Name: Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Erfahren Sie die selektive Laserablation neuronaler Populationen in Zebrafischlarven mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen neuronaler Schaltkreise und Verhaltensweisen.

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Diese Studien wurden durch Zuschüsse vom MEXT, JSPS KAKENHI Zuschuss Zahlen JP25290009, JP25650120, JP17K07494 und JP17H05984 finanziert.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu berichten.

Obwohl der zwei-Photonen-Laser eine hervorragende räumliche Auflösung hat, speziell Abtragen einzelne Neuronen, sollte große Vorsicht genommen werden, um unerwünschte Beschädigungen auf das Hirngewebe durch Hitze zu vermeiden. Der wichtigste Schritt bei der Ablation Experiment soll die optimale Höhe der Laserbestrahlung bestimmen. Unzureichende Bestrahlung schlägt fehl, die Neuronen zu töten. Zu viel Bestrahlung Hitzeschäden wird das umliegende Gewebe, was zu unerwünschten Effekten führt. Optimale Bereich der Laserbestra...

Um zu verstehen wie Verhalten von neuronaler Aktivität im Gehirn entsteht, ist es notwendig, die neuronalen Schaltkreise zu identifizieren, die bei der Erzeugung von diesem Verhalten beteiligt sind. Das Larvenstadium der Zebrabärbling bietet ideale Tiermodell für die Funktion des Gehirns zu studieren mit dem Verhalten verbunden, weil ihre kleine, durchsichtige Gehirne neuronalen Aktivität mit einer zellulären Auflösung in einem breiten Bereich der untersuchen ermöglichen die Gehirn beobachtend Verhalten1. Bildgebung neuronaler Aktivität in bestimmten Nervenzellen ist möglich durch die Erfindung der genetisch codierten Kalzium (Ca) Indikatoren (GECIs) wie GCaMP2geworden. GCaMP transgenen Zebrafisch haben sich als nützlich für Verhalten durch die Durchführung von Ca Bildgebung im Verhalten der Tiere3neuronale funktionskreis zuordnen.
Während Ca Bildgebung Korrelationen zwischen neuronaler Aktivität und Verhalten nachweisen kann, um zu zeigen, Kausalität, Unterdrückung der neuronalen Aktivität und testen ihre Consequence(s) auf das Verhalten sind wichtige Schritte. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, dies zu erreichen: Nutzen der genetischen Mutation, die bestimmte neuronale Schaltkreise4, Ausdruck von Neurotoxinen in spezifischen Neuronen5,6, Verwendung von optogenetische Tools wie Halorhodopsin7, verändert und Laser-Ablation von gezielten Neuronen8,9. Laser-Ablation ist besonders geeignet für die Beseitigung der Aktivität in eine relativ kleine Anzahl von spezifischen Neuronen. Irreversiblen Beseitigung von neuronaler Aktivität durch das Töten von Neuronen erleichtert die Beurteilung Verhaltensstörungen folgen.
Ein interessantes Verhalten, das auf das Larvenstadium im Zebrafisch beobachtet werden können ist Beutefang (Abb. 1A). Dieses optisch geführte, zielgerichtetes Verhalten bietet eine günstige Experimentiersystem für die Untersuchung der Sehschärfe10, antwortauslösung Transformation11,12,13, visuelle Wahrnehmung und Anerkennung von Objekte14,15,16,17,18, und Entscheidungsfindung19. Wie wird Beute erkannt durch Raubtiere und wie Beute Erkennung führt um zu Beute fangen Verhalten wurde eine zentrale Frage in Neuroethologie20. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Rolle der Pretecto Hypothalamus Schaltung von Projektionen aus einem Kern in der pretetto gebildet (Nucleus Pretectalis Superficialis pars Magnocellularis, im folgenden einfach als die pretetto gemerkt), die ILH. Laser-Ablation von der pretetto zeigte sich Beute erfassen Aktivität reduzieren und neuronalen Aktivität in der ILH, die mit der Beute visuelle Wahrnehmung21ist, abzuschaffen. Hier, laser Protokolle für die Durchführung von-Ablation und testen seine Wirkung mit Ca2 + Bildgebung und Verhaltensstörungen Aufnahme im Zebrafisch, die Larven beschrieben werden.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>niedrigschmelzende Temperatur Agarose</td></tr><tr><td>6 cm Petrischale</td><td>FALCON</td><td>Produkt#:351007</td><td></td></tr><tr><td>Präpariernadel</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. Nr. 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop</td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>63X Objektiv</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>ein Epi-Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss Bilderfassungssoftware</td><td></td><td>für konfokale Mikroskope</td></tr><tr><td>Secure-Seal Hybridisierungskammerdichtung, 8 Kammern, 9 mm Durchmesser x 0,8 mm Tiefe</td><td>Molekularsonden</td><td>Katalog # S-24732</td><td>Wird als Aufnahmekammer in Ca-Bildgebungskammern</td></tr> verwendet <tr><td></td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell Bildgebungskammern PCI-A-2.5</td><td>Wird als Verhaltensaufzeichnungskammer</td></tr><tr><td>verwendet Chirurgisches Messer</td><td>MANI</td><td>Ophthalmic knife MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>Modell:C11440-22CU</td><td>eine wissenschaftliche CMOS-Kamera</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Bilderkennungssoftware</td></tr><tr><td>Festplattenaufzeichnungsmodul</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Ein Softwaremodul, das das Speichern von Filmdateien auf einer Festplatte in kurzer Zeit ermöglicht</td></tr><tr><td>SZX7</td><td>Olympus</td><td></td><td>Stereoskop</td></tr><tr><td>DF PL 0,5X</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objektiv für SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>Artikel-Nr. GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOS-Kamera</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ Kamera</td><td>XIMEA</td><td>Artikel-Nr.: MQ042RG-CM</td><td>CMOS-Kamera</td></tr><tr><td>ein Ring LED-Licht</td><td>CCS</td><td>Modell: LDR2-100SW2-LA</td><td>Weiß LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh 32&micro; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-Nr.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Nylon Mesh 13&micro; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-Nr. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Metalldichtung mit 150 Mikron Apertur</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>Metal Seive 75 Mikron Areal</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Food & Gesundheitswesen, Co. Ltd.</td><td></td><td>Trockenhefe aus Bier</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>eine integrierte Entwicklungsumgebung für die Programmierung</td></tr><tr><td>von Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&nbsp;</td><td></td><td>Zwei-Photonen-Laser&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ablation von neuronalen einwohner mit einem zwei-photonen-laser und ihre bewertung mit kalzium imaging und verhaltensstörungen aufnahme in zebrafischlarven

