Name: Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Kultivierung dreidimensionaler Tumorsphäroide in 1536-Well-Platten für die Arzneimittelforschung. Diese Methode ermöglicht physiologisch relevante Screening-Modelle zur Identifizierung neuer Onkologie-Therapien.

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Die Autoren möchten Marc Ferrer am National Center für translationale Wissenschaften voran, National Institutes of Health für seine Unterstützung und Führung auf die Erstentwicklung von diesen Tests zu bestätigen. Darüber hinaus möchten wir Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff Michael Acker, Jacob Haling und Vesselina Cooke für ihre wissenschaftliche Beiträge und Diskussion als Teammitglieder Projekt danken.

(1) Kultivierung von 1536-Well 3D Tumor Sphäroide
<ol><li>Bereiten Sie einen frischen 3D Tumor Sphäroid mittlerer Stiel (Zelle Medium + ko-Serum Ersatz + Insulin-Transferrin-Selen) indem Sie die folgenden Reagenzien zu 500 mL Dulbeccos geändert Eagles Medium (DMEM/F12): 1 X Penicillin/Streptomycin, 10 ng/mL des menschlichen grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), 20 ng/mL des menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 0,4 % Rinderserumalbumin (BSA) (Teil V), 1 x Insulin-Transferrin-Selen und 1 % Knockout (KO) Serum Ersatz (nicht Frost-Tau-wechseln).</li>
	<li>Sterilisieren Sie Filter-das gesamte Medium mit den Ergänzungen durch ein 0,4 µm-Flaschenverschluss Filter-System.</li>
	<li>Lösen Sie die Krebs-Zelllinien, die nach empfohlenen Routine Kulturbedingungen, aus den traditionellen Zellkultur Kolben durch Waschen sie gewachsen sind 3 X mit 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und einen angemessenen Betrag von 0,25 % Trypsin (1 mL hinzufügen pro 5 cm2) für 5 min, eine dünne Schicht über die Zellen zu erstellen. Neutralisieren Sie die Trypsin mit 5 x die Menge des Mediums, enthält das Serum zu und fahren Sie mit der Zellen zählen. Z. B. 25 mL Medium für 5 mL Trypsin.</li>
	<li>Passen Sie die Konzentration der Zelle zu 62,5 x 104 Zellen/mL Lösung um insgesamt 500 Zellen pro Bohrloch in 8 µL Sphäroid Medium in der 1536-Well-Platten Gewebe-Kultur-behandelten Samen.</li>
	<li>Samen Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank die Zellen mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette mit einer peristaltischen Pumpe-basierendes System. Zwischen verschiedenen Zelllinien, spülen Sie den Schlauch von der Kassette mit 1 x PBS und 70 % Ethanol für 10 s.</li>
	<li>Alternativ, Samen der Zellen unter Verwendung eines liquiden Handlers befindet sich innerhalb eines HEPA-Filtern Raumes mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette und einer peristaltischen Pumpe oder eine angehängte Spritzenpumpe, abhängig von der Anzahl der Platten pro Zelle Zeile benötigt.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Platten mit einer atmungsaktiven Haftplatte Dichtung entweder manuell oder mit Platte Siegler.</li>
	<li>Legen Sie die Platten in einem drehenden Inkubator gesetzt bei 10 min und 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2) und 95 % Relative Luftfeuchtigkeit. Lassen Sie die Sphäroide Formular für 3-d.</li>
</ol>2. Kultivierung von 1536-Well 2D Krebs Linien
Hinweis: Die 1536-Well-2D Krebs-Linien sollten 24 h vor der Zugabe der Verbindung zu den 3D Platten kultiviert werden.
<ol><li>2D Krebs Zelle Medium vorzubereiten, indem Sie die folgenden Reagenzien zu 500 mL einer geeigneten Wachstumsmedium für die ausgewählten Positionen: 1 x Penicillin/Streptomycin und 10 % fetalen bovine Serum (FBS).</li>
	<li>Sterilisieren Sie Filter-das gesamte Medium mit den Ergänzungen durch ein 0,4 µm-Flaschenverschluss Filter-System.</li>
	<li>Lösen Sie die Krebs-Zelllinien, die nach empfohlenen Routine Kulturbedingungen, aus den traditionellen Zellkultur Kolben durch Waschen sie gewachsen sind 3 X mit 1 x PBS und einen angemessenen Betrag von 0,25 % Trypsin (1 mL pro 5 cm2) für 5 min zum Hinzufügen Erstellen Sie eine dünne Schicht über die Zellen. Neutralisieren Sie die Trypsin mit 5 x die Menge des Mediums, enthält das Serum zu und fahren Sie mit der Zellen zählen. Z. B. 25 mL Medium für 5 mL Trypsin.</li>
	<li>Passen Sie die Konzentration der Zelle zu 62,5 x 104 Zellen/mL Lösung um insgesamt 500 Zellen pro Bohrloch in 8 µL kompletten Medium in Gewebe-Kultur-behandelten 1536-Well-Platten Samen.</li>
