Name: CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie CARIP-Seq und ChIP-Seq zur Kartierung chromatin-assoziierter RNAs und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonalen Stammzellen eingesetzt werden. Diese Methoden ermöglichen epigenomische Studien.

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Diese Arbeit wurde von Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, ein Stipendium des National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) an B.L.K. vergeben unterstützt. Diese Arbeit genutzt, die Wayne State Universität High Performance Computing Grid für computational Ressourcen (< Https://www.grid.wayne.edu/>). Wir danken für die Unterstützung bei CARIP-Seq Datenanalyse Jiji Kurup.
AUTOREN-BEITRÄGE:
B.L.K. der CARIP-Seq-Methode konzipiert, entworfen und ChIP-Seq und CARIP-Seq Experimente durchgeführt die Sequenzierungsdaten analysiert und erarbeitet das Manuskript. Alle Autoren haben gelesen und genehmigt die Endfassung des Manuskripts.

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32(2014).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
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<li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

ChIP-Seq ist eine nützliche Methode, die Lage des globalen Protein-DNA-Wechselwirkungen zu bewerten (zB., Transkription Faktoren/Histon-modifizierende Enzyme/Histon Änderungen und DNA) in ES-Zellen, während der neu entwickelte CARIP-Seq-Protokoll nützlich ist abfragenden genomweite RNAs mit Chromatin Bestandteile. ChIP-Seq ist ein grundlegendes Instrument, das verwendet wird, um epigenetische Landschaften von ES-Zellen und andere Zelltypen zu bewerten. Die Qualität der ChIP-Seq und CARIP-Seq-Bibliotheken ist wei...

Kommunikation zwischen extrazelluläre Signale und eine Reihe von transkriptionelle-Aufsichtsbehörden, einschließlich der Histon-Modifikatoren und Post-Übersetzung Änderung der Histone Tails sind embryonale Stammzellen (ES) Zelle Schicksal Entscheidungen geregelt. Diese Interaktionen Erleichterung Chromatin Zugänglichkeit und Verpacken von Chromatin in einen von zwei Zuständen: Euchromatin, das offen und transcriptionally aktiv ist, und Heterochromatin, das kompakt und in der Regel transcriptionally inaktiv ist. Transkriptionsfaktoren mit DNA-Sequenz-spezifische verbindliche Affinitäten und epigenetische Modifikatoren Associate bei euchromatisch Regionen zur Teilnahme bei der Kontrolle der Genexpression. Next Generation Sequencing-Methoden, einschließlich der ChIP-Seq1, haben bei der Kartierung genomweite transcriptional Netze, die grundlegend für ES Zelle Selbsterneuerung und Pluripotenz2,3,4 sind maßgeblich ,5,6. Darüber hinaus während der RNA Immunopreciation gefolgt von der nächsten Generation Sequenzierung (RIP-Seq)7 Bewertungen von RNA-Protein-Wechselwirkungen legen nahe, dass DNA-bindende Proteine RNAs interagieren regulieren transkriptionelle Ereignisse7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, haben nur wenige Studien untersucht die genomweite Lokalisierung von RNAs Chromatin12oder globale Wechselwirkungen zwischen RNA und Histon Änderungen zugeordnet. Lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs) sind eine Klasse von RNAs, die gefunden wurden, um die Tätigkeit von Chromatin-assoziierte Proteine13,14,15Regeln. Xist ist beispielsweise eine LncRNA, die im weiblichen Säugerzellen, Inaktivierung eines x-Chromosoms durch die Rekrutierung von epigenetischen Repressoren16,17regelt. Das gesamte Spektrum der RNAs zugeordnete Chromatin ist jedoch weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll, Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq), Chromatin-assoziierten RNAs auf einer genomweiten Basis in ES-Zellen, einschließlich Bibliothek Vorbereitung zu identifizieren für Next Generation Sequencing und ChIP-Seq globale Belegung von Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren zuordnen. Im Gegensatz zu anderen RIP-Seq Methoden7enthält CARIP-Seq Vernetzung und Beschallung Schritte, die für die direkte Identifizierung von RNAs Chromatin zugeordnet zu ermöglichen. Gemeinsam ChIP-Seq ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genomweiten Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren, während CARIP-Seq ist eine leistungsfähige Methode zur Übersicht RNAs mit Chromatin Komponenten verbunden.

