Levator Auris Longus Prüfungsvorbereitung der Säugetier-neuromuskulären Übertragung unter Spannung Klemme Bedingungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Musculus levator auris longus und seinen Nerv zu isolieren, um synaptische Ströme an der neuralen Muskelverbindung aufzuzeichnen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der synaptischen Physiologie zu beantworten, wie z. B. die Stromgröße der Endplatte, den Quantengehalt, die Wahrscheinlichkeit der Freisetzung und die Beziehungen zwischen Neurotransmission und Muskelerregbarkeit. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die detaillierten elektrophysiologischen Aufzeichnungen von einer einzigen Synapse leicht mit optischen Experimenten mit lebenden Zellen kombiniert werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die synaptische Funktion und die Feedback-Kommunikation zwischen Nerv und Muskel geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, die von Drosophila bis hin zu Säugetieren reichen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Vorbereitung der Nervenmuskulatur von Säugetieren zerbrechlich ist, insbesondere der Nerv. Die sorgfältige Erfassung und Interpretation der nachfolgenden Spannungsklemmendaten kann ebenfalls eine Herausforderung darstellen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Das Verfahren wird von Steve Burke aus meinem Labor vorgeführt. Um diesen Vorgang zu beginnen, machen Sie unter einem Stereo-Präpariermikroskop einen kleinen Schnitt in der Haut auf dem Rücken der Maus auf Höhe der Schulterblätter.

Verwende eine Mikrodissektionsschere. Schneide die Haut über dem Kopf und dem Rücken ab. Ziehen Sie dann die Haut entlang des Schnitts in der Nähe der Schulterblätter nach oben.

Schneiden Sie die Muskeln ab, die dem LAL unterlegen sind, indem Sie am rechten Schulterblatt beginnen. Heben Sie dann das geschnittene Gewebe vorsichtig unmittelbar rechts von der Mittellinie an. Machen Sie einen Schnitt in Richtung des linken Ohrs, indem Sie die Klingen der Schere gegen den Schädel drücken, um mehrere Muskelschichten zu entfernen, die dem linken LAL unterlegen sind.

Vermeiden Sie es, den Nerv zu durchtrennen, der das LAL innerviert, das sich um den Gehörgang wickelt und in die Muskeln auf der medialen Seite des Ohrs eintritt. Fahren Sie mit dem Durchtrennen des Gehörgangs fort und lassen Sie so viel wie möglich vom Nerv haften. Schneiden Sie dann das Fettgewebe hinter dem Gehörgang entlang des ventrolateralen Teils des Ohrs.

Schneiden Sie entlang des linken Schulterblatts, ähnlich wie auf der rechten Seite, um den Muskel vollständig von der Maus zu entfernen. Schneiden Sie dann die Ohrmuschel entlang der Basis ab und lassen Sie den knorpeligen Teil des Ohrs am LAL befestigt. Drehe den Muskel so um, dass die untere Seite nach oben zeigt.

Um den LAL-Muskel zu isolieren, legen Sie das LAL und das umgebende Gewebe in eine Petrischale mit einem Silikonelastomerboden und stecken Sie das präparierte Gewebe an den Boden. Waschen Sie das Tuch häufig in einer physiologischen Kochsalzlösung. Platzieren Sie dann eine Insektennadel durch den Gehörgang, um das Präparat an Ort und Stelle zu halten.

Stecken Sie das verbleibende Gewebe mit kleineren Stiften auf die gegenüberliegende Seite der Mittellinie des LAL. Benutze eine Pinzette. Ziehe die Haut am lateralen Teil des Ohrs vorsichtig nach oben, um den Muskel zu dehnen, und setze eine kleine Nadel durch die Haut.

Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Taschentuch gut an der Schale befestigt ist. Entfernen Sie die Muskeln, die das LAL bedecken und die über das Bindegewebe an das LAL gebunden sind und in der Nähe der Mittellinie besonders angespannt sind. Ziehen Sie anschließend die darüber liegende Muskelschicht nach oben und schneiden Sie das Bindegewebe mit den Klingen in Richtung der zu ziehenden Muskelschicht.

Schneiden Sie bis zu etwa 3/4 des Weges zur Mittellinie in Richtung Mittellinie und entfernen Sie so lange, bis nur noch das LAL übrig bleibt. Achten Sie während des Reinigungsprozesses darauf, dass die Nerven nicht geschädigt werden. Entfernen Sie anschließend einen Teil des verbleibenden Bindegewebes, das das LAL bedeckt, um das Aufspießen der Elektroden zu unterstützen.