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Um die Rolle einer Subpopulation von Neuronen im Verhalten zu erkennen, ist es wichtig, die Folgen der Blockierung der Aktivität in lebenden Tieren zu testen. Laser-Ablation von Neuronen ist eine wirksame Methode für diesen Zweck, wenn Neuronen mit fluoreszierenden Sonden selektiv beschriftet sind. In der vorliegenden Studie werden Protokolle für Laser Abtrag einer Subpopulation von Neuronen mit ein zwei-Photonen-Mikroskop und Testen ihrer funktionalen und Verhaltensstörungen Folgen beschrieben. In dieser Studie wird Beute Erfassung Verhalten im zebrafischlarven als ein Studienmodell verwendet. Die Pretecto-Hypothalamus Schaltung ist bekannt, dieses optisch getriebene Beute fangen Verhalten zugrunde liegen. Zebrafisch pretetto wurden Laser abgetragen und neuronaler Aktivität in der minderwertigen Lappen des Hypothalamus (ILH; das Ziel der pretectal Projektion) wurde untersucht. Beute Erfassung Verhalten nach pretectal Ablation wurde ebenfalls getestet.

Spezifische Neuronen wurden genetisch beschriftet mit EGFP oder GCaMP6s, deren Ausdruck in Gal4 Linien Gefahren wurden. Eine Gal4 Linie gSAIzGFFM119B wurde verwendet, um einen Kern im pretectal Bereich (magnozelluläre oberflächlichen pretectal Zellkern) und einer Subpopulation der Riechkolben Neuronen zu beschriften. Eine weitere Gal4-Linie, hspGFFDMC76A, wurde verwendet, um die ILH beschriften. Wir Laser-abgetragen pretectal Neuronen bilateral (Abbildung 2<s...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine genetisch beschrifteten Subpopulation von Neuronen durch einen zwei-Photonen-Laser von Zebrafisch-Larven abtragen.

