Name: Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Erfahren Sie die selektive Laserablation neuronaler Populationen in Zebrafischlarven mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen neuronaler Schaltkreise und Verhaltensweisen.

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Diese Studien wurden durch Zuschüsse vom MEXT, JSPS KAKENHI Zuschuss Zahlen JP25290009, JP25650120, JP17K07494 und JP17H05984 finanziert.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu berichten.

Obwohl der zwei-Photonen-Laser eine hervorragende räumliche Auflösung hat, speziell Abtragen einzelne Neuronen, sollte große Vorsicht genommen werden, um unerwünschte Beschädigungen auf das Hirngewebe durch Hitze zu vermeiden. Der wichtigste Schritt bei der Ablation Experiment soll die optimale Höhe der Laserbestrahlung bestimmen. Unzureichende Bestrahlung schlägt fehl, die Neuronen zu töten. Zu viel Bestrahlung Hitzeschäden wird das umliegende Gewebe, was zu unerwünschten Effekten führt. Optimale Bereich der Laserbestra...

Um zu verstehen wie Verhalten von neuronaler Aktivität im Gehirn entsteht, ist es notwendig, die neuronalen Schaltkreise zu identifizieren, die bei der Erzeugung von diesem Verhalten beteiligt sind. Das Larvenstadium der Zebrabärbling bietet ideale Tiermodell für die Funktion des Gehirns zu studieren mit dem Verhalten verbunden, weil ihre kleine, durchsichtige Gehirne neuronalen Aktivität mit einer zellulären Auflösung in einem breiten Bereich der untersuchen ermöglichen die Gehirn beobachtend Verhalten1. Bildgebung neuronaler Aktivität in bestimmten Nervenzellen ist möglich durch die Erfindung der genetisch codierten Kalzium (Ca) Indikatoren (GECIs) wie GCaMP2geworden. GCaMP transgenen Zebrafisch haben sich als nützlich für Verhalten durch die Durchführung von Ca Bildgebung im Verhalten der Tiere3neuronale funktionskreis zuordnen.
Während Ca Bildgebung Korrelationen zwischen neuronaler Aktivität und Verhalten nachweisen kann, um zu zeigen, Kausalität, Unterdrückung der neuronalen Aktivität und testen ihre Consequence(s) auf das Verhalten sind wichtige Schritte. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, dies zu erreichen: Nutzen der genetischen Mutation, die bestimmte neuronale Schaltkreise4, Ausdruck von Neurotoxinen in spezifischen Neuronen5,6, Verwendung von optogenetische Tools wie Halorhodopsin7, verändert und Laser-Ablation von gezielten Neuronen8,9. Laser-Ablation ist besonders geeignet für die Beseitigung der Aktivität in eine relativ kleine Anzahl von spezifischen Neuronen. Irreversiblen Beseitigung von neuronaler Aktivität durch das Töten von Neuronen erleichtert die Beurteilung Verhaltensstörungen folgen.
Ein interessantes Verhalten, das auf das Larvenstadium im Zebrafisch beobachtet werden können ist Beutefang (Abb. 1A). Dieses optisch geführte, zielgerichtetes Verhalten bietet eine günstige Experimentiersystem für die Untersuchung der Sehschärfe10, antwortauslösung Transformation11,12,13, visuelle Wahrnehmung und Anerkennung von Objekte14,15,16,17,18, und Entscheidungsfindung19. Wie wird Beute erkannt durch Raubtiere und wie Beute Erkennung führt um zu Beute fangen Verhalten wurde eine zentrale Frage in Neuroethologie20. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Rolle der Pretecto Hypothalamus Schaltung von Projektionen aus einem Kern in der pretetto gebildet (Nucleus Pretectalis Superficialis pars Magnocellularis, im folgenden einfach als die pretetto gemerkt), die ILH. Laser-Ablation von der pretetto zeigte sich Beute erfassen Aktivität reduzieren und neuronalen Aktivität in der ILH, die mit der Beute visuelle Wahrnehmung21ist, abzuschaffen. Hier, laser Protokolle für die Durchführung von-Ablation und testen seine Wirkung mit Ca2 + Bildgebung und Verhaltensstörungen Aufnahme im Zebrafisch, die Larven beschrieben werden.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>niedrigschmelzende Temperatur Agarose</td></tr><tr><td>6 cm Petrischale</td><td>FALCON</td><td>Produkt#:351007</td><td></td></tr><tr><td>Präpariernadel</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. Nr. 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop</td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>63X Objektiv</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>ein Epi-Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss Bilderfassungssoftware</td><td></td><td>für konfokale Mikroskope</td></tr><tr><td>Secure-Seal Hybridisierungskammerdichtung, 8 Kammern, 9 mm Durchmesser x 0,8 mm Tiefe</td><td>Molekularsonden</td><td>Katalog # S-24732</td><td>Wird als Aufnahmekammer in Ca-Bildgebungskammern</td></tr> verwendet <tr><td></td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell Bildgebungskammern PCI-A-2.5</td><td>Wird als Verhaltensaufzeichnungskammer</td></tr><tr><td>verwendet Chirurgisches Messer</td><td>MANI</td><td>Ophthalmic knife MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>Modell:C11440-22CU</td><td>eine wissenschaftliche CMOS-Kamera</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Bilderkennungssoftware</td></tr><tr><td>Festplattenaufzeichnungsmodul</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Ein Softwaremodul, das das Speichern von Filmdateien auf einer Festplatte in kurzer Zeit ermöglicht</td></tr><tr><td>SZX7</td><td>Olympus</td><td></td><td>Stereoskop</td></tr><tr><td>DF PL 0,5X</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objektiv für SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>Artikel-Nr. GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOS-Kamera</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ Kamera</td><td>XIMEA</td><td>Artikel-Nr.: MQ042RG-CM</td><td>CMOS-Kamera</td></tr><tr><td>ein Ring LED-Licht</td><td>CCS</td><td>Modell: LDR2-100SW2-LA</td><td>Weiß LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh 32&micro; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-Nr.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Nylon Mesh 13&micro; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-Nr. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Metalldichtung mit 150 Mikron Apertur</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>Metal Seive 75 Mikron Areal</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Food & Gesundheitswesen, Co. Ltd.</td><td></td><td>Trockenhefe aus Bier</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>eine integrierte Entwicklungsumgebung für die Programmierung</td></tr><tr><td>von Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&nbsp;</td><td></td><td>Zwei-Photonen-Laser&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ablation von neuronalen einwohner mit einem zwei-photonen-laser und ihre bewertung mit kalzium imaging und verhaltensstörungen aufnahme in zebrafischlarven

