Name: Levator Auris Longus Prüfungsvorbereitung der Säugetier-neuromuskulären Übertragung unter Spannung Klemme Bedingungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Lernen Sie die Präparation des M. levator auris longus bei der Maus zur Aufzeichnung synaptischer Ströme an der neuromuskulären Verbindung. Diese Methode ermöglicht detaillierte elektrophysiologische Einzelzellmessungen zur Untersuchung der synaptischen Übertragung.

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Wir danken Dr. Mark M. Rich und Daniel Miranda für redaktionelle Kommentare, Ahmad Khedraki für die Unterstützung dieser Technik und Wright State University für die finanzielle Unterstützung (Gründerfonds, A.A.V.) zu etablieren.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschrieben ist die Vorbereitung und Verwendung der Maus LAL Muskel für die Messung der neuromuskulären Übertragung unter Strom oder Spannung Klemme Bedingungen. Es gibt mehrere wichtige Punkte zu beachten für Sezieren, die LAL. Reinigung überschüssiges Bindegewebe an der Muskel-Aids in Elektrode Impalement, als die Elektroden kann das Bindegewebe Haken, wenn sie für Impalement Positionierung. Jedoch nur entfernen, Bindegewebe, das weggenommen werden kann ganz einfach, die Wahrscheinlichkeit, dass des Muskels zu beg...