<table><tbody><tr><td>Maus-Leukämie-Hemmfaktor (ESGRO LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 oder 107 Einheiten</td></tr><tr><td>GSK3&betaInhibitor CHIR99021 (GSK3i)</td><td>Stemgent</td><td></td><td>Lösungsmittel: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>MEK-Inhibitor PD0325901 (MEKi)</td><td>Stemgent</td><td></td><td>Lösungsmittel: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Invitrogen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% Gelatinelösung</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>1,25 M Stamminhalt in Wasser</td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA) pH 8,0 1X</td><td>Qualität Biologische</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) Lösung</td><td>Sigma</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfatlösung (20%)</td><td>Qualität Biologisch</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonifikator</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Lösung</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G zur Immunpräzipitation</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A zur Immunpräzipitation</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A/Protein G und Magnet Starter Pack</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-Aufreinigungskit (für die mRNA-Aufreinigung aus Gesamt-RNA-Präparaten)</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript Doppelsträngige cDNA-Synthese Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA-Endreparaturset</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Klenow-Fragment (3'&rarr; 5' Exo-)</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 mM)</td><td>Invitrogen</td> 18252015 T4 <td>DNA-Ligase</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel EX Agarose-Gele, 2%</td><td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity 2X Mastermix mit HF-Puffer</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb+ Trimethyl-Histon H3 (Lys4) - ChIP-validierter Antikörper</td><td>EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H3 (di Methyl K4) Antikörper [Y47] - ChIP Grade (ab32356)</td><td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Zellkulturplatten mit flachem Boden (6 Well)</td><td>Fisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standard-Gewebekulturschalen (10 cm)</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometer 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H4 (Trimethyl K20) Antikörper - ChIP Grade (ab9053)</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Labquake Rotator</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq Plattform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip-seq und chip-seq: methoden zur ermittlung von chromatin-assoziierter rna und protein-dna-wechselwirkungen in embryonale stammzellen

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

Embryonale Stammzellen (ES) Zelle Selbsterneuerung und Differenzierung unterliegt extrinsische Signale und intrinsische Netzwerke von Transkriptionsfaktoren, epigenetische Regulatoren und Post-Übersetzung Modifikationen der Histone, die das Gen kombinatorisch beeinflussen Ausdruck Zustand des nahe gelegenen Gene. RNA hat sich auch gezeigt, zur Interaktion mit verschiedenen Proteinen, Chromatin Dynamik und Genexpression regulieren. Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq) ist eine neuartige Methode zur RNA zugeordnete Chromatin Proteine, während Chromatin Immunopräzipitation gefolgt von Next Generation Sequencing (Umfrage ChIP-Seq) ist eine leistungsstarke Genomik-Technik, um den Lageplan des Post-translationale Modifikation der Histone, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren auf einer globalen Skala in ES-Zellen. Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von CARIP-Seq und ChIP-Seq, einschließlich Bibliotheksbau für Next-Generation Sequenzierung, um globale Chromatin-assoziierter RNA und epigenomischen Karten in Embryonaler Stammzellen zu erzeugen.

Wir verhört erfolgreich die genomweite Bindung von H3K4me3, H3K4me2 und KDM5B in ES-Zellen mit diesem ChIP-Seq-Protokoll-6. ES-Zellen wurden im Feeder-freien Bedingungen (Abbildung 1) und vernetzt wie oben beschrieben. Beschallung wurde anschließend wie in Schritt 3.2 des ChIP-Seq-Protokolls beschrieben durchgeführt und bewertet durch Ausführen von DNA auf einem 2 % Agarosegel (Abbildung 2). Als nächstes w...

Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von ChIP-Seq und CARIP-FF, einschließlich der Bibliothek Vorbereitung auf Next Generation Sequencing, global epigenomischen und Chromatin-assoziierter RNA zu generieren-Karten von ES-Zellen.