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Um die Rolle einer Subpopulation von Neuronen im Verhalten zu erkennen, ist es wichtig, die Folgen der Blockierung der Aktivität in lebenden Tieren zu testen. Laser-Ablation von Neuronen ist eine wirksame Methode für diesen Zweck, wenn Neuronen mit fluoreszierenden Sonden selektiv beschriftet sind. In der vorliegenden Studie werden Protokolle für Laser Abtrag einer Subpopulation von Neuronen mit ein zwei-Photonen-Mikroskop und Testen ihrer funktionalen und Verhaltensstörungen Folgen beschrieben. In dieser Studie wird Beute Erfassung Verhalten im zebrafischlarven als ein Studienmodell verwendet. Die Pretecto-Hypothalamus Schaltung ist bekannt, dieses optisch getriebene Beute fangen Verhalten zugrunde liegen. Zebrafisch pretetto wurden Laser abgetragen und neuronaler Aktivität in der minderwertigen Lappen des Hypothalamus (ILH; das Ziel der pretectal Projektion) wurde untersucht. Beute Erfassung Verhalten nach pretectal Ablation wurde ebenfalls getestet.

Spezifische Neuronen wurden genetisch beschriftet mit EGFP oder GCaMP6s, deren Ausdruck in Gal4 Linien Gefahren wurden. Eine Gal4 Linie gSAIzGFFM119B wurde verwendet, um einen Kern im pretectal Bereich (magnozelluläre oberflächlichen pretectal Zellkern) und einer Subpopulation der Riechkolben Neuronen zu beschriften. Eine weitere Gal4-Linie, hspGFFDMC76A, wurde verwendet, um die ILH beschriften. Wir Laser-abgetragen pretectal Neuronen bilateral (Abbildung 2<s...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine genetisch beschrifteten Subpopulation von Neuronen durch einen zwei-Photonen-Laser von Zebrafisch-Larven abtragen.