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Wirkung der Laserablation bestimmter Neuronen auf die Aktivität und das Verhalten von Schaltkreisen zu testen. Mit dieser experimentellen Technik können wir die Notwendigkeit von Neuronen in einem Schaltkreis untersuchen, der dem Verhalten zugrunde liegt. Diese Methode kann helfen, unsere Schlüsselfragen im Bereich der Verhaltens- und Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie Beute wahrgenommen wird und wie das gefangene Beuteverhalten durch neuronale Aktivität erzeugt wird.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Neuronen aufgrund der genetischen Markierung dieser Neuronen und der hohen räumlichen Auflösung des Lasers spezifisch abgetragen werden können. Nachdem Sie die Larven aufgezogen und in 2% niedrigschmelzende Agarose gemäß dem Textprotokoll montiert haben, legen Sie die in Agarose eingebetteten Larven unter ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop und starten Sie das Mikroskopiesystem. Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware und klicken Sie auf der Registerkarte Laser auf die Schaltfläche Ein, um den Laser einzuschalten.Warten Sie, bis der Status des Lasers von "Beschäftigt" in "Modus gesperrt" wechselt. Stellen Sie auf der Registerkarte Kanäle die Wellenlänge des Lasers auf 880 Nanometer für die EGFP-Ablation oder 800 Nanometer für die GCaMP-Ablation ein. Wählen Sie das subjektive Objektiv 20X aus, indem Sie den Objektivrevolver manuell bewegen.Klicken Sie dann auf die Registerkarte "Suchen" und dann auf GFP, um die Strahlengänge zu ändern und die Fluoreszenz direkt mit dem Auge anzuzeigen. Zentrieren Sie das Gehirn der Zebrafischlarve im Sichtfeld und klicken Sie dann auf die Registerkarte Erfassung, um zur Zwei-Photonen-Mikroskopie zurückzukehren und die Laserleistung und -verstärkung einzustellen. Um die Bedingung vor der Ablation aufzuzeichnen, klicken Sie auf Z-Stapel, um die Option Z-Stapel auszuwählen.Nachdem Sie sich auf das ventrale Ende des Larvenhirns konzentriert haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Erste einstellen", um die untere Grenze festzulegen, und nachdem Sie sich auf die dorsale Oberfläche des Gehirns konzentriert haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Letzte einstellen", um die obere Grenze festzulegen. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Experiment starten, um die Z-Stapel-Bildaufnahme auszuführen. Wählen Sie als Nächstes das subjektive Objektiv 63X aus, indem Sie den Objektivrevolver manuell bewegen.Klicken Sie dann auf die Registerkarte "Suchen", um zur Epifluoreszenzmikroskopie zu wechseln. Zentrieren Sie die Zellen, die mit dem Auge abgetragen werden sollen, und klicken Sie dann auf die Registerkarte Erfassung, um zur Laserscanning-Mikroskopie zurückzukehren. Legen Sie auf der Registerkarte "Aufnahmemodus" die Bildgröße auf 256 x 256 fest.Klicken Sie auf Live und beobachten Sie die interessierenden Neuronen. Dann, beginnend von der dorsalen äußersten Seite, finden Sie eine Brennebene, in der die zu abtragenden Zellen im Fokus sind. Markieren Sie mit der Regionenfunktion einen kleinen kreisförmigen Bereich von etwa 1/3 der Zellgröße im Durchmesser auf jedem Neuron als ROI.Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 13,9 Sekunden pro 256 x 256 Pixel ein, was einer Laserverweilzeit von ca. 200 Mikrosekunden pro Pixel oder 200 Mikrosekunden pro halbem Mikrometer entspricht. Legen Sie außerdem den Iterationszyklus auf vier Wiederholungen fest. Klicken Sie auf Experiment starten, um die Zeitreihen- und Bleaching-Funktionen auszuführen.Vergleichen Sie das Bild vor der Ablation mit dem Bild nach der Ablation im Zeitreihenzyklus, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz in den Zielzellen verschwunden ist. Verschieben Sie als Nächstes die Fokusebene etwas tiefer und wählen Sie die nächste Fokusebene, in der unablierte Zellen angezeigt werden. Führen Sie die Bleichfunktion wie gerade gezeigt durch und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellen in der interessierenden neuronalen Struktur abgetragen wurden.