Studium der synaptischen Übertragung an der neuromuskulären Synapse bietet Einblicke in die dynamische Beziehung zwischen dem Nerven- und Skelett-Muskelsystem und ist ein hervorragendes Modell für die Prüfung von synaptischen Physiologie. Die Levator Auris Longus (LAL) ist eine dünne Muskel, so dass für die neuromuskulären Verbindungen leicht visualisiert werden. Frühere Berichten haben die Bequemlichkeit der Nutzung der LAL, synaptische Drogen und Giftstoffe zu untersuchen und charakterisiert die skelettartigen Muskel Faser Art Eigenschaften des LAL1,2beschrieben. Zahlreiche Studien haben die LAL verwendet, um neuromuskuläre Physiologie3,4,5,6,7,8zu untersuchen. Für Elektrophysiologie die Fähigkeit, LAL neuromuskuläre Kreuzungen leicht beobachten ermöglicht die genaue Platzierung von Mikroelektroden an der motorischen Endplatte und Klemme Platzprobleme in der synaptischen Übertragung Aufnahme reduziert. Strom-Clamp Aufnahmen der Muskel Membran Eigenschaften, wie die Membran Zeitkonstante (τm) und Eingangswiderstand (Rin) werden leicht erreicht. Darüber hinaus können diese Eigenschaften von den gleichen Muskelfasern zur Aufzeichnung der neuromuskulären Übertragung, so dass ein direkter Vergleich der synaptischen Funktion an den Muskel-Membran-Eigenschaften verwendet gemessen werden. Analyse dieser Daten liefern wichtige Erkenntnisse über die physikalischen Mechanismen der vielen neuromuskulären Erkrankungen und Zustände der veränderte Aktivität.
Ein wichtiger Aspekt der hier beschriebenen Technik ist die Verwendung der Spannung-Klemme für synaptische Aufnahmen, die nicht unterliegen die Nichtlinearitäten im Strom-Clamp begegnet und sind unabhängig von der Muskel-Membran-Eigenschaften. Vorteile der Verwendung von Voltage-Clamp im Gegensatz zu Strom-Clamp, um neuromuskulären Übertragung zu untersuchen wurden von bahnbrechenden Bemühungen in den 1950er Jahren9eingerichtet. Unter Strom-Clamp sind EPPs, die 10-15 mV Amplitude überschreiten keine lineare Produkt der Nahostfriedensprozess Amplitude9. Zum Beispiel, wenn die durchschnittliche Nahostfriedensprozess 1 mV, einem EVP von 5 mV kann davon ausgegangen werden, das Produkt von 5 mEPPs (QC 5); in der Erwägung, eine EVP von 40 mV wird das Produkt von mehr als 40 mEPPs sein. Diese nicht-Linearität bei größeren EPPs tritt auf, weil die treibende Kraft für die EVP, was ist der Unterschied zwischen der Membran und Gleichgewicht-Potenzial für den Acetylcholin-Rezeptor (~-10 mV), erheblich sinkt, während große EPPs. Dieses Problem wird in Voltage-Clamp-Experimenten vermieden, weil der Muskel Membran Potenzial während Voltage-Clamp-Experimenten nicht ändert. Ein Nachteil ist, dass Spannung-Clamp Experimente sind technisch schwieriger als Strom-Clamp Aufnahme. Mit diesem im Verstand entwickelt McLachlan und Martin eine einfache mathematische Korrektur, die Nichtlinearitäten im Strom-Clamp Aufnahmen von EPPs10ausmacht. Die Korrekturen funktionieren gut11,12,13, aber wichtiger ist, davon ausgehen, dass die Muskel-Membran-Eigenschaften wurden nicht gestört.
Die Muskel-Membran-Eigenschaften sind besonders wichtig zu prüfen, ob Studium der Bedingungen oder Krankheitszuständen, die den Muskel zu stören. Skelettartiger Muskel aus dem R6/2 transgenen Modell der Huntington-Krankheit ist beispielsweise übererregbar durch eine schrittweise Verringerung der ruhenden Chlorid und Kalium Ströme14,15. Infolgedessen sind mEPPs und EPPs in der Skelettmuskulatur R6/2 verstärkt. Natürlich können zusätzliche Faktoren mEPPs und EPPs ändern. Arbeiten Sie mit einem anderen Modell von Chorea Huntington Mäusen (R6/1) Änderungen in EPPs, die im Zusammenhang mit SNARE-Proteine8schien gefunden. Um die Mechanismen, die veränderten neuromuskulären Übertragung zu beurteilen, wäre es vorteilhaft, die Auswirkungen der veränderten Muskel Membran Eigenschaften mithilfe einer Spannung-Klemme zu beseitigen. In einer aktuellen Studie wurde die R6/2 neuromuskuläre Übertragung Bedingungen sowohl Strom und Spannung-Klemme mit der beschriebenen Technik hierin untersucht. Die Gesamtheit der motorischen endplatten wurden Spannung eingespannten mit weniger als 1 % Fehler, indem man zwei Mikroelektroden in die Konstante Länge der Endplatte16. Es zeigte sich, dass Spannung-Klemme und Strom-Clamp Aufzeichnungen ergab kontrastierende Messungen der neuromuskulären Übertragung in R6/2 Muskel korrigiert. Dies macht deutlich, dass es schwierig sein kann, EPPs Nichtlinearitäten zu korrigieren, wenn der Muskel-Membran-Eigenschaften geändert wurden und zeigt die Vorteile der Voltage-Clamp-Datensätze, die unabhängig von der Muskel-Membran-Eigenschaften sind zu erhalten. Das Protokoll enthaltenen eignet sich für die Prüfung von Bedingungen oder Krankheitszustände, die synaptische Übertragung und der postsynaptischen Membran Eigenschaften beeinflussen.

