Name: Präklinische Bewertung der Bioaktivität der Anti-Krebs Cumarin OT48 Sphäroide, Kolonie Bildung Assays und Zebrafisch Xenotransplantate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie die präklinische Bewertung von Cumarin OT48 gegen Krebs mittels 3D-Sphäroiden, Koloniebildungsassays und Zebrafisch-Xenotransplantaten. Diese Methode liefert mechanistische Einblicke in die Wirksamkeit neuer Wirkstoffe.

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Forschung an der SNU wird unterstützt durch die National Research Foundation (NRF) von MEST Korea für Tumor Mikroumgebung Global Core Research Center (GCRC) Zuschuss, [Grant-Nummer 2011-0030001]; von der Seoul National University Research Grant und Gehirn Korea (BK21) PLUS Programm.

(1) Kolonie Bildung Assays
<ol><li>Kultur A549 Zellen in einer Konzentration von 20.000 Zellen/cm2 in 15 mL RPMI1640 Zelle Kulturmedium ergänzt mit 10 % FBS (fetale Rinderserum) und 1 % Antibiotika in einem 75 cm2 Kolben in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>Am Tag des Experiments bestimmen Sie die Zellkonzentration mithilfe eines Hemocytometer. Sammeln Sie 50.000 Zellen durch Zentrifugation bei 400 X g für 7 min in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auszusetzen Sie Zellen in 100 µL 1 X sterile PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) in 1,5 mL Röhrchen wieder.</li>
	<li>1,1 mL halbfeste Methylcellulose-basierte Medium (MCBM) in 15 mL Tuben mit einer Multipipette zu verzichten. Bereiten Sie eine Röhre für jede Bedingung.</li>
	<li>1,1 mL MCBM mit einer Mikropipette P200 fügen Sie 110 µL FBS hinzu.</li>
	<li>Samen Zellen bei 1.000 Zellen/mL. 2.4 µL Zellsuspension aus der Stammlösung (50.000 Zellen in 100 µL 1 X PBS) sammeln mit Hilfe einer Mikropipette P2 und hinzufügen auf 1,1 mL MCBM ergänzt mit 10 % FBS.</li>
	<li>Nach dem Hinzufügen der Zellen Wirbel die Röhren für 1 min, hielt sie vertikal mit der höchsten Geschwindigkeit MCBM und Zellen gut mischen.</li>
	<li>Fügen Sie Testverbindungen (OT48 allein oder in Kombination mit A1210477). Bereiten Sie einen separaten Schlauch als Steuerelement für das Lösungsmittel verwendet (hier Dimethyl Sulfoxid (DMSO)). Abhängig von der Konzentration der Verbindungen und die Lautstärke für jede Bedingung hinzugefügt beinhaltet das Lösungsmittel-Steuerelement die höchste Konzentration an Lösungsmittel verwendet für die Verdünnungen der Testverbindung für Beeinträchtigungen durch das Lösungsmittel zu bewerten.</li>
	<li>Vortex-Rohre für 1 Minute.</li>
	<li>Fügen Sie für jede Probe 1 mL der Mischung mit einer Mikropipette P1000 auch ein 12-Well Zellplatte Kultur Zentrum hinzu.</li>
	<li>Füllen Sie leere Brunnen mit 1 mL sterilem Wasser oder 1 X PBS, Luftfeuchtigkeit zu stabilisieren.</li>
	<li>10 Tage im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren Sie Kultur Platten.</li>
	<li>Fügen Sie nach 10 Tagen Inkubation 200 µL der Stammlösung ein MTT-(Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid) (5 mg/mL) in jede Vertiefung, eine Endkonzentration von 1 mg/mL zu erreichen.</li>
	<li>Inkubieren Sie 10 min. im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Tragfähige Kolonien schaltet sich violett.</li>
	<li>Erfassen Sie das Abbild mit einer Digitalkamera mit der weiße Hintergrundplatte (LAS weißen Dia Tray). Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Methode, zu digitalisieren; Exposition Art, Präzision; Belichtungszeit, Handbuch, 1 Sekunde; Empfindlichkeit/Auflösung, hohe Auflösung. Speichern Sie das Bild im TIFF-Format.</li>
	<li>Quantifizieren Sie tragfähige Kolonien mit ImageJ-Software. Menü "Auswahl" "Bild | Typ | 8-Bit". Menü "Auswahl" "Adjust | Threshold". Festlegen Sie Schwellenwert, zu kontrollieren und halten Sie für alle Bedingungen konstant zu; Menü "Auswahl" "Analyze | Analysieren Sie Partikel". Daten speichern und analysieren mit einer Statistik-Software für grafische Darstellung.</li>
</ol>(2) Sphäroid Bildung Assay
<ol><li>Kultur A549 Zellen in einer Konzentration von 20.000 Zellen/cm2 in 75 cm2 Fläschchen mit 15 mL RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika ergänzt.</li>
	<li>Am Tag des Experiments, bereiten eine 96 gut U-Bodenplatte.</li>
	<li>Platte 10.000 Zellen in einen Brunnen, der bereits die Verbindung von Interesse (hier 50 µM der OT48) bzw. 20 µM A1210477 enthält. Die letzte Lautstärke zu 100 µL Zellkulturmedium. Die Anzahl der Zellen, die einheitliche Sphäroide mit eine intakte äußere Begrenzung gilt als ausreichend, um Form Sphäroide.</li>
	<li>3 Tage im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Nach 3 Tagen Inkubation die Aufnahmen von der Sphäroide mit einem Lichtmikroskop mit 4 X Vergrößerung.</li>
</ol>(3) Zebrafisch Xenograft-Assay
Hinweis: Dieser technische Ansatz ist als ein Schaltplan (Abbildung 1) visualisiert.