	<li>Samen Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank die Zellen mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette mit einer peristaltischen Pumpe-basierendes System. Zwischen den verschiedenen Zelllinien, spülen Sie den Schlauch von der Kassette mit 1 x sterile PBS und 70 % Ethanol für 10 s.</li>
	<li>Alternativ, Samen der Zellen unter Verwendung eines flüssigen Handlers befindet sich in einem HEPA-Filtern Robotik-Raum mit einer sterilisierten, kleine Edelstahl-Stahl-Kreissägeblätter Kassette und einer peristaltischen Pumpe oder die angehängte Spritzenpumpe, abhängig vom Umfang der Platten pro Zelle Zeile benötigt.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Platten mit einer atmungsaktiven Haftplatte Dichtung entweder manuell oder mit Platte Siegler.</li>
	<li>Legen Sie die Platten in einem drehenden Inkubator auf 10 u/min und 37 ° C für 24 h vor dem zusammengesetzten Zusatz, mit 5 % CO2 % bis 95 % Relative Luftfeuchtigkeit eingestellt.</li>
</ol>(3) zusammengesetzte Zusatz
<ol><li>Bereiten Sie 8-Punkt, 3-fach serielle Verdünnungen von MAPK Inhibitoren in 100 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) sich auf ein Liquid-Handling-Roboter mit einer 10 mM höchste Konzentration. Die Proteasom-Inhibitor Bortezomib dient als Positivkontrolle für eine komplette Zelle töten, um den dynamischen Bereich des Tests zu bestimmen.</li>
	<li>Quick-Spin All assay und zusammengesetzte Platten 100 X g Kondenswasser sammeln. Entfernen Sie die selbstklebende Dichtung aus jeder Platte und legen Sie einen Teller auf ein akustisches Dispenser Setup Hinzufügen von insgesamt 8 nL von jeder Verbindung/Verdünnung repräsentieren eine Endkonzentration von 0,1 % DMSO pro Bohrloch und eine Top Verbindung Dosis von 10 µM.</li>
	<li>Nach der Zugabe der Verbindung abgeschlossen ist, Deckel nach Maß, Edelstahl-Zelle Kultur verhindert Verdunstung auf dem Teller und legen Sie die Platte in eine Spinnerei Inkubator bei 37 ° C für 5 d, mit 5 % CO2 % bis 95 % Relative Luftfeuchtigkeit.</li>
</ol>4. Erkennung Reagens Hinzufügung und der Erwerb von Raw-Daten
<ol><li>Wärmen Sie eine angemessene Lautstärke eine Zelle-Lyse-Reagenz mit Luciferin um Änderungen in Adenin Adenosintriphosphat (ATP) und damit auch Änderungen in der Zellproliferation bei Raumtemperatur oder in einem 37 ° C Wasserbad zu erkennen vor. Fügen Sie insgesamt 3 µL des Reagenz Erkennung in jede Vertiefung mittels einer peristaltischen Pumpe und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für mindestens 15 min.</li>
	<li>Erfassen Sie die Lumineszenz auf einer Platte Luminometer.</li>
</ol>5. Datenverarbeitung
<ol><li>Die raw-Daten aus dem Gerät zu extrahieren und alle Felder mit Testverbindungen auf den Durchschnitt aller Brunnen mit DMSO als neutrale Kontrolle allein zu normalisieren. Berechnen Sie aus diesem Wert die prozentuale Wachstumshemmung von jeder Verbindung. Dies erfolgt über die Formel Funktion in Microsoft Excel wo f (X) = {(probieren Sie relative leichte Werteinheiten (RLUs) / (Mittelwert DMSO RLUs) * 100)}.</li>
	<li>Generieren Sie die Dosis-Wirkungs-Kurven und hemmenden IC50s durch grafische Darstellung der Werte der normalisierten Daten aus Schritt 5.1 gegen die compoundkonzentration mit einem Grafik-Programm. Hinweis: Wir analysieren die Daten mithilfe von Helios, eine interne NIBR-Software-Werkzeug. Um diese Funktion zu vervollständigen, haben wir das Analysewerkzeug Nichtparametrische Kurve ausgewählt.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).</li>
<li>Li, L., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+3D+Culture+System+to+Study+the+Interaction+between+Epithelial+Breast+Cancer+and+Its+Surrounding+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts.</a> Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+pharmacological+profiling+of+3D+tumor+models+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells.</a> Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).</li>
<li>Polo, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786(2010).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registered+report%3A+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976(2016).</li>
<li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267(2010).</li>
<li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren sind Mitarbeiter von Novartis, und einige Mitarbeiter sind auch Aktionäre.

