Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Wirkung der Laserablation bestimmter Neuronen auf die Aktivität und das Verhalten von Schaltkreisen zu testen. Mit dieser experimentellen Technik können wir die Notwendigkeit von Neuronen in einem Schaltkreis untersuchen, der dem Verhalten zugrunde liegt. Diese Methode kann helfen, unsere Schlüsselfragen im Bereich der Verhaltens- und Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie Beute wahrgenommen wird und wie das gefangene Beuteverhalten durch neuronale Aktivität erzeugt wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Neuronen aufgrund der genetischen Markierung dieser Neuronen und der hohen räumlichen Auflösung des Lasers spezifisch abgetragen werden können. Nachdem Sie die Larven aufgezogen und in 2% niedrigschmelzende Agarose gemäß dem Textprotokoll montiert haben, legen Sie die in Agarose eingebetteten Larven unter ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop und starten Sie das Mikroskopiesystem. Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware und klicken Sie auf der Registerkarte Laser auf die Schaltfläche Ein, um den Laser einzuschalten.

Warten Sie, bis der Status des Lasers von "Beschäftigt" in "Modus gesperrt" wechselt. Stellen Sie auf der Registerkarte Kanäle die Wellenlänge des Lasers auf 880 Nanometer für die EGFP-Ablation oder 800 Nanometer für die GCaMP-Ablation ein. Wählen Sie das subjektive Objektiv 20X aus, indem Sie den Objektivrevolver manuell bewegen.

Klicken Sie dann auf die Registerkarte "Suchen" und dann auf GFP, um die Strahlengänge zu ändern und die Fluoreszenz direkt mit dem Auge anzuzeigen. Zentrieren Sie das Gehirn der Zebrafischlarve im Sichtfeld und klicken Sie dann auf die Registerkarte Erfassung, um zur Zwei-Photonen-Mikroskopie zurückzukehren und die Laserleistung und -verstärkung einzustellen. Um die Bedingung vor der Ablation aufzuzeichnen, klicken Sie auf Z-Stapel, um die Option Z-Stapel auszuwählen.

Nachdem Sie sich auf das ventrale Ende des Larvenhirns konzentriert haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Erste einstellen", um die untere Grenze festzulegen, und nachdem Sie sich auf die dorsale Oberfläche des Gehirns konzentriert haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Letzte einstellen", um die obere Grenze festzulegen. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Experiment starten, um die Z-Stapel-Bildaufnahme auszuführen. Wählen Sie als Nächstes das subjektive Objektiv 63X aus, indem Sie den Objektivrevolver manuell bewegen.

Klicken Sie dann auf die Registerkarte "Suchen", um zur Epifluoreszenzmikroskopie zu wechseln. Zentrieren Sie die Zellen, die mit dem Auge abgetragen werden sollen, und klicken Sie dann auf die Registerkarte Erfassung, um zur Laserscanning-Mikroskopie zurückzukehren. Legen Sie auf der Registerkarte "Aufnahmemodus" die Bildgröße auf 256 x 256 fest.

Klicken Sie auf Live und beobachten Sie die interessierenden Neuronen. Dann, beginnend von der dorsalen äußersten Seite, finden Sie eine Brennebene, in der die zu abtragenden Zellen im Fokus sind. Markieren Sie mit der Regionenfunktion einen kleinen kreisförmigen Bereich von etwa 1/3 der Zellgröße im Durchmesser auf jedem Neuron als ROI.

Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 13,9 Sekunden pro 256 x 256 Pixel ein, was einer Laserverweilzeit von ca. 200 Mikrosekunden pro Pixel oder 200 Mikrosekunden pro halbem Mikrometer entspricht. Legen Sie außerdem den Iterationszyklus auf vier Wiederholungen fest. Klicken Sie auf Experiment starten, um die Zeitreihen- und Bleaching-Funktionen auszuführen.

Vergleichen Sie das Bild vor der Ablation mit dem Bild nach der Ablation im Zeitreihenzyklus, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz in den Zielzellen verschwunden ist. Verschieben Sie als Nächstes die Fokusebene etwas tiefer und wählen Sie die nächste Fokusebene, in der unablierte Zellen angezeigt werden. Führen Sie die Bleichfunktion wie gerade gezeigt durch und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellen in der interessierenden neuronalen Struktur abgetragen wurden.

Überprüfen Sie nach der Ablation die Zellen auf aufgehobene Fluoreszenz und wiederholen Sie die Laserbestrahlung gegebenenfalls. Nach der Bestrahlung müssen die Larven geborgen werden. Machen Sie vorsichtig winzige senkrechte Schnitte in der Agarose um die Larven herum.

Warten Sie dann, bis der Fisch von selbst aus der Agarose geschwommen ist, wenn die Betäubung nachlässt. Nach der Kultivierung der Pantoffeltierchen und der Betäubung einer Zebrafischlarve gemäß dem Textprotokoll legen Sie die Larven in Agarose mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 2 % und entfernen sofort überschüssige Agarose, so dass die Oberfläche der Agarose leicht konvex aussieht. Richten Sie die Larven mit einer Präpariernadel schnell in eine aufrechte Position ein.

