Name: CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie CARIP-Seq und ChIP-Seq zur Kartierung chromatin-assoziierter RNAs und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonalen Stammzellen eingesetzt werden. Diese Methoden ermöglichen epigenomische Studien.

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Diese Arbeit wurde von Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, ein Stipendium des National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) an B.L.K. vergeben unterstützt. Diese Arbeit genutzt, die Wayne State Universität High Performance Computing Grid für computational Ressourcen (< Https://www.grid.wayne.edu/>). Wir danken für die Unterstützung bei CARIP-Seq Datenanalyse Jiji Kurup.
AUTOREN-BEITRÄGE:
B.L.K. der CARIP-Seq-Methode konzipiert, entworfen und ChIP-Seq und CARIP-Seq Experimente durchgeführt die Sequenzierungsdaten analysiert und erarbeitet das Manuskript. Alle Autoren haben gelesen und genehmigt die Endfassung des Manuskripts.

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
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<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
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<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

ChIP-Seq ist eine nützliche Methode, die Lage des globalen Protein-DNA-Wechselwirkungen zu bewerten (zB., Transkription Faktoren/Histon-modifizierende Enzyme/Histon Änderungen und DNA) in ES-Zellen, während der neu entwickelte CARIP-Seq-Protokoll nützlich ist abfragenden genomweite RNAs mit Chromatin Bestandteile. ChIP-Seq ist ein grundlegendes Instrument, das verwendet wird, um epigenetische Landschaften von ES-Zellen und andere Zelltypen zu bewerten. Die Qualität der ChIP-Seq und CARIP-Seq-Bibliotheken ist wei...

Kommunikation zwischen extrazelluläre Signale und eine Reihe von transkriptionelle-Aufsichtsbehörden, einschließlich der Histon-Modifikatoren und Post-Übersetzung Änderung der Histone Tails sind embryonale Stammzellen (ES) Zelle Schicksal Entscheidungen geregelt. Diese Interaktionen Erleichterung Chromatin Zugänglichkeit und Verpacken von Chromatin in einen von zwei Zuständen: Euchromatin, das offen und transcriptionally aktiv ist, und Heterochromatin, das kompakt und in der Regel transcriptionally inaktiv ist. Transkriptionsfaktoren mit DNA-Sequenz-spezifische verbindliche Affinitäten und epigenetische Modifikatoren Associate bei euchromatisch Regionen zur Teilnahme bei der Kontrolle der Genexpression. Next Generation Sequencing-Methoden, einschließlich der ChIP-Seq1, haben bei der Kartierung genomweite transcriptional Netze, die grundlegend für ES Zelle Selbsterneuerung und Pluripotenz2,3,4 sind maßgeblich ,5,6. Darüber hinaus während der RNA Immunopreciation gefolgt von der nächsten Generation Sequenzierung (RIP-Seq)7 Bewertungen von RNA-Protein-Wechselwirkungen legen nahe, dass DNA-bindende Proteine RNAs interagieren regulieren transkriptionelle Ereignisse7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, haben nur wenige Studien untersucht die genomweite Lokalisierung von RNAs Chromatin12oder globale Wechselwirkungen zwischen RNA und Histon Änderungen zugeordnet. Lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs) sind eine Klasse von RNAs, die gefunden wurden, um die Tätigkeit von Chromatin-assoziierte Proteine13,14,15Regeln. Xist ist beispielsweise eine LncRNA, die im weiblichen Säugerzellen, Inaktivierung eines x-Chromosoms durch die Rekrutierung von epigenetischen Repressoren16,17regelt. Das gesamte Spektrum der RNAs zugeordnete Chromatin ist jedoch weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll, Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq), Chromatin-assoziierten RNAs auf einer genomweiten Basis in ES-Zellen, einschließlich Bibliothek Vorbereitung zu identifizieren für Next Generation Sequencing und ChIP-Seq globale Belegung von Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren zuordnen. Im Gegensatz zu anderen RIP-Seq Methoden7enthält CARIP-Seq Vernetzung und Beschallung Schritte, die für die direkte Identifizierung von RNAs Chromatin zugeordnet zu ermöglichen. Gemeinsam ChIP-Seq ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genomweiten Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren, während CARIP-Seq ist eine leistungsfähige Methode zur Übersicht RNAs mit Chromatin Komponenten verbunden.

