Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening
5. September 2018
Über eine Vielzahl von Anzeichen der Krankheit werden mehr physiologisch relevanten Modelle entwickelt und implementiert in Drug Discovery-Programme. Das neue Modellsystem hier beschriebenen zeigt wie dreidimensionale Tumor Sphäroide kultiviert und in ein Hochdurchsatz-1536-Well-Platte-basiertes System zur Suche neuer Krebsmedikamente abgeschirmt werden können.
Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Wirkstoffforschung zu beantworten, z. B. was die relevanteste Gewebekultureinstellung für die Identifizierung von Treffern und Leitern ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Kultivierung von Zellen in drei Dimensionen mit hohem Durchsatz unter Verwendung von 1536-Well-Platten ermöglicht. Kalyani Gampa, ein leitender Wissenschaftler aus meinem Labor, wird dieses Protokoll vorführen.
Um eine 3D-Tumor-Sphäroidkultur einzurichten, lösen Sie die interessierenden Krebszelllinien mit drei Waschungen BBS ab. Gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter Trypsin pro fünf Zentimeter quadratierter Fläche des Kulturkolbens. Nach fünf Minuten neutralisieren Sie das Trypsin mit dem fünffachen Volumen des mit Serum versetzten Mediums in jedem Kolben und zählen Sie die Zellen.
Verwenden Sie eine sterilisierte, kleine Kassette aus Edelstahl mit einem peristaltischen pumpenbasierten System, um insgesamt 500 Zellen in acht Mikrolitern Sphäroidmedium in jede Vertiefung einer mit 1.536 Vertiefungen behandelten Gewebekulturplatte zu säen. Verwenden Sie dann einen atmungsaktiven Klebeplattenverschluss, um die Platte abzudecken. Und stellen Sie die Platte drei Tage lang in einen rotierenden Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 10 U/min mit 5 % Kohlendioxid und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit eingestellt ist.
Der wichtigste Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die Platten gut verschlossen sind, bevor sie in den Inkubator gelegt werden. Die Sphäroide brauchen drei Tage, um sich zu bilden, und dieser Schritt verhindert die Verdunstung des Mediums. Am Ende der Inkubation drehen Sie die mit Krebs ausgekleideten Kulturplatten schnell bei 100-facher Schwerkraft, um das Kondenswasser aufzufangen, und entfernen Sie die Klebedichtungen.
Legen Sie jede zu behandelnde Platte auf einen akustischen Spender, der so eingerichtet ist, dass insgesamt acht Nanoliter jeder Verbindung abgegeben werden. Verdünnung auf eine Endkonzentration von 0,1 % DMSO pro Vertiefung und eine Spitzendosis von 10 Mikromolaren. Wenn die Verbindung auf die entsprechenden Platten gegeben wurde, setzen Sie einen speziell angefertigten Zellkulturdeckel aus Edelstahl auf jede Platte, um eine Verdunstung zu verhindern, und stellen Sie die Platten für weitere fünf Tage in den rotierenden Inkubator zurück.
Am Ende der Inkubation geben Sie drei Mikroliter vorgewärmtes Zelllysereagenz, ergänzt mit Luciferin, in jede Vertiefung jeder Zellkulturplatte. Und inkubieren Sie die Platten mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur. Erfassen Sie dann die ATP-Lumineszenz auf einem Plattenluminometer.
Wenn alle Platten analysiert wurden, extrahieren Sie die Rohdaten aus dem Gerät und normalisieren Sie alle Felder, die die Testverbindungen enthalten, auf den Durchschnitt aller Wells, die nur DMSO als neutrale Kontrolle enthalten. Die prozentuale Wachstumshemmung jeder Verbindung kann dann gemäß der Formel berechnet werden, und Dosis-Wirkungs-Kurven und inhibitorische IC50s können erzeugt werden. Eine Vielzahl etablierter Krebszellen, von denen bekannt ist, dass sie unter 2D-Kulturbedingungen gut wachsen, bildeten trotz ihrer morphologischen Unterschiede auch 3D-Strukturen, wenn sie kultiviert wurden, wie gerade gezeigt.
