CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen

Das übergeordnete Ziel von CARIP-Seq ist es, genomweite Chromatin-assoziierte RNAs zu erfassen. Das Ziel von ChIP-Seq ist es, Protein-DNA-Interaktionen in embryonalen Stammzellen auf globaler Ebene zu bewerten. Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Epigenetik und im Stammzellbereich zu beantworten, die Genomlokalisation, Transkriptionsfaktoren oder epigenetische Regulatorbindung oder Histonmodifikationsbelegung oder Chromatin-assoziierte RNAs in embryonalen Stammzellen zu identifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie die genomweite unvoreingenommene Abfrage von RNAs, die mit Chromatinbestandteilen assoziiert sind, und die globale Identifizierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen ermöglichen. Obwohl diese Methoden Einblicke in die embryonale Stammzellbiologie geben können, können sie auch auf andere Säugetierzelltypen angewendet werden, um die Krebsbiologie oder andere menschliche Krankheiten zu untersuchen. Um die embryonalen Stammzellen zu gewinnen, waschen Sie die Zellen zuerst mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Dann lösen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird. Nach der Trypsinisierung resuspendieren Sie die Zellen in vorgewärmtem MEF-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum. Geben Sie dann 37 % Formaldehyd in einem konischen Röhrchen zu den Zellen bis zu einer Endkonzentration von 1 % und inkubieren Sie acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu vernetzen.

Um die Fixierungsreaktion zu stoppen, fügen Sie 1,25 molare Glycine zu, die bei vier Grad Celsius bis zu einer Endkonzentration von 0,125 molar vorgekühlt sind. Setzen Sie dann das Rohr auf einen Rotator und drehen Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit acht Umdrehungen pro Minute um. Nach fünf Minuten zentrifugieren Sie die Probe bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach Beendigung der Zentrifugation ist der Überstand zu entsorgen. Waschen Sie dann das Pellet mit vorgekühlter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung und zentrifugieren Sie die Probe erneut. Entfernen Sie dann die phosphatgepufferte Kochsalzlösung und frieren Sie die Zellen eine Minute lang in flüssigem Stickstoff ein.

Sobald die embryonalen Stammzellen auf Eis aufgetaut sind, resuspendieren Sie das Pellet in 2,5 Millilitern Ultraschallpuffer. Um Transkriptionsfaktoren oder epigenetische Faktoren zu untersuchen, resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Ultraschallpuffer ohne Natriumdodecylsulfat. Für Histonmodifikationen resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Puffer, der Natriumdodecylsulfat enthält.

Als nächstes wird das Chromatin für die Chromatin-Immunpräzipitation 14 bis 18 Zyklen lang bei 40 % Amplitude mit 30 Sekunden an und 30 Sekunden Ruhemodus beschallt. Um das Chromatin für den Proteinfaktor ChIP zu lösen, ergänzen Sie den Ultraschallpuffer mit 28 Mikrolitern 10%igem Natriumdodecylsulfat. Für Proteinfaktoren in Histonmodifikationen fügen Sie 28 Mikroliter Natriumdesoxycholat und 0,28 Milliliter 10% Triton X-100 hinzu und mischen Sie gut.

Zentrifugieren Sie dann die Probe bei 10.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um das Chromatin vorab zu reinigen. Geben Sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit niedriger Bindung 40 Mikroliter A- oder G-Magnetkügelchen. Waschen Sie dann die Kügelchen mit 600 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung und legen Sie das Röhrchen mit den Kügelchen auf ein Gestell mit einem Magneten und inkubieren Sie es eine Minute lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie dann die phosphatgepufferte Kochsalzlösung und resuspendieren Sie die Kügelchen erneut in 100 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Geben Sie zwei bis vier Mikrogramm Antikörper in das Röhrchen und inkubieren Sie es, indem Sie es 40 Minuten lang mit acht Umdrehungen pro Minute auf einen Rotator legen, um die Antikörperbindung an die Kügelchen zu fördern. Fügen Sie dann 200 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzu, um die Kügelchen zu waschen.

Nach dem Waschen wird der beschallte Chromatinextrakt über Nacht auf einem Rotator bei vier Grad Celsius inkubiert, um die Chromatin-gebundenen Proteine immunauszufällen. Waschen Sie die Kügelchen am nächsten Tag und inkubieren Sie sie mit RIPA-Puffer, RIPA-Puffer mit Salz, Lithiumchlorid-Puffer, Tris-EDTA-Puffer mit Triton X-100 und Tris-EDTA-Puffer, jeweils 10 Minuten lang auf einem Rotator. Um für ChIP zu devernetzen, resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer.

Fügen Sie dann drei Mikroliter 10%iges Natriumdodecylsulfat und fünf Mikroliter 20 Milligramm Proteinase K pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Kügelchen über Nacht bei 65 Grad Celsius. Nach der Inkubation am nächsten Tag drehen Sie die Röhrchen mehrmals um, lassen sie auf dem Magnetgestell und geben den Überstand in ein frisches Röhrchen. Waschen Sie dann die magnetischen Kügelchen, indem Sie 100 Mikroliter Tris-EDTA-Puffer hinzufügen, der 0,5 molare Natriumchlorid enthält, und kombinieren Sie die beiden Überstände.