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Das übergeordnete Ziel von CARIP-Seq ist es, genomweite Chromatin-assoziierte RNAs zu erfassen. Das Ziel von ChIP-Seq ist es, Protein-DNA-Interaktionen in embryonalen Stammzellen auf globaler Ebene zu bewerten. Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Epigenetik und im Stammzellbereich zu beantworten, die Genomlokalisation, Transkriptionsfaktoren oder epigenetische Regulatorbindung oder Histonmodifikationsbelegung oder Chromatin-assoziierte RNAs in embryonalen Stammzellen zu identifizieren.Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie die genomweite unvoreingenommene Abfrage von RNAs, die mit Chromatinbestandteilen assoziiert sind, und die globale Identifizierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen ermöglichen. Obwohl diese Methoden Einblicke in die embryonale Stammzellbiologie geben können, können sie auch auf andere Säugetierzelltypen angewendet werden, um die Krebsbiologie oder andere menschliche Krankheiten zu untersuchen. Um die embryonalen Stammzellen zu gewinnen, waschen Sie die Zellen zuerst mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Dann lösen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird. Nach der Trypsinisierung resuspendieren Sie die Zellen in vorgewärmtem MEF-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum. Geben Sie dann 37 % Formaldehyd in einem konischen Röhrchen zu den Zellen bis zu einer Endkonzentration von 1 % und inkubieren Sie acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu vernetzen.Um die Fixierungsreaktion zu stoppen, fügen Sie 1,25 molare Glycine zu, die bei vier Grad Celsius bis zu einer Endkonzentration von 0,125 molar vorgekühlt sind. Setzen Sie dann das Rohr auf einen Rotator und drehen Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit acht Umdrehungen pro Minute um. Nach fünf Minuten zentrifugieren Sie die Probe bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Nach Beendigung der Zentrifugation ist der Überstand zu entsorgen. Waschen Sie dann das Pellet mit vorgekühlter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung und zentrifugieren Sie die Probe erneut. Entfernen Sie dann die phosphatgepufferte Kochsalzlösung und frieren Sie die Zellen eine Minute lang in flüssigem Stickstoff ein.Sobald die embryonalen Stammzellen auf Eis aufgetaut sind, resuspendieren Sie das Pellet in 2,5 Millilitern Ultraschallpuffer. Um Transkriptionsfaktoren oder epigenetische Faktoren zu untersuchen, resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Ultraschallpuffer ohne Natriumdodecylsulfat. Für Histonmodifikationen resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Puffer, der Natriumdodecylsulfat enthält.Als nächstes wird das Chromatin für die Chromatin-Immunpräzipitation 14 bis 18 Zyklen lang bei 40 % Amplitude mit 30 Sekunden an und 30 Sekunden Ruhemodus beschallt. Um das Chromatin für den Proteinfaktor ChIP zu lösen, ergänzen Sie den Ultraschallpuffer mit 28 Mikrolitern 10%igem Natriumdodecylsulfat. Für Proteinfaktoren in Histonmodifikationen fügen Sie 28 Mikroliter Natriumdesoxycholat und 0,28 Milliliter 10% Triton X-100 hinzu und mischen Sie gut.Zentrifugieren Sie dann die Probe bei 10.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um das Chromatin vorab zu reinigen. Geben Sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit niedriger Bindung 40 Mikroliter A- oder G-Magnetkügelchen. Waschen Sie dann die Kügelchen mit 600 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung und legen Sie das Röhrchen mit den Kügelchen auf ein Gestell mit einem Magneten und inkubieren Sie es eine Minute lang bei Raumtemperatur.Entfernen Sie dann die phosphatgepufferte Kochsalzlösung und resuspendieren Sie die Kügelchen erneut in 100 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Geben Sie zwei bis vier Mikrogramm Antikörper in das Röhrchen und inkubieren Sie es, indem Sie es 40 Minuten lang mit acht Umdrehungen pro Minute auf einen Rotator legen, um die Antikörperbindung an die Kügelchen zu fördern. Fügen Sie dann 200 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu, um die Kügelchen zu waschen.Nach dem Waschen wird der beschallte Chromatinextrakt über Nacht auf einem Rotator bei vier Grad Celsius inkubiert, um die Chromatin-gebundenen Proteine immunauszufällen. Waschen Sie die Kügelchen am nächsten Tag und inkubieren Sie sie mit RIPA-Puffer, RIPA-Puffer mit Salz, Lithiumchlorid-Puffer, Tris-EDTA-Puffer mit Triton X-100 und Tris-EDTA-Puffer, jeweils 10 Minuten lang auf einem Rotator. Um für ChIP zu devernetzen, resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer.Fügen Sie dann drei Mikroliter 10%iges Natriumdodecylsulfat und fünf Mikroliter 20 