Bei der Verwendung für groß angelegte Screenings kann eine unterschiedliche Empfindlichkeit von Verbindungen zwischen Kulturen, die in 2D gezüchtet wurden, und solchen, die in 3D gezüchtet wurden, beobachtet werden. Jeder Punkt stellt die inhibitorische Konzentration einer einzelnen Verbindung dar, für die in beiden Kulturen eine Zellabtötungsreaktion von 50 % beobachtet wird. In diesem repräsentativen Experiment waren beide getesteten RAF-Kinase-hemmenden Verbindungen unter 3D-Bedingungen in einer nicht-kleinzelligen Lungenkrebslinienkultur, die eine aktivierende Mutation im KRAS-Protein aufweist, wirksamer.
Die Verbindungen zeigen jedoch eine ähnliche Wirksamkeit sowohl in 3D-Sphäroid- als auch in 2D-Darmkrebs-Linienkulturen, die eine G13D-aktivierende Mutation in KRAS enthalten. Der 3D-Assay ermöglicht auch die Beobachtung des paradoxen Wachstumsaktivierungsphänomens, das auftritt, wenn es zu einer unvollständigen Hemmung von RAF-Dimeren in hochaktivierten RAF-Mutantenlinien kommt, wie das Zellwachstum bei niedrigen Konzentrationen des Wirkstoffs zeigt, das bei hohen Konzentrationen unterdrückt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Krebsmedikamentenforschung, um alternative Kulturbedingungen für die Identifizierung neuer, wirksamer chemischer Stoffe gegen bekannte Ziele zu erforschen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine neuartige Methode für die Arzneimittelforschung unter Verwendung dreidimensionaler Tumorsphäroide vor, die in einem Hochdurchsatz-1536-Loch-Plattensystem kultiviert werden. Dieser Ansatz zielt darauf ab, die Relevanz von Gewebekulturbedingungen bei der Identifizierung potenzieller Onkologie-Arzneimittel zu erhöhen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Onkologie
- Wirkstoffforschung
- Zellkultivierungstechniken
Hintergrund
- Traditionelle zweidimensionale Zellkulturen können die Tumormikroumgebung oft nicht nachahmen.
- Dreidimensionale Kulturen bieten ein physiologisch relevanteres Modell für die Untersuchung von Krebs.
- High-Throughput-Screening ist für eine effiziente Arzneimittelentwicklung unverzichtbar.
- Diese Studie konzentriert sich auf die Optimierung der Kultivierung von Tumorspheroiden.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Hochdurchsatzmethode zur Kultivierung von Tumorsphäroiden.
- Beurteilung der Relevanz dieses Modells für die Arzneimittelentwicklung.
- Unterstützung der Identifizierung neuer onkologischer Wirkstoffe.
Verwendete Methoden
- Loslösen von Krebszelllinien unter Verwendung von BBS-Waschungen.
- Verwenden von Trypsin zur Zellablösung und Neutralisierung mit serumhaltigem Medium.
- Kultivieren von Zellen im 1536-Well-Plattenformat.
- Screening potenzieller Wirkstoffkandidaten in Hochdurchsatzweise.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine effiziente Kultivierung von 3D-Tumorsphäroiden.
- Die Hochdurchsatzfähigkeit erlaubt eine schnelle Bildschirmprüfung von Wirkstoffkandidaten.
- Nachgewiesene Relevanz des 3D-Kulturmodells in der Wirkstoffforschung.
- Potenzial zur Verbesserung des Prozesses zur Identifizierung von Hits zu Leitstrukturen.
Schlussfolgerungen
- Diese 3D-Tumorsphäroid-Kulturmethode verbessert die Bemühungen um die Arzneimittelentdeckung.
- Sie bietet eine genauere Darstellung der Tumorbiologie.
- Der Ansatz kann zur Identifizierung neuartiger Onkologietherapien führen.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Diese Methode schließt die translationale Lücke in der onkologischen Wirkstoffforschung, indem sie ein Hochdurchsatz-Screening in einem physiologisch relevanten 3D-Tumorsphäroidmodell ermöglicht. Sie unterstützt eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Zielvalidierung, indem sie unterschiedliche Wirkstoffantworten zwischen 2D- und 3D-Kulturbedingungen aufzeigt. Der Ansatz verbessert die Identifizierung von Hits für die Leitstrukturfindung von Inhibitoren des MAPK-Signalwegs in genetisch definierten Krebsmodellen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in einem krankheitsrelevanten System, das dreidimensionale zelluläre Wechselwirkungen und räumliche Organisation erfasst.