Um für CARIP zu entvernetzen, resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer. Fügen Sie dann drei Mikroliter 10%iges Natriumdodecylsulfat und fünf Mikroliter 20 Milligramm Proteinase K pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Kügelchen vier bis 12 Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Drehen Sie das Röhrchen erneut mehrmals um und legen Sie es auf das Magnetgestell, um den Überstand auf ein frisches Röhrchen zu übertragen.

Waschen Sie dann die magnetischen Kügelchen, indem Sie 100 Mikroliter Tris-EDTA-Puffer hinzufügen, der 0,5 molare Natriumchlorid enthält, und kombinieren Sie dann die beiden Überstände. Isolieren Sie schließlich die RNA-Probe unter Verwendung von Phenolchloroform-Isoamylalkohol in einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von 25 bis 24 zu eins. Verwenden Sie als Nächstes DNase, um DNA aus der Chromatin-assoziierten immunpräzipitierten RNA-Probe zu entfernen.

Fügen Sie dann der CARIP-Probe 10x DNase-Puffer hinzu und stellen Sie das endgültige Volumen auf die 1-fache Konzentration ein. Inkubieren Sie die Probe dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes synthetisieren Sie den ersten Strang komplementärer DNA, indem Sie eine PCR-Reaktion durchführen, indem Sie 10,5 Mikroliter RNA und einen Mikroliter mit drei Mikrogramm pro Milliliter zufälliger Hexamer-Primer hinzufügen.

Um die Sekundärstruktur zu denaturieren, inkubieren Sie das Röhrchen zunächst fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius und dann zwei Minuten lang auf Eis. Geben Sie dann den Mastermix in das PCR-Röhrchen und inkubieren Sie ihn zwei Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Fügen Sie dann einen Mikroliter von 200 Einheiten pro Mikroliter hochgestellt zwei hinzu und führen Sie das Thermocycler-Programm aus.

Um den zweiten Strang komplementärer DNA zu synthetisieren, setzen Sie die Reaktion auf Eis ein, indem Sie die Reagenzien, den Puffer und die Enzyme hinzufügen. Dann die Reagenzien vorsichtig mischen und zwei Stunden lang bei 16 Grad Celsius inkubieren. Nachdem die DNA synthetisiert wurde, reinigen Sie die komplementäre DNA mit einem PCR-Aufreinigungskit.

Defragmentieren Sie dann die doppelsträngige DNA, verwenden Sie einen Wasserbad-Sonifikator und ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, um die DNA dreimal 10 Minuten oder viermal 10 Minuten lang auf eine Größe von 250 bis 500 Basenpaaren zu teilen. Bereiten Sie dann die Bibliothek vor und führen Sie die Sequenzierung der nächsten Generation durch. Hier wurden Phasenkontrastbilder von embryonalen Stammzellen aufgenommen, um die Stammzellkolonien sichtbar zu machen.

In diesem Protokoll wurden die Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von mitotisch inaktivierten embryonalen Mausfibroblasten mit LIF und/oder GSK3i in den Kulturmedien kultiviert, um die Differenzierung der Zellen zu verhindern. Um die Effizienz der Beschallung des vernetzten embryonalen Stammzellchromatins zu visualisieren, wurde dann beschallte doppelsträngige DNA auf ein 2%iges Agarosegel geladen. Das Gelbild zeigt geschertes Chromatin im Bereich von 200 bis 500 Basenpaaren.

Als nächstes wurden ChIP-Seq-Bibliotheken unter Verwendung einer Next-Generation-Seq-Seq-Plattform generiert und sequenziert, um die genomweite Belegung eines Histon-modifizierenden Enzyms und Histonmodifikationen in embryonalen Stammzellen zu bewerten. In der benutzerdefinierten UCSC-Browseransicht sind angereicherte H3K4-Trimethylierung, H3K4-Dimethylierung und KDM5B am Kerngen für den Pluripotenzregulator, POU5F1, und am HOXC-Cluster sichtbar. Die CARIP-Seq-Analyse wurde auch durchgeführt, um Chromatin-assoziierte RNAs in embryonalen Stammzellen zu bewerten.

Die benutzerdefinierte UCSC-Browseransicht zeigt die Belegung der H4K20-Trimethylierungs-assoziierten RNA und der H4K20-Trimethylierung in embryonalen Stammzellen. Aus den CARIP-Seq-Ergebnissen kann interpretiert werden, dass die RNA zwar mit der H4K20-Trimethylierung assoziiert ist, aber möglicherweise nicht mit dem jeweiligen Locus interagiert. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Chromatin-assoziierte RNAs mit CARIP-Seq untersucht und Protein-DNA-Wechselwirkungen auf globaler Ebene in embryonalen Stammzellen identifiziert.