Überprüfen Sie nach der Ablation die Zellen auf aufgehobene Fluoreszenz und wiederholen Sie die Laserbestrahlung gegebenenfalls. Nach der Bestrahlung müssen die Larven geborgen werden. Machen Sie vorsichtig winzige senkrechte Schnitte in der Agarose um die Larven herum.Warten Sie dann, bis der Fisch von selbst aus der Agarose geschwommen ist, wenn die Betäubung nachlässt. Nach der Kultivierung der Pantoffeltierchen und der Betäubung einer Zebrafischlarve gemäß dem Textprotokoll legen Sie die Larven in Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 2 % und entfernen sofort überschüssige Agarose, so dass die Oberfläche der Agarose leicht konvex aussieht. Richten Sie die Larven mit einer Präpariernadel schnell in eine aufrechte Position ein.Machen Sie dann mit einem chirurgischen Messer ein paar kleine Schnitte in die Agarose, um die Agarose um den Zebrafischkopf herum zu entfernen, die Platz für das Pantoffeltierchen zum Schwimmen schafft. Entfernen Sie vorsichtig die Agarosereste, indem Sie vorsichtig Systemwasser auf die Kammer gießen. Legen Sie als Nächstes ein Pantoffeltierchen in die Aufnahmekammer, das als visueller Reiz dient.Stellen Sie dann die Aufnahmekammer unter ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer wissenschaftlichen CMOS-Kamera ausgestattet ist, und wählen Sie ein 2,5-faches Objektiv aus. Starten Sie die Bildaufnahmeanwendung für die ausgerüstete Kamera. Klicken Sie auf den Sequenzbereich und wählen Sie im Bereich Festplattendatensatz aus.Stellen Sie in den Scan-Einstellungen die Frame-Anzahl auf 900 oder eine andere gewünschte Gesamt-Frame-Anzahl ein. Legen Sie im Aufnahmebereich die Belichtungszeit auf 30 Millisekunden und die Klassierung auf zwei mal zwei fest. Klicken Sie im Aufnahmebereich auf Live, um die Larven in der Kameraansicht zu lokalisieren und zu fokussieren, und klicken Sie dann auf Live stoppen und dann auf die Schaltfläche Start.Speichern Sie den Film im cxd-Format und analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. Nachdem Sie das Verhaltensaufzeichnungssystem eingerichtet und eine Larve gemäß dem Textprotokoll in eine Aufzeichnungskammer gelegt haben, sammeln Sie mit einer Mikropipette 50 Pantoffeltierchen und legen Sie sie in die Aufzeichnungskammer. Um ein Deckglas auf die Aufnahmekammer zu legen, geben Sie einen kleinen Tropfen Wasser auf das Deckblatt, bevor Sie es auf die Wasseroberfläche der Aufnahmekammer legen, um das Eindringen von Luft in die Kammer zu vermeiden.Platzieren Sie die Aufnahmekammer in der Beleuchtungsanlage. Starten Sie dann die Zeitrafferaufnahme mit 10 Bildern pro Sekunde für 11 Minuten. Führen Sie schließlich eine Analyse gemäß dem Textprotokoll durch.In diesem Experiment mit der Gal4-Linie, die Kerne im prätektalen Bereich und eine Subpopulation von Riechkolbenneuronen markiert. Die prätektalen Neuronen wurden bilateral per Laser abliert. Geruchsneuronen wurden als Kontrolle abgetragen.Die Ergebnisse zeigen, dass der Zwei-Photonen-Laser Zielzellen abtragen kann, während benachbarte Neuriten unberührt bleiben. In diesem Experiment wurde die funktionelle Konnektivität von prätektalen Neuronen untersucht, die ihre Axone ipsilateral in Richtung ILH projizieren. Sowohl das Pretectum als auch das ILH zeigten neuronale Aktivität in der proximalen Anwesenheit von Beute, was darauf hindeutet, dass beide neuronalen Aktivitäten visuell gesteuert sind.Die Kalziumbildgebung wurde auch verwendet, um die neuronale Aktivität im Prätektum und die ILH bei Larven zu beobachten, die von prätektalen Neuronen abgetragen wurden. Das linke Prätektum, das laserabliert wurde, zeigte eine verbleibende bis keine neuronale Aktivität. Darüber hinaus zeigte die ipsilaterale ILH eine dramatisch verschobene neuronale Aktivität, was darauf hindeutet, dass der Hauptinput für die ILH vom ipsilateralen Pretectum kommt.Im Gegensatz dazu zeigte das ILH auf der anderen Seite des laserablierten Prätectums eine neuronale Aktivität, die mit der neuronalen Aktivität im ipsilateralen Prätectum vergleichbar ist, was darauf hindeutet, dass das rechte ILH Inputs vom rechten Pretectum empfängt. Einmal gemeistert, kann die Laserablation für jede Zebrafischlarve in etwa einer Stunde durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, nur die Zielneuronen mit der richtigen Laserbestrahlung abzutragen, um Hitzeschäden durch den Laser zu vermeiden.Nach diesem Verfahren kann die Ablation von Neuronen in anderen Hirnarealen wie dem Vorder- oder Hinterhirn durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie diese Neuronen an kognitiven Funktionen oder motorischen Funktionen beteiligt sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Verhaltensneurowissenschaften, um funktionelle neuronale Schaltkreise in Zebrafischmodellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Neuronen im Gehirn von Zebrafischlarven spezifisch laserabgetragen werden können, und die funktionellen und verhaltensbezogenen Konsequenzen beurteilen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Laser äußerst gefährlich sein kann, und halten Sie sich bei der Durchführung dieses Verfahrens immer an die Anweisungen des Herstellers.

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