<ol><li>
Vorbereitung der Lager Reagenzien
	<ol>
<li>Bereiten Sie 1 L 30 x Danieaus Lösung: 1740 mM NaCl, KCl 21 mM, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2und 150 mM HEPES. Der pH-Wert des Puffers bis 7.6 mit dem pH-Meter passen.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 % (50 X) Tricaine Lösung: 20 mg Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate (Tricaine) in 2 mL destilliertem Wasser auflösen.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 % Phenol Red-PBS-Lösung: Add 2 µL Phenol rot Natrium-Salz-Lösung zu 198 µL sterilisierte PBS-Lösung in einem 1,5 µL Rohr.</li>
		<li>3 % Methylcellulose vorbereiten: 100 mL 1 x Danieaus Lösung 3 g von Methylcellulose hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zebrafisch-Ei-Produktion und Inkubation
	<ol>
<li>Trennen eines weiblichen und eines männlichen Zebrafisch in eine Partition Tank gefüllt mit UV-sterilisiert und gefiltertes Leitungswasser bei 28,5 ° C im Dunkeln. Nach 24 Stunden der Trennung mix Fisch beider Geschlechter, Paarung zu initiieren. Übertragen Sie befruchtete Eier aus der Paarung Tank auf einer Petrischale mit 5 mL frischem Danieau Lösung.</li>
		<li>Waschen Sie Eier dreimal mit 5 mL Danieau Lösung. Aspirieren Sie für das Waschen sorgfältig die Eier mit einer Pipette und Transfer zum 5 mL frische Lösung. 8 h bei 28,5 ° c inkubieren<ol>
<li>Ändern Sie nach 8 h Inkubation in Danieau Lösung in Danieau Lösung mit 0,03 % 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU), Pigmentierung zu hemmen. Aussortieren von undurchsichtigen Eier (unbefruchtete oder mit unbebauten Embryonen) um Verunreinigungen zu verhindern.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embryo-dechorionation
	<ol>
<li>24 h post Düngung (hpf), Dechorionate Zebrafisch-Embryonen mit scharfen Pinzette. Schraffur Embryonen in Danieau Lösung mit 0,03 % inkubieren PTU bei 28,5 ° C bis 48 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verbindung-behandelten Zellen Vorbereitung
	<ol>
<li>Samen A549 Zellen bei 20.000 Zellen/cm2 in 25 cm2 Kulturflaschen. Nach 24 Stunden der Aussaat Verbindungen hinzufügen (hier OT48 bei 50 µM und/oder A1210477 bei 20 µM) für 24 Std. im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2. Richten Sie die Behandlungszeit für jede Verbindung die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, sondern in Richtung Zelltod zu begehen. Dieser Zeitpunkt muss individuell anhand der Zellviabilität, Morphologie und molekulare Marker eingerichtet werden.</li>
		<li>2 h vor dem Ende der Behandlung, Farbstoff Fleck Zellen mit 4 µM fluoreszierende Zelle Tracker CM-Dil bei 37 ° C und 5 % CO2. Nach 2 h Inkubation trypsinize Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA und 106 Zellen in 50 µL Phenol Red-PBS-Lösung vor der Injektion zu verdünnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mikro-Injektion von Krebszellen für Xenograft-Bildung
	<ol>
<li>Zebrafisch eine 0,02 % Tricaine Lösung für 5 min zu betäuben, bis sie auf einer nährbodenplatte niederzulassen.</li>
		<li>Ziehen Sie eine 1,0 mm (außen Durchmesser (OD) Glas Kapillare) von einer Mikropipette Abzieher (Programm-Einstellungen: P: 300, Hitze: 260, ziehen: 60, VEL: 50 und Zeit: 200). Schneiden Sie die Microcapillary mit einer Spritze, eine scharfe Kante zu produzieren. Laden mikrokapillaren mit 20 µL der Zelle/Phenol Red-PBS-Lösung. Einspritzdruck und Uhrzeit einstellen, um zu verzichten, 2 nL pro Injektion.</li>
		<li>Injizieren von 100 – 200 Zellen in dem Dottersack durch Injektion 6 bis 10 nL über 3 bis 5 Injektionen. Können Sie nach der Injektion Fisch für 10 bis 30 min in 5 mL frisches Danieau Lösung mit PTU Lösung wiederherstellen. Versand Fische in 24-Well-Platten mit 1 mL Danieau Lösung mit PTU Lösung und 72 h bei 28,5 ° c inkubieren</li>
		<li>Nach 72 h Inkubationszeit Fisch in einer 0,02 % Tricaine Lösung zu betäuben und auf einem Objektträger mit einem Rückgang von 3 % Methylcellulose zu immobilisieren. 5 X fotografieren durch Fluoreszenzmikroskopie bei einer Wellenlänge von 620 bis 750 nm.</li>