Die hier vorgestellten Methoden zeigen ein detailliertes Protokoll wie Tumor Sphäroide in 1536-Well-Platten für groß angelegte Verbindung Vorführungen zu produzieren. Diese Methoden wurden zunächst von der Arbeit am National Cancer Institute wo Tumor Sphäroide in niedrigen Durchsatz Assays in 6-Well und 96-Well Platten Fragen zu genetischen Abhängigkeiten und zusammengesetzte Empfindlichkeit13, angebaut wurden angepasst 14 , 15....

In den letzten zehn Jahren haben immer mehr Studien die Verwendung von 3D zellmodelle Kultur, Konzepte zu verstehen, die nicht vollständig zusammengefaßt sind, durch den Anbau von Zellen in 2D auf Kunststoff umgesetzt. Beispiele für diese Konzepte sind der Wechsel in normalen Epithelzelle Polarität1 wo die räumliche Orientierung der apikale und basale Schichten von Zellen sind verloren, als auch die Rolle der extrazellulären Matrix bei der Regulierung der Überlebens- und Zelle Schicksal. Onkologie-Forschung hat insbesondere 3D-Modelle verwendet, um die grundlegende Biologie von Krebszellen und die Unterschiede zwischen 2D und 3D Zelle Kultur Systeme3,4zu verstehen. Die Entwicklung der anspruchsvollere Zelle Kulturtechniken und ihre weitere Anpassung an Multi-gut Formate hat die Suche nach neuen Medikamenten in 3D Einstellungen ermöglicht. Im Gegensatz zu Zellen 2D Bedingungen, 3D-Modelle von Tumoren Palette in ihrer Komplexität von zellulären Schichtsysteme5 Single-Cell-Typ Kugeln in verschiedenen Größen, angebaut auf komplexe multi-Zell-Typ Kugeln6,7, 8. die Entdeckung von neuartigen Verbindungen oder Biologics, die potent Zelltod in diesen Systemen 3D-Modell induzieren ist daher von großem Interesse in Drogen-Entwicklung-Kampagnen. Endpunkte dieser Assays sind oft identisch mit denen in 2D Kulturen, Änderungen in der Zellproliferation beurteilen durchgeführt, sondern in einer mehr physiologisch relevanten Umgebung durchgeführt, können sie das wahre Niveau der Abhängigkeit des Zielgens oder Weg zu offenbaren verhört.
Da oben eingeführt, wurde eine Vielzahl von Modellsystemen entwickelt, um die Droge Reaktionen in 3D Culture Systeme zu studieren, aber die meisten verwenden entweder 96 oder 384-Well Mikrotiterplatten und sind nicht leicht anpassbar an häufig verwendeten im Hochdurchsatz-screening (HTS) Formate Drogen-Entdeckung-Screening-Kampagnen. Solche Systeme umfassen die Verwendung von hängenden Tropfen Technologien, Sphäroid Kulturen, pulsierende Zellen mit magnetischen Partikeln induzieren Levitation und Kulturen unter Einbeziehung natürlicher oder synthetischer Gele wie Kollagen, Matrigel oder Polyethylenglykol (PEG)2 . Hier präsentieren wir Ihnen die detaillierte Methoden einer zuvor entwickelten Technik, 3D Sphäroid Kulturen von etablierten Zelllinien in einem Format von 1536-Well-Platte zu produzieren. In diesem Protokoll wird ein hoch definierte Medium die verhindert, die Befestigung der normalerweise adhärente Zellen Linien9 dassverwendet. Dieses System hat Grenzen (d. h., es kann nicht vollständig rekapitulieren, ein komplexes Modellsystem von Krebs), aber dennoch, diese Tests ermöglichen eine Hochdurchsatz-Screening von großen Sammlungen von kleinen Molekülen und quer Vergleiche der Medikamente zwischen 2D und 3D Kulturen gegen eine Vielzahl von Zell-Linien und Verbindungen.