<table><tbody><tr><td>Olympus Zusammengesetztes Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10x Objektiv</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x Objektiv</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>Santa Barbara Instruments Group</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 Pulse Generator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iso-flex Stimulus Isolator</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Datenerfassungs- und Analysesoftware</td><td>Molecular Devices</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>Konzentrische bipolare Elektrode</td><td>FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>Kugelgelenkmanipulator</td><td>Narishige&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nichtmetallische Spritzen 34 Gauge</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 5 Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 2 Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodissektion Schere</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 Stimulator</td><td>Grass Medizinisches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modell P-1000 Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axon Digidata 1550 Geräuscharmes Datenerfassungssystem</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiefpass-Bessell-Filter</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator für Linkshänder</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>Rechtshänder-Mikromanipulator</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>Einzel-Bewegungssteuerung</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator mit gekreuzter Rolle</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>Dies wurde der Z-Achse der Links- und Rechtshänder-Mikromanipulatoren hinzugefügt, um die Motorisierung der Z-Achse zu ermöglichen. Dieser kundenspezifische Aufbau ist billiger und weniger sperrig als der Kauf eines motorisierten 4-Achsen-Mikromanipulators. Es ermöglicht uns auch, beide Mikromanipulatoren mit einem Controller zu steuern</td></tr><tr><td>. Alle Chemikalien wurden von Fisher bestellt, außer,</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>Molecular Probes Molecular Probes</td><td></td><td>ist kein Unternehmen mehr. Jetzt über Fisher bestellt</td></tr></tbody></table>

levator auris longus prüfungsvorbereitung der säugetier-neuromuskulären Übertragung unter spannung klemme bedingungen

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Aufzeichnung synaptische Übertragung aus der neuromuskulären Synapse unter Strom-Klemme und Spannung-Klemme. Eine ex-Vivo -Vorbereitung des Levator Auris Longus (LAL) wird verwendet, weil es eine dünne Muskel ist, der einfache Visualisierung von der neuromuskulären Synapse Mikroelektrode Impalement an der motorischen Endplatte vorsieht. Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung von spontanen Miniatur Endplatte Potentiale und Ströme (mEPPs und mEPCs), Endplatte Nerv-evozierten Potentiale und Ströme (EPPs und EPCs), sowie die Eigenschaften der Membran der motorischen Endplatte. Ergebnisse, die von dieser Methode auch die Quanten Inhalte (QC), Anzahl der Vesikel freisetzungsstandorten (n), Wahrscheinlichkeit des vesikels Release (pRel), synaptische Erleichterung und Depression sowie Muskel-Membran-Zeitkonstante (τ m) und Eingangswiderstand. Anwendung dieser Technik zu Mausmodellen menschlicher Erkrankungen kann wichtige Pathologien bei Krankheitszuständen markieren und identifizieren neue Behandlungsstrategien. Klemmend voll Spannung-eine einzige Synapse, stellt diese Methode eine der ausführlichsten Analysen der synaptischen Übertragung derzeit verfügbar.

Abbildung 8 zeigt ein Beispiel für die Stromimpulse (Abb. 8A) und die Spannung Antworten (Abbildung 8 b) aus einem LAL Faser unter Strom-Klammer aus einem 12 Wochen alten Wildtyp R6/2-Maus. Das Vorhandensein von mEPPs zeigt, dass diese Aufzeichnungen aus der motorischen Endplatte aufgenommen wurden. Die Aufzeichnungen wurden in normaler physiologischer Kochsalzlösung erhalten. Dieser Strom-Clamp-Date...

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen verwendet die Maus Levator Auris Longus (LAL) Muskeln, um spontan aufnehmen und Nerv-evozierten postsynaptischen Potenziale (Strom-Klemme) und Ströme (Voltage-Clamp) an der neuromuskulären Synapse. Diese Technik können wichtige Einblicke in die Mechanismen der synaptischen Übertragung unter normalen und Krankheit darstellen.

Levator Auris Longus Prüfungsvorbereitung der Säugetier-neuromuskulären Übertragung unter Spannung Klemme Bedingungen