Milligramm Proteinase K pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Kügelchen über Nacht bei 65 Grad Celsius. Nach der Inkubation am nächsten Tag drehen Sie die Röhrchen mehrmals um, lassen sie auf dem Magnetgestell und geben den Überstand in ein frisches Röhrchen. Waschen Sie dann die magnetischen Kügelchen, indem Sie 100 Mikroliter Tris-EDTA-Puffer hinzufügen, der 0,5 molare Natriumchlorid enthält, und kombinieren Sie die beiden Überstände.Um für CARIP zu entvernetzen, resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer. Fügen Sie dann drei Mikroliter 10%iges Natriumdodecylsulfat und fünf Mikroliter 20 Milligramm Proteinase K pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Kügelchen vier bis 12 Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Drehen Sie das Röhrchen erneut mehrmals um und legen Sie es auf das Magnetgestell, um den Überstand auf ein frisches Röhrchen zu übertragen.Waschen Sie dann die magnetischen Kügelchen, indem Sie 100 Mikroliter Tris-EDTA-Puffer hinzufügen, der 0,5 molare Natriumchlorid enthält, und kombinieren Sie dann die beiden Überstände. Isolieren Sie schließlich die RNA-Probe unter Verwendung von Phenolchloroform-Isoamylalkohol in einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von 25 bis 24 zu eins. Verwenden Sie als Nächstes DNase, um DNA aus der Chromatin-assoziierten immunpräzipitierten RNA-Probe zu entfernen.Fügen Sie dann der CARIP-Probe 10x DNase-Puffer hinzu und stellen Sie das endgültige Volumen auf die 1-fache Konzentration ein. Inkubieren Sie die Probe dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes synthetisieren Sie den ersten Strang komplementärer DNA, indem Sie eine PCR-Reaktion durchführen, indem Sie 10,5 Mikroliter RNA und einen Mikroliter mit drei Mikrogramm pro Milliliter zufälliger Hexamer-Primer hinzufügen.Um die Sekundärstruktur zu denaturieren, inkubieren Sie das Röhrchen zunächst fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius und dann zwei Minuten lang auf Eis. Geben Sie dann den Mastermix in das PCR-Röhrchen und inkubieren Sie ihn zwei Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Fügen Sie dann einen Mikroliter von 200 Einheiten pro Mikroliter hochgestellt zwei hinzu und führen Sie das Thermocycler-Programm aus.Um den zweiten Strang komplementärer DNA zu synthetisieren, setzen Sie die Reaktion auf Eis ein, indem Sie die Reagenzien, den Puffer und die Enzyme hinzufügen. Dann die Reagenzien vorsichtig mischen und zwei Stunden lang bei 16 Grad Celsius inkubieren. Nachdem die DNA synthetisiert wurde, reinigen Sie die komplementäre DNA mit einem PCR-Aufreinigungskit.Defragmentieren Sie dann die doppelsträngige DNA, verwenden Sie einen Wasserbad-Sonifikator und ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, um die DNA dreimal 10 Minuten oder viermal 10 Minuten lang auf eine Größe von 250 bis 500 Basenpaaren zu teilen. Bereiten Sie dann die Bibliothek vor und führen Sie die Sequenzierung der nächsten Generation durch. Hier wurden Phasenkontrastbilder von embryonalen Stammzellen aufgenommen, um die Stammzellkolonien sichtbar zu machen.In diesem Protokoll wurden die Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von mitotisch inaktivierten embryonalen Mausfibroblasten mit LIF und/oder GSK3i in den Kulturmedien kultiviert, um die Differenzierung der Zellen zu verhindern. Um die Effizienz der Beschallung des vernetzten embryonalen Stammzellchromatins zu visualisieren, wurde dann beschallte doppelsträngige DNA auf ein 2%iges Agarosegel geladen. Das Gelbild zeigt geschertes Chromatin im Bereich von 200 bis 500 Basenpaaren.Als nächstes wurden ChIP-Seq-Bibliotheken unter Verwendung einer Next-Generation-Seq-Seq-Plattform generiert und sequenziert, um die genomweite Belegung eines Histon-modifizierenden Enzyms und Histonmodifikationen in embryonalen Stammzellen zu bewerten. In der benutzerdefinierten UCSC-Browseransicht sind angereicherte H3K4-Trimethylierung, H3K4-Dimethylierung und KDM5B am Kerngen für den Pluripotenzregulator, POU5F1, und am HOXC-Cluster sichtbar. Die CARIP-Seq-Analyse wurde auch durchgeführt, um Chromatin-assoziierte RNAs in embryonalen Stammzellen zu bewerten.Die benutzerdefinierte UCSC-Browseransicht zeigt die Belegung der H4K20-Trimethylierungs-assoziierten RNA und der H4K20-Trimethylierung in embryonalen Stammzellen. Aus den CARIP-Seq-Ergebnissen kann interpretiert werden, dass die RNA zwar mit der H4K20-Trimethylierung assoziiert ist, aber möglicherweise nicht mit dem jeweiligen Locus interagiert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Chromatin-assoziierte RNAs mit CARIP-Seq untersucht und Protein-DNA-Wechselwirkungen auf globaler Ebene in embryonalen Stammzellen identifiziert.