Die Zell-Linien ausgewählt, um den Methoden in diesem Artikel zeigen alle Hafen Mutationen in Genen, die im Zusammenhang mit der MAPK Signalweg, einen Pfad hoch Dysregulated bei Krebs ist und für welche viele Therapeutika stehen zur Verfügung. Viele der Linien verfügen über Aktivierung von Onkogenen Mutationen in der Kirsten Ratte Sarkom-Virus auch genannt KRAS, Neuroblastom RAS oder NRB Harvey Ratte Sarkom Virus Onkogen oder HRAS und der damit verbundenen Kinasen rasant beschleunigt Fibrosarcomas, auch bekannt als RAFs. Neuere Literatur legt nahe, dass die Inhibitoren der verschiedenen Knoten dieses Pfades eindeutig wirksamer in eine Teilmenge der Zell-Linien beim Anbau unter 3D Bedingungen9,10 sind. Eine Studie hat herausgefunden, dass wenn Krebszellen mit aktiven RAS in 3D gezüchtet wurden, sie eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber MAPK-Inhibitoren zeigten, und ferner, dass dieser Ansatz konnte Wege identifizieren und gezielt Inhibitoren, die in der traditionellen 2D verpasst Einstellung. Das Ziel dieser Studie ist es, die Methoden verwendet, um diese Zelllinien Kultur zu präsentieren, und weiter, um das Differential zu demonstrieren Reaktionen auf diese Inhibitoren, die Sie beachten können, nur bei Verwendung von 3D zellsystemen Kultur.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>Als fertige Lösung gekauft. Es wurde festgestellt, dass dieses Rezept im Vergleich zu anderen Anbietern bevorzugt wird.</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>Als vorbereitete Lösung gekauft.</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Lonza</td><td>12-115Q</td><td>Gekauft als vorbereitete Lösung.</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>Gekauft als fertige Lösung.</td></tr><tr><td>1x 0,25% Trypsin mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Als zubereitete Lösung gekauft.</td></tr><tr><td>1x Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Gekauft als Fertiglösung.</td></tr><tr><td>10 ng/ml humaner basischer Fibrobast-Wachstumsfaktor (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>In sterilem Wasser resuspendieren.</td></tr><tr><td>20 ng/ml humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Resuspendieren in sterilem Wasser.</td></tr><tr><td>0,4 % Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td>Resuspendiert in sterilem PBS und Filter.</td></tr><tr><td>1x Insulintransferrin Selen (ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>1% KnockOut (KO) Serum Ersatz</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td> Direkt <td>vor Gebrauch frisch zugeben.</td></tr><tr><td>100% Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>Gekauft als fertige Lösung.</td></tr><tr><td>Verbrauchsmaterialien</td>Small Kombikassette ThermoFisher 24073295 kleine Multiflow-Kassette <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>sterile TC-Platten mit 1536 Well (weiß)</td><td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>sterile TC-Platten mit 1536 Well (schwarz)</td><td>Corning</td><td>3893</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Scivax Platten <td></td></tr><tr><td></td><td>MBL International</td><td>NCP-LH384-10</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesives Dichtungen</td><td>ThermoFisher</td><td>AB0718</td><td></td></tr><tr><td>Spinning-Inkubator</td><td>LiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edelstahldeckel</td><td>The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATS Akustischer Dispensator</td><td>EDS Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo Acoustic Dispensor</td><td>Labcyte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe - Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher</td> Liquid Handler <td></td><td></td></tr><tr><td>- Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation von hochdurchsatz-dreidimensionale tumor sphäroide für drogen-screening