Entfernen Sie nur Gewebe, das leicht durchgeführt werden kann, ohne dass das Risiko besteht, dass die LAL dabei beschädigt wird. Um den Nerv zu identifizieren, der das LAL innerviert, berühren Sie die Nerven mit einem Nervenstimulator mit dem Nervenstimulator. Wenn sich der Muskel zusammenzieht, ist der richtige Nerv identifiziert.

Fassen Sie dann vorsichtig das Gewebe in der Nähe des Nervs und trennen Sie den Nerv mit einer Federschere vom Gewebe, das das Ohr umgibt. Um Schäden zu minimieren, lassen Sie den größten Teil des Nervs in etwas umgebendes Gewebe eingebettet, das später verwendet wird, um den Nerv an der Aufnahmeschale zu befestigen. Zu diesem Zeitpunkt kann der Untersucher eine Stunde Pause einlegen, solange das LAL in 20 Millilitern oder mehr einer physiologischen Kochsalzlösung gebadet wird.

Als nächstes lösen Sie den Muskel und übertragen ihn für elektrophysiologische Experimente unter dem Präpariermikroskop auf einen Tischeinsatz. Stecke den Muskel an den Enden und entlang seiner Kante fest. Positionieren Sie den Nerv senkrecht zu den Muskelfasern und stecken Sie ihn durch etwas überschüssiges Gewebe, das am Ende des Nervs intakt geblieben ist, an den Boden der Schale.

Halten Sie das Gewebe immer in einer physiologischen Kochsalzlösung gebadet. Für elektrophysiologische Experimente befestigen Sie die Perfusionskammer mit dem LAL am Mikroskoptisch. Legen Sie die Referenzelektrode in einen mit dreimolaren Kaliumchlorid gefüllten Becher, der über eine Agarbrücke mit der Aufnahmekammer verbunden ist.

Positionieren Sie an dieser Stelle die nervenstimulierende Elektrode auf dem Nerv. Setzen Sie das LAL-Prep 10 Minuten lang 4-Di-2-Asp aus, um eine ausreichende Floreszenz für die Visualisierung der neuromuskulären Verbindung zu erzielen. Tauschen Sie nach 10 Minuten die 4-Di-2-Asp-Lösung gegen die normale Calciumlösung aus.

Füllen Sie in der Zwischenzeit die Glaskapillaren mit den entsprechenden Lösungen für die spannungsmessenden und stromdurchleitenden Elektroden. Klopfen Sie vorsichtig auf die Kapillare, um Luftblasen zu entfernen, und befestigen Sie die gefüllte Kapillare in der Elektrodenhalterung auf dem Kopftisch. Suchen Sie mit einem aufrechten Mikroskop mit Standard-Hellfeld- und Fluoreszenzbeleuchtung mit einem Wasser-Emersionsobjektiv mit geringer Vergrößerung nach einem hellen Band fluoreszierender grüner neuromuskulärer Verbindungen, die senkrecht zu den Muskelfasern entlang der Vorbereitung verlaufen.

Wechseln Sie dann zu einem Wasser-Emersionsobjektiv mit höherer Vergrößerung, um eine neuromuskuläre Verbindung auf der obersten Muskelschicht zu identifizieren und mit Elektrophysiologie zu untersuchen. Positionieren Sie die Elektrode hauptsächlich unter Verwendung eines Hellfelds über der Muskelmembran innerhalb von 100 Mikrometern um die identifizierte neuromuskuläre Verbindung. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für die Stromimpulse und die Spannungsantworten einer LAL-Faser unter der Stromzange einer 12 Wochen alten Wildtyp-R62-Maus

Die Aufzeichnungen wurden in normaler physiologischer Kochsalzlösung gemacht, und das Vorhandensein von mEPPs deutet darauf hin, dass diese Aufzeichnungen von der motorischen Endplatte entnommen wurden. Hier ist eine repräsentative Aufzeichnung eines EPC und zweier mEPCs, die unter Spannungsklemmenbedingungen erhalten wurden. Diese Abbildung zeigt die überlagerten EPCs und mEPCs einer repräsentativen Faser.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Lebendzellbildgebung mit Membranfarbstoffen wie FM143 oder die Histologie durchgeführt werden, um Fragen zur Aufnahme von Vesikeln oder morphologischen Veränderungen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Physiologie, um die synaptische Übertragung und die Nerven-Zell-Kommunikation in Organismen von Drosophila bis hin zu Säugetieren zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den innervierten Musculus levator auris longus isolieren können, um synaptische Ströme an der neuromuskulären Verbindung aufzuzeichnen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie bei der Entfernung des Muskelgewebes, das an das LAL angrenzt, und bei der Isolierung des Nervs große Sorgfalt walten lassen.