carip-seq-chip-seq-methods-to-identify-chromatin-associated-rnas

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Differenzierung der ESC deckt sich mit Zelltyp-spezifische Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung des Chromatins. Der Nachweis dieser Veränderungen bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die stemcellness und der Zelldifferenzierung zu definieren. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) stellt eine wertvolle Methode, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Stammzell-Differenzierung zu sezieren.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

Dieses Video zeigt die grundlegenden Schritte zur Durchführung einer Gesamttranskriptomanalyse an präparierten embryonalen Rückenmarksproben von Küken nach der Transfektion mit In-Ovo-Elektroporation.

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

Die Frage, wie Chromatin Regulierungsbehörden und Chromatin-Staaten betreffen das Genom in vivo ist der Schlüssel zum Verständnis, wie frühe Zellschicksal Entscheidungen werden in den sich entwickelnden Embryo gemacht. ChIP-Seq-die beliebteste Ansatz zur Chromatin Funktionen auf globaler Ebene, wird hier für Xenopus Embryonen beschrieben untersuchen.

Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen von ChIP-Seq

Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Wir beschreiben eine Schritt für Schritt Protokoll für Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), die es die Analyse der Zelle-typspezifischen genomweite Histon-Modifikation ermöglicht.

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Eine präzise Bestimmung von Proteinbindungsstellen im genomischen Ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Hier beschreiben wir eine genomische Kartierungsmethode, die chromatinimmunpräzipierte DNA mit Exonukleaseverdauung (ChIP-exo) behandelt, gefolgt von hochdurchsatzhoher Sequenzierung. Diese Methode erkennt Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Base-Pair-Mapping-Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis in Säugetierneuronen.

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Dieses Protokoll bietet eine optimierte rechnerische Pipeline zur Quantifizierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Durch die Integration von Chromatinzugänglichkeit, Chromatinmerkmal und Transkriptionsdaten ermöglicht es einen genauen Nachweis und eine strangspezifische Analyse der Enhanceraktivität in komplexen intragenen Regionen, während es für Forscher ohne umfangreiche bioinformatische Ausbildung zugänglich bleibt.

Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erfassung RNA-assoziierter Chromatin-DNA-Interaktionen zur Kartierung der RNA-bezogenen dreidimensionalen Genomorganisation.

RNA-assoziierte Chromatin-DNA-Interaktionsmethode

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur Identifizierung direkter lncRNA-Protein-Interaktionen.

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur verifizierbaren Identifikation von Proteinen, die direkt mit LncRNA interagieren: Von kultivierten Zellen bis zum Maus-Hoden

Erfahren Sie, wie CARIP-Seq und ChIP-Seq zur Kartierung chromatin-assoziierter RNAs und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonalen Stammzellen eingesetzt werden. Diese Methoden ermöglichen epigenomische Studien.

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen (Video) | JoVE Journal

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen

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