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Krebszellen haben routinemäßig zweidimensional (2D) auf einer Kunststoffoberfläche kultiviert worden. Diese Technik, allerdings fehlt die echte Umgebung eines Tumors Masse in Vivoausgesetzt ist. Solide Tumoren wachsen nicht wie ein Blatt aus Kunststoff befestigt, sondern vielmehr als eine Sammlung von klonalen Zellen in eine dreidimensionale (3D) Platz Interaktion mit ihren Nachbarn und mit verschiedenen räumlichen Eigenschaften, wie z. B. die Unterbrechung des normalen zellulären Polarität. Diese Wechselwirkungen verursachen 3D-kultivierte Zellen, morphologische und zelluläre Eigenschaften zu erwerben, die für in Vivo Tumoren relevant ist. Darüber hinaus ein Tumor Masse steht in direktem Kontakt mit anderen Zelltypen wie Stromazellen und immun-Zellen sowie die extrazelluläre Matrix aus anderen Zelltypen. Die Matrix hinterlegt besteht aus Makromolekülen wie Kollagen und Fibronektin.
In einem Versuch, die Übersetzung von Forschungsergebnissen in der Onkologie von Bank zu Bett zu erhöhen haben viele Gruppen begonnen, die Verwendung von 3D Modellsysteme in ihre Droge Entwicklungsstrategien zu untersuchen. Diese Systeme werden gedacht, um mehr physiologisch relevant sein, weil sie versuchen, die komplexe und heterogene Umgebung eines Tumors zu rekapitulieren. Diese Systeme können jedoch sehr komplex sein, und zwar offen für Wachstum in 96-Well-Formate, und einige jetzt auch in 384, sie bieten nur wenige Möglichkeiten für groß angelegte Wachstum und Screening. Dies beobachtete Lücke führte zu die Entwicklung von Methoden, die hier im Detail zu Kultur Tumor Sphäroide in einer Hochdurchsatz-Kapazität im Jahre 1536-Well Platten beschrieben. Diese Methoden stellen einen Kompromiss um die hochkomplexen Matrix-basierte Systeme, die schwer zu Bildschirm und herkömmlichen 2D Assays sind. Eine Vielzahl von Krebszelllinien beherbergen verschiedene genetische Mutationen werden erfolgreich gezeigt, zusammengesetzte Wirksamkeit von kuratierten Bibliotheksbenützung Verbindungen gezielt die Mitogen-Activated Protein Kinase oder MAPK Weg zu untersuchen. Sphäroid Kultur Antworten sind dann im Vergleich zu der Reaktion der Zellen gezüchtet in 2D, und unterschiedliche Aktivitäten berichtet. Diese Methoden bieten ein einzigartiges Protokoll für zusammengesetzte Aktivität in einer Hochdurchsatz-3D-Umgebung testen.

Eine Vielzahl von etablierten Krebszelle, die Linien bekannt, auch unter 2D Kulturbedingungen wachsen mit den beschriebenen Methoden hier getestet wurden. Repräsentative Bilder aus einer Vielzahl von MAPK mutierten Krebs Zell-Linien (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS und KNS-62:HRAS) sind in Abbildung 1zu sehen. Diese Bilder zeigen, dass zwar die Zelllinien verschiedenen Morphologien, jeweils 3D-Strukturen in den Assay 1536-Well-Platten gebildet. <s...

Über eine Vielzahl von Anzeichen der Krankheit werden mehr physiologisch relevanten Modelle entwickelt und implementiert in Drug Discovery-Programme. Das neue Modellsystem hier beschriebenen zeigt wie dreidimensionale Tumor Sphäroide kultiviert und in ein Hochdurchsatz-1536-Well-Platte-basiertes System zur Suche neuer Krebsmedikamente abgeschirmt werden können.

Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Wirkstoffforschung zu beantworten, z. B. was die relevanteste Gewebekultureinstellung für die Identifizierung von Treffern und Leitern ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Kultivierung von Zellen in drei Dimensionen mit hohem Durchsatz unter Verwendung von 1536-Well-Platten ermöglicht. Kalyani Gampa, ein leitender Wissenschaftler aus meinem Labor, wird dieses Protokoll vorführen.Um eine 3D-Tumor-Sphäroidkultur einzurichten, lösen Sie die interessierenden Krebszelllinien mit drei Waschungen BBS ab. Gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter Trypsin pro fünf Zentimeter quadratierter Fläche des Kulturkolbens. Nach fünf Minuten neutralisieren Sie das Trypsin mit dem fünffachen Volumen des mit Serum versetzten Mediums in jedem Kolben und zählen Sie die Zellen.Verwenden Sie eine sterilisierte, kleine Kassette aus Edelstahl mit einem peristaltischen pumpenbasierten System, um insgesamt 500 Zellen in acht Mikrolitern Sphäroidmedium in jede Vertiefung einer mit 1.536 Vertiefungen behandelten Gewebekulturplatte zu säen. Verwenden Sie dann einen atmungsaktiven Klebeplattenverschluss, um die Platte a

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Wir führen ein Protokoll für die Erzeugung einer großen Anzahl (Tausende bis Hunderttausende) von einheitlicher Größe und Zusammensetzung gesteuerten Tumorsphäroide mit handelsüblichen Mikrotiterplatten.

Die Produktion der großen Zahlen von Größe gesteuerte Tumorsphäroide Mit Microwell Platten

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Ein Protokoll für den robotergestützten Druck von Krebszell-Sphäroiden in einem 96-Well-Plattenformat mit hohem Durchsatz unter Verwendung eines wässrigen Zweiphasensystems wird vorgestellt.

Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing

Von Patienten stammende Xenotransplantate von Glioblastoma multiforme können mit Hilfe eines humanen 3D-Biogel-Kultursystems in lebende Mikrotumoren miniaturisiert werden. Dieser in vivo-ähnliche 3D-Tumorassay eignet sich für Drug-Response-Tests und molekulares Profiling, einschließlich kinomischer Analysen.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

Optische Kohärenztomografie (OCT), eine dreidimensionale imaging-Technologie, wurde verwendet, um zu überwachen und zu charakterisieren, die Wachstum Kinetik der vielzelligen Tumor Sphäroide. Präzise volumetrische Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie abgestorbenes Gewebe-Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung dagegen wurden demonstriert.

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Sphäroiden und nachgelagerte Analysen, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zytotoxizitätstests, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung, um Potenzial der Kandidaten als antineoplastische Therapeutika. Dieses Protokoll unterstützt Präzisionsmedizin mit der Identifizierung spezifischer Medikamente für jeden Patienten und das Krankheitsstadium.

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

Eine robuste Methode für die großtechnische Produktion von Sphäroiden für High-Content-Screening- und Analyseanwendungen

Tumorsphäroide werden zunehmend zur Beurteilung von Tumorzell-Mikroumgebung-Interaktionen und Therapiereaktionen eingesetzt. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine robuste, aber einfache Methode zur Semi-Hochdurchsatz-Bildgebung von 3D-Tumorsphäroiden mittels schneller optischer Clearing.

Rapid Optical Clearing für die Semi-Hochdurchsatzanalyse von Tumorsphäroiden

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen und die Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten unter Verwendung von Zellviabilitätsassays und mikroskopischen Untersuchungen.

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Dieser Artikel demonstriert eine standardisierte Methode zur Konstruktion dreidimensionaler Tumorsphäroide. Eine Strategie zur Sphäroidbeobachtung und bildbasierten Deep-Learning-Analyse unter Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystems wird ebenfalls beschrieben.

Generierung von 3D-Tumorsphäroiden für Wirkstoffevaluierungsstudien

Hier etablieren wir eine metabolische Profiling-Plattform, die dreidimensionale (3D) Gliom-Sphäroide und bildgebende Normalisierung mittels extrazellulärer Flussanalyse integriert. Dieser Ansatz ermöglicht eine genauere Bewertung der metabolischen Reaktionen von Tumoren auf medikamentöse Behandlungen und gibt Einblicke in mögliche Resistenzmechanismen.

Fortschritte bei der metabolischen Profilerstellung von dreidimensionalen Hirntumor-Sphäroiden für das Wirkstoffscreening

Erfahren Sie die Hochdurchsatz-Kultivierung dreidimensionaler Tumorsphäroide in 1536-Well-Platten für die Arzneimittelforschung. Diese Methode ermöglicht physiologisch relevante Screening-Modelle zur Identifizierung neuer Onkologie-Therapien.

Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

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