Machen Sie dann mit einem chirurgischen Messer ein paar kleine Schnitte in die Agarose, um die Agarose um den Zebrafischkopf herum zu entfernen, die Platz für das Pantoffeltierchen zum Schwimmen schafft. Entfernen Sie vorsichtig die Agarosereste, indem Sie vorsichtig Systemwasser auf die Kammer gießen. Legen Sie als Nächstes ein Pantoffeltierchen in die Aufnahmekammer, das als visueller Reiz dient.

Stellen Sie dann die Aufnahmekammer unter ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer wissenschaftlichen CMOS-Kamera ausgestattet ist, und wählen Sie ein 2,5-faches Objektiv aus. Starten Sie die Bildaufnahmeanwendung für die ausgerüstete Kamera. Klicken Sie auf den Sequenzbereich und wählen Sie im Bereich Festplattendatensatz aus.

Stellen Sie in den Scan-Einstellungen die Frame-Anzahl auf 900 oder eine andere gewünschte Gesamt-Frame-Anzahl ein. Legen Sie im Aufnahmebereich die Belichtungszeit auf 30 Millisekunden und die Klassierung auf zwei mal zwei fest. Klicken Sie im Aufnahmebereich auf Live, um die Larven in der Kameraansicht zu lokalisieren und zu fokussieren, und klicken Sie dann auf Live stoppen und dann auf die Schaltfläche Start.

Speichern Sie den Film im cxd-Format und analysieren Sie die Daten gemäß dem Textprotokoll. Nachdem Sie das Verhaltensaufzeichnungssystem eingerichtet und eine Larve gemäß dem Textprotokoll in eine Aufzeichnungskammer gelegt haben, sammeln Sie mit einer Mikropipette 50 Pantoffeltierchen und legen Sie sie in die Aufzeichnungskammer. Um ein Deckglas auf die Aufnahmekammer zu legen, geben Sie einen kleinen Tropfen Wasser auf das Deckblatt, bevor Sie es auf die Wasseroberfläche der Aufnahmekammer legen, um das Eindringen von Luft in die Kammer zu vermeiden.

Platzieren Sie die Aufnahmekammer in der Beleuchtungsanlage. Starten Sie dann die Zeitrafferaufnahme mit 10 Bildern pro Sekunde für 11 Minuten. Führen Sie schließlich eine Analyse gemäß dem Textprotokoll durch.

In diesem Experiment mit der Gal4-Linie, die Kerne im prätektalen Bereich und eine Subpopulation von Riechkolbenneuronen markiert. Die prätektalen Neuronen wurden bilateral per Laser abliert. Geruchsneuronen wurden als Kontrolle abgetragen.

Die Ergebnisse zeigen, dass der Zwei-Photonen-Laser Zielzellen abtragen kann, während benachbarte Neuriten unberührt bleiben. In diesem Experiment wurde die funktionelle Konnektivität von prätektalen Neuronen untersucht, die ihre Axone ipsilateral in Richtung ILH projizieren. Sowohl das Pretectum als auch das ILH zeigten neuronale Aktivität in der proximalen Anwesenheit von Beute, was darauf hindeutet, dass beide neuronalen Aktivitäten visuell gesteuert sind.

Die Kalziumbildgebung wurde auch verwendet, um die neuronale Aktivität im Prätektum und die ILH bei Larven zu beobachten, die von prätektalen Neuronen abgetragen wurden. Das linke Prätektum, das laserabliert wurde, zeigte eine verbleibende bis keine neuronale Aktivität. Darüber hinaus zeigte die ipsilaterale ILH eine dramatisch verschobene neuronale Aktivität, was darauf hindeutet, dass der Hauptinput für die ILH vom ipsilateralen Pretectum kommt.

Im Gegensatz dazu zeigte das ILH auf der anderen Seite des laserablierten Prätectums eine neuronale Aktivität, die mit der neuronalen Aktivität im ipsilateralen Prätectum vergleichbar ist, was darauf hindeutet, dass das rechte ILH Inputs vom rechten Pretectum empfängt. Einmal gemeistert, kann die Laserablation für jede Zebrafischlarve in etwa einer Stunde durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, nur die Zielneuronen mit der richtigen Laserbestrahlung abzutragen, um Hitzeschäden durch den Laser zu vermeiden.

Nach diesem Verfahren kann die Ablation von Neuronen in anderen Hirnarealen wie dem Vorder- oder Hinterhirn durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie diese Neuronen an kognitiven Funktionen oder motorischen Funktionen beteiligt sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Verhaltensneurowissenschaften, um funktionelle neuronale Schaltkreise in Zebrafischmodellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Neuronen im Gehirn von Zebrafischlarven spezifisch laserabgetragen werden können, und die funktionellen und verhaltensbezogenen Konsequenzen beurteilen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Laser äußerst gefährlich sein kann, und halten Sie sich bei der Durchführung dieses Verfahrens immer an die Anweisungen des Herstellers.