<table><tbody><tr><td>Maus-Leukämie-Hemmfaktor (ESGRO LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 oder 107 Einheiten</td></tr><tr><td>GSK3&betaInhibitor CHIR99021 (GSK3i)</td><td>Stemgent</td><td></td><td>Lösungsmittel: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>MEK-Inhibitor PD0325901 (MEKi)</td><td>Stemgent</td><td></td><td>Lösungsmittel: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Invitrogen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% Gelatinelösung</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>1,25 M Stamminhalt in Wasser</td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA) pH 8,0 1X</td><td>Qualität Biologische</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) Lösung</td><td>Sigma</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfatlösung (20%)</td><td>Qualität Biologisch</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonifikator</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Lösung</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G zur Immunpräzipitation</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A zur Immunpräzipitation</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A/Protein G und Magnet Starter Pack</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-Aufreinigungskit (für die mRNA-Aufreinigung aus Gesamt-RNA-Präparaten)</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript Doppelsträngige cDNA-Synthese Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA-Endreparaturset</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Klenow-Fragment (3'&rarr; 5' Exo-)</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 mM)</td><td>Invitrogen</td> 18252015 T4 <td>DNA-Ligase</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel EX Agarose-Gele, 2%</td><td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity 2X Mastermix mit HF-Puffer</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb+ Trimethyl-Histon H3 (Lys4) - ChIP-validierter Antikörper</td><td>EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H3 (di Methyl K4) Antikörper [Y47] - ChIP Grade (ab32356)</td><td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Zellkulturplatten mit flachem Boden (6 Well)</td><td>Fisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standard-Gewebekulturschalen (10 cm)</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometer 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon H4 (Trimethyl K20) Antikörper - ChIP Grade (ab9053)</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Labquake Rotator</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq Plattform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip-seq und chip-seq: methoden zur ermittlung von chromatin-assoziierter rna und protein-dna-wechselwirkungen in embryonale stammzellen

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

Embryonale Stammzellen (ES) Zelle Selbsterneuerung und Differenzierung unterliegt extrinsische Signale und intrinsische Netzwerke von Transkriptionsfaktoren, epigenetische Regulatoren und Post-Übersetzung Modifikationen der Histone, die das Gen kombinatorisch beeinflussen Ausdruck Zustand des nahe gelegenen Gene. RNA hat sich auch gezeigt, zur Interaktion mit verschiedenen Proteinen, Chromatin Dynamik und Genexpression regulieren. Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq) ist eine neuartige Methode zur RNA zugeordnete Chromatin Proteine, während Chromatin Immunopräzipitation gefolgt von Next Generation Sequencing (Umfrage ChIP-Seq) ist eine leistungsstarke Genomik-Technik, um den Lageplan des Post-translationale Modifikation der Histone, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren auf einer globalen Skala in ES-Zellen. Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von CARIP-Seq und ChIP-Seq, einschließlich Bibliotheksbau für Next-Generation Sequenzierung, um globale Chromatin-assoziierter RNA und epigenomischen Karten in Embryonaler Stammzellen zu erzeugen.

Wir verhört erfolgreich die genomweite Bindung von H3K4me3, H3K4me2 und KDM5B in ES-Zellen mit diesem ChIP-Seq-Protokoll-6. ES-Zellen wurden im Feeder-freien Bedingungen (Abbildung 1) und vernetzt wie oben beschrieben. Beschallung wurde anschließend wie in Schritt 3.2 des ChIP-Seq-Protokolls beschrieben durchgeführt und bewertet durch Ausführen von DNA auf einem 2 % Agarosegel (Abbildung 2). Als nächstes w...

Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von ChIP-Seq und CARIP-FF, einschließlich der Bibliothek Vorbereitung auf Next Generation Sequencing, global epigenomischen und Chromatin-assoziierter RNA zu generieren-Karten von ES-Zellen.

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Das übergeordnete Ziel von CARIP-Seq ist es, genomweite Chromatin-assoziierte RNAs zu erfassen. Das Ziel von ChIP-Seq ist es, Protein-DNA-Interaktionen in embryonalen Stammzellen auf globaler Ebene zu bewerten. Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Epigenetik und im Stammzellbereich zu beantworten, die Genomlokalisation, Transkriptionsfaktoren oder epigenetische Regulatorbindung oder Histonmodifikationsbelegung oder Chromatin-assoziierte RNAs in embryonalen Stammzellen zu identifizieren.Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie die genomweite unvoreingenommene Abfrage von RNAs, die mit Chromatinbestandteilen assoziiert sind, und die globale Identifizierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen ermöglichen. Obwohl diese Methoden Einblicke in die embryonale Stammzellbiologie geben können, können sie auch auf andere Säugetierzelltypen angewendet werden, um die Krebsbiologie oder andere menschliche Krankheiten zu untersuchen. Um die embryonalen Stammzellen zu gewinnen, waschen Sie die Zellen zuerst mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Dann lösen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird. Nach der Trypsinisierung resus

carip-seq-chip-seq-methods-to-identify-chromatin-associated-rnas

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Differenzierung der ESC deckt sich mit Zelltyp-spezifische Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung des Chromatins. Der Nachweis dieser Veränderungen bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die stemcellness und der Zelldifferenzierung zu definieren. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) stellt eine wertvolle Methode, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Stammzell-Differenzierung zu sezieren.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Dieses Video zeigt die grundlegenden Schritte zur Durchführung einer Gesamttranskriptomanalyse an präparierten embryonalen Rückenmarksproben von Küken nach der Transfektion mit In-Ovo-Elektroporation.

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

Die Frage, wie Chromatin Regulierungsbehörden und Chromatin-Staaten betreffen das Genom in vivo ist der Schlüssel zum Verständnis, wie frühe Zellschicksal Entscheidungen werden in den sich entwickelnden Embryo gemacht. ChIP-Seq-die beliebteste Ansatz zur Chromatin Funktionen auf globaler Ebene, wird hier für Xenopus Embryonen beschrieben untersuchen.

Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen von ChIP-Seq

Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Eine präzise Bestimmung von Proteinbindungsstellen im genomischen Ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Hier beschreiben wir eine genomische Kartierungsmethode, die chromatinimmunpräzipierte DNA mit Exonukleaseverdauung (ChIP-exo) behandelt, gefolgt von hochdurchsatzhoher Sequenzierung. Diese Methode erkennt Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Base-Pair-Mapping-Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis in Säugetierneuronen.

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Dieses Protokoll bietet eine optimierte rechnerische Pipeline zur Quantifizierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Durch die Integration von Chromatinzugänglichkeit, Chromatinmerkmal und Transkriptionsdaten ermöglicht es einen genauen Nachweis und eine strangspezifische Analyse der Enhanceraktivität in komplexen intragenen Regionen, während es für Forscher ohne umfangreiche bioinformatische Ausbildung zugänglich bleibt.

Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erfassung RNA-assoziierter Chromatin-DNA-Interaktionen zur Kartierung der RNA-bezogenen dreidimensionalen Genomorganisation.

RNA-assoziierte Chromatin-DNA-Interaktionsmethode

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur Identifizierung direkter lncRNA-Protein-Interaktionen.

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur verifizierbaren Identifikation von Proteinen, die direkt mit LncRNA interagieren: Von kultivierten Zellen bis zum Maus-Hoden

Erfahren Sie, wie CARIP-Seq und ChIP-Seq zur Kartierung chromatin-assoziierter RNAs und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonalen Stammzellen eingesetzt werden. Diese Methoden ermöglichen epigenomische Studien.

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen (Video) | JoVE Journal

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen

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