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Wirkung der Laserablation bestimmter Neuronen auf die Aktivität und das Verhalten von Schaltkreisen zu testen. Mit dieser experimentellen Technik können wir die Notwendigkeit von Neuronen in einem Schaltkreis untersuchen, der dem Verhalten zugrunde liegt. Diese Methode kann helfen, unsere Schlüsselfragen im Bereich der Verhaltens- und Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie Beute wahrgenommen wird und wie das gefangene Beuteverhalten durch neuronale Aktivität erzeugt wird.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Neuronen aufgrund der genetischen Markierung dieser Neuronen und der hohen räumlichen Auflösung des Lasers spezifisch abgetragen werden können. Nachdem Sie die Larven aufgezogen und in 2% niedrigschmelzende Agarose gemäß dem Textprotokoll montiert haben, legen Sie die in Agarose eingebetteten Larven unter ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop und starten Sie das Mikroskopiesystem. Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware und klicken Sie auf der Registerkarte Laser auf die Schaltfläche Ein, um den Laser einzuschalten.Warten Sie, bis der Status des Lasers von "Beschäftigt" in "Modus gesperrt" wechselt. S

ablation-neuronal-population-using-two-photon-laser-its-assessment

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Dieses Video beschreibt den Beutefang-Assay. Das Video diskutiert die Methode zur Untersuchung des Beutefangverhaltens von Zebrafischlarven nach der Laserablation bestimmter Neuronen.

Beutefang-Assay: Eine Methode zur Untersuchung des Beutefangverhaltens von Zebrafischlarven

Dieses Video beschreibt die Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen mit Hilfe der Zwei-Photonen-Laser-Axotomie und der Beobachtung der axonalen Erholung von Verletzungen.

Zwei-Photonen-Laser-Axotomie: Eine Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen und zur Beobachtung der axonalen Erholung

Dieses Video demonstriert die Methode zur Untersuchung der visuellen Beuteerkennung in transgenen Zebrafischlarven unter Verwendung von Kalziumindikator-basierter Fluoreszenzbildgebung, wobei ihre Neuronen fluoreszierende Kalziumindikatorkomplexe exprimieren.

Analyse der beuteevozierten neuronalen Aktivität in einer transgenen Zebrafischlarve

Quelle: Morsch, M.,  et. al., Auslösen von Zellstress und Zelltod mit konventioneller konfokaler UV-Lasermikroskopie. J. Vis. (2017) In diesem Video untersuchen wir die Technik der hochintensiven UV-Laserablation zur präzisen Ausrichtung und Untersuchung einzelner Neuronen in transgenen Zebrafischen. Wir zeigen, wie man neuronale Reaktionen vorbereitet, immobilisiert und visualisiert, und heben die zelluläre Dynamik von Verletzung und Genesung hervor.

Selektive Einzelneuronen-Laserablation an einer Zebrafischlarve mit einem konfokalen Mikroskop

Quelle: Muto, A., et al. Ablation einer neuronalen Population mit einem Zwei-Photonen-Laser und deren Beurteilung mittels Calcium-Bildgebung und Verhaltensaufzeichnung bei Zebrafischlarven. J. Vis. exp. (2018){{}} In diesem Video,  Es wird ein Zwei-Photonen-Laserablationsverfahren demonstriert, das die selektive Zerstörung von fluoreszierenden Neuronen in Agarose-immobilisierten Zebrafischlarven ermöglicht. Die hochauflösende Bildgebung vor und nach dem Eingriff bestätigt eine effiziente...

Gezielte neuronale Ablation mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in einer Zebrafisch-Larve

Obwohl die peripheren Nervensystem (PNS) in der Lage ist signifikant Reparatur nach Verletzung, ist wenig über die zellulären und molekularen Mechanismen, die dieses Phänomen regeln bekannt. Mit Live-transgene Zebrafisch und einer reproduzierbaren Nervendurchtrennung Assay können wir dynamische Gliazellen Verhalten während Nerv Degeneration und Regeneration zu studieren.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

Laserablation ist eine weit verbreitete Technologie zur Untersuchung der Regeneration in biologischen Systemen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz eines Standard-Laserscanning-Konfokalmikroskops zur Laserablation und anschließender Zeitraffer-Bildgebung regenerierender Interneuromastzellen in der Zebrafisch-Seitenlinie.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von erwachsenen Zebrafischen vor.

Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung der Vorderhirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen

Dieses Protokoll beschreibt einen Zwei-Photonen-Laserablationsansatz, der an Zebrafischlarven durchgeführt wurde und als Modell dient, um die Knochenregeneration und die Auswirkungen der Immunantwort auf die Ablation zu untersuchen.

Zwei-Photonen-Laser-vermittelte Ablation von Osteoblasten in sich entwickelnden Zebrafischlarven

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, um die neuronale Aktivität in Gehirnregionen transgener Zebrafische, die GCaMP-Kalziumindikatoren exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Konfokale Fluoreszenzbildgebung der durch sensorische Stimulation induzierten neuronalen Aktivität bei teilweise gefesselten Zebrafischlarven

Erfahren Sie die selektive Laserablation neuronaler Populationen in Zebrafischlarven mit Zwei-Photonen-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen neuronaler Schaltkreise und Verhaltensweisen.

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven (Video) | JoVE Journal

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

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