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Musculus levator auris longus und seinen Nerv zu isolieren, um synaptische Ströme an der neuralen Muskelverbindung aufzuzeichnen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der synaptischen Physiologie zu beantworten, wie z. B. die Stromgröße der Endplatte, den Quantengehalt, die Wahrscheinlichkeit der Freisetzung und die Beziehungen zwischen Neurotransmission und Muskelerregbarkeit. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die detaillierten elektrophysiologischen Aufzeichnungen von einer einzigen Synapse leicht mit optischen Experimenten mit lebenden Zellen kombiniert werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in die synaptische Funktion und die Feedback-Kommunikation zwischen Nerv und Muskel geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die von Drosophila bis hin zu Säugetieren reichen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Vorbereitung der Nervenmuskulatur von Säugetieren zerbrechlich ist, insbesondere der Nerv. Die sorgfältige Erfassung und Interpretation der nachfolgenden Spannungsklemmendaten kann ebenfalls eine Herausfor

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Forschung

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Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

Die Anwendung der Elektrophysiologie, barrierefreie Synapsen eine quantifizierbare Messung der synaptischen Aktivität, nützlich bei der Analyse synaptischer Mutanten. Dieser Artikel beschreibt ein Dissektion Methode verwendet, um die motorischen Endplatten (NMJ) von...

Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

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Historische Ansicht und Physiologie Demonstration am NMJ der Crayfish Opener Muscle

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Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

Dieses neue Verfahren erlaubt die gleichzeitige intrazelluläre Aufnahme eines einzigen erwachsenen Maus Motoneuron und die Messung der Kraft, die von seiner Muskelfasern hergestellt. Die kombinierte Untersuchung der elektrischen und mechanischen Eigenschaften der Motoreinheiten in normalen und genetisch modifizierten Tieren ist ein Durchbruch für das Studium des neuromuskulären Systems.

Gleichzeitige Intrazelluläre Aufnahme eines Lumbar Motoneuron und dem Force durch seine Motor Unit in der adulten Maus Produziert<em&gt; In vivo</em

Eine funktionale Bewertung der neuromuskulären Synapse (NMJ) kann wesentliche Informationen über die Kommunikation zwischen Muskeln und Nerven. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die NMJ und Muskel Funktionalität mit zwei verschiedenen Muskel-Nerv-Präparate, d.h. Soleus-Ischias und Membran-Phrenicus umfassend zu bewerten.

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Axonalen Erregbarkeit Techniken bieten ein leistungsfähiges Werkzeug zur Prüfung Pathophysiologie und biophysikalische Veränderungen, die irreversible degenerative Ereignisse vorausgehen. Diese Handschrift zeigt den Einsatz dieser Techniken auf der ulnaren Nerv anästhesierten Ratten.

In Vivo Elektrophysiologische Messungen der Ratte ulnaris mit axonalen Erregbarkeit testen

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Registrierung von Kalziumtransienten in neuromuskulären Verbindungen von Mäusen mit hoher zeitlicher Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das in vivo Elektroporation und Denervierung des kranialen Musculus levator auris longus (LAL) kombiniert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die mögliche Rolle von Muskelproteinen bei der Regeneration der neuromuskulären Synapse zu untersuchen.

Kombinierte In vivo Elektroporation und kurzfristige Reinnervation des kranialen Levator Auris Longus Skelettmuskel

Die dynamische Klemmelektrophysiologie kann kausale Zusammenhänge zwischen neuronalen Feuerungsdefiziten und Ionenkanaldysfunktionen herstellen. Wir beschreiben dynamische Clamp-Methoden und -Protokolle in zerebellären Purkinje-Neuronen der Maus und erwähnen nützliche Ressourcen und technische Überlegungen. In einer repräsentativen Studie fügen wir modellierte Natriumleitfähigkeit zu Tsc1-/- Purkinje-Neuronen hinzu, um wiederholtes Feuern zu verhindern.

Dynamische Clamp-Methoden zur Untersuchung der gestörten neuronalen Erregbarkeit im Zusammenhang mit Autismus

Lernen Sie die Präparation des M. levator auris longus bei der Maus zur Aufzeichnung synaptischer Ströme an der neuromuskulären Verbindung. Diese Methode ermöglicht detaillierte elektrophysiologische Einzelzellmessungen zur Untersuchung der synaptischen Übertragung.

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