses Protokoll überwindet die Herausforderung des niedrigen Zelleingangs und der kleinen RNA-Anreicherung. Dieser Assay kann verwendet werden, um Veränderungen in der miRNA-Expression im Laufe der Zeit in verschiedenen Zelllinien des frühen Mausembryons zu analysieren.

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von RNA aus definierten histologischen Regionen von paraformaldehydfixiertem, mit Optimal Cutting Temperatur eingebettetem Mauslebergewebe mittels Laser-Capture-Mikrodissektion, was eine gezielte nachgeschaltete Genexpressionsanalyse ermöglicht.

Laser-Capture-Mikrodissektion von paraformaldehydfixiertem Mauslebergewebe zur RNA-Analyse

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Lernen Sie die cDNA-Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung kleiner RNAs aus formalinfixierten, paraffineingebetteten Proben. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse von bis zu 18 archivierten Gewebeproben für Biomarkerforschung.

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben (Video) | JoVE Journal

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

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