- Operationaler Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch den Vergleich der Wirkstoffeffizienz in zweidimensionalen und dreidimensionalen Kulturen, um kontextabhängige Aktivität zu identifizieren.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Identifizierung von Leitstrukturen, indem differenzielle Empfindlichkeit in 3D-Kulturen von Modellen des KRAS-mutierten nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms nachgewiesen wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein standardisiertes, reproduzierbares 3D-Kultursystem, das mit 1536-Well-Formaten für Hochdurchsatz-Substanzscreenings kompatibel ist.
- Operationaler Wert: Ermöglicht quantitative lumineszenzbasierte ATP-Nachweise zur Messung des Wachstumshemmungsgrades sowie zur Erstellung von Dosis-Wirkungs-Kurven und IC50-Werten.
- Assay-Eignung: Verwendet akustisches Dosieren für die präzise Abgabe von Nanoliter-Mengen an Verbindungen und eine versiegelte Inkubation zur Vermeidung von Verdunstung, um die Integrität des Assays sicherzustellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Arbeitsabläufe, indem tumorassoziierte Stroma-Interaktionen und extrazelluläre Matrix-ähnliche Bedingungen in einem skalierbaren Format modelliert werden.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Beobachtung paradoxer Wachstumsaktivierung bei RAF-Dimer-Mutationen, was Kombinationstherapie-Strategien unterstützt und klinische Kandidaten entrisikot.
- Biomarker-Korrelation: Ermöglicht die Bewertung von wegweisspezifischen Inhibitoren (z. B. MAPK) in genetisch definierten Hintergründen, um Genotyp mit Wirkstoffantwort zu korrelieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung und ermöglicht eine frühe Beurteilung der Wirkstoffwirksamkeit in einem physiologisch relevanteren Kontext, bevor präklinische Investitionen getätigt werden.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem aufgezeigt wird, wie sich die Arzneimittelempfindlichkeit in onkogen-getriebenen Modellen wie KRAS-mutierten NSCLC durch 3D-Kultur verändert.
- Screening: Gewährleistet Bereitschaft und Reproduzierbarkeit des Assays durch standardisierte Sphäroidbildung in 1536-Loch-Platten mithilfe kontrollierter Inkubations- und Versiegelungsprotokolle.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Messung abhängiger Variablen durch Normalisierung der ATP-Lumineszenz auf DMSO-Kontrollen, was die Berechnung von IC50-Werten und vergleichende Potenzanalysen erleichtert.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem räumliche Tumorarchitektur und klonale Wechselwirkungen modelliert werden, die in 2D-Systemen fehlen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zum Screening verschiedener Krebszelllinien und Verbindungsbibliotheken, die auf konservierte Signalwege wie MAPK abzielen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Uneindeutigkeiten durch direkten Vergleich von 2D- und 3D-Wirkstoffantworten reduziert werden.
- Operativer Wert: Bietet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch roboterkompatible Arbeitsabläufe in 1536-Loch-Platten und abgedichtete Inkubation.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung, indem Verbindungen mit kontextspezifischer Wirkung identifiziert werden, wodurch biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Leitverbindungen basierend auf differenzieller Wirksamkeit in physiologisch relevanten Modellen.
Durchlegungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in 3D-Zellkultivierungstechniken, einschließlich Trypsinneutralisation, Zellzählung und steriler Plattenbeschickung.
- Benötigt Instrumente wie peristaltische Pumpen mit Kassetten-Systemen, akustische Dosiergeräte, rotierende Inkubatoren und Platten-Luminometer.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg voraus, insbesondere bei Versiegelungsprotokollen, Inkubationsparametern (37 °C, 10 U/min, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit) und Daten-Normalisierungsverfahren.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Krebszelllinien, da die Effizienz der Sphäroidbildung trotz erfolgreicher Bildung in etablierten Linien variieren kann.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie den erforderlichen Verdunstungsschutz während längerer Inkubationen sowie die Optimierung der Substanzdosierung in Nanoliter-Volumina.