		<li>Quantifizieren Sie die Größe des fluoreszierenden Tumoren von ImageJ-Software. Menü "Auswahl" "Analyze | Maßnahme". Speichern von Werten entspricht das Fluoreszenzsignal und analysieren mit einer Statistik-Software für grafische Darstellung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li>
<li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li>
<li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models%3A+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li>
<li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+3D+culture+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%284-hydroxy-2H-chromen-2-one%29%3A+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406473">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER%2FGolgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li>
<li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Preise der Kolonie Formation mit MCBM erhalten richtet sich nach dem Zelltyp. Für nicht-anhaftende Zellen, wird die Anzahl der Kolonien in der Regel viel höher mit adhärenten Zellen verglichen. Wir beobachteten, dass A549 Zellen nach 10 Tagen 30 bis 40 Kolonien gegründet. Zuvor haben wir für verschiedene Leukämiezellen berichtet, dass die Anzahl der Kolonien zwischen 200 bis 2509ist. Unsere Ergebnisse zeigten, dass OT48 allein keine signifikante Abnahme der Anzahl der Kolonien allein herstellt...

Krebs wird durch zelluläre Mutationen verursacht und folglich biochemischen Signalwege gestört werden, unkontrollierte Zellteilung und Widerstand zum Zelltod auszulösen. Tumoren stören mit physiologischen Funktionen von Verdauungs, Nervensystem, Herz-Kreislauf-Systems und anschließend benachbarte Gewebe1. Trotz umfangreicher Forschungsbemühungen bleibt Krebs die häufigste lebensbedrohliche Krankheit in der Welt2. Präzisions-Medizin wurde als Grundlage für zukünftige Krebstherapie anerkannt. Neue Wirkstoffe werden routinemäßig getestet in Kombination mit vorhandenen Drogen, klinische Outcome zu verbessern.
Eine erhebliche Einschränkung verbunden mit der Entwicklung der neuen effiziente zielgerichtete Therapien ist jedoch das Scheitern von häufig verwendeten Assays, die genaue biologische Ergebnis der Droge Exposition3zu simulieren. Krebs Wirkstoffforschung stützt sich nach wie vor überwiegend auf testen die Wirksamkeit therapeutischer Wirkstoffe in Krebszelllinien kultiviert in 2D Monolayer-Kulturen, die schwer in klinischen Studien4zu validieren sind. Daher gibt es ein wachsendes Interesse, bessere Krebs Modelle zu entwickeln, die die systemeigene Funktionen von Tumoren in Vivo5besser zu imitieren. In den letzten Jahren führte ein zunehmendes Interesse an 3D Culture Modelle die Entwicklung von verbesserten Methoden, 3D Tumor Modelle5zu produzieren.
Hier stellen wir einen Ansatz mit drei verschiedenen 3D Zelle Kulturtechniken zur Verbesserung des Verständnisses der Potenz des Hydroxycoumarin OT486 in Kombination mit BH3-Mimetika vor mehr in Tiefe in Vivo Tests. Unsere Methode besteht darin, Kolonie und SFAs mit einem in Vivo Tumor Bildung Test basiert auf einem Zebrafisch-Modell weiter bestätigen die Wirksamkeit der Kombination von OT48 und BH3-Mimetika in Lungenkrebszellen und überwachen Krebsentwicklung in einer lebendigen verbinden Organismus.
Kolonie-Bildung-Assays sind routinemäßig zur Wirksamkeit der Anti-Krebs-Agents für solide sowie hämatopoetischen Krebsarten zu beurteilen. Der Test bestimmt die Fähigkeit einer Zelle zu vermehren auf unbestimmte Zeit und bilden Kolonien7. Die Wirkung von Anti-Krebs-Agent auf die koloniebildenden Fähigkeit der Zellen wird durch Abnahme der Anzahl und/oder Größe der Kolonien bestimmt.
Sphäroide vertreten in Vitro Tumormodellen und dienen als eine kostengünstige Screening-Plattform für Anti-Krebs-Agenten. Sphäroide sind Aggregate von Zellen in Suspension wachsen oder in einer 3D Matrix eingebettet. Dieser Ansatz ist für Wirkstoff-Screening und Studien von Tumor Wachstum, Vermehrung und Immune Interaktion8verbreitet.
Um die Eigenschaften eines neuen Medikaments vollständig zu verstehen, gilt es in Vivo Experimente auf Nagetiere durchzuführen. Diese herkömmliche Methode ist jedoch teuer und zeitaufwendig. Zebrafisch (Danio Rerio) wurde in den letzten Jahren ein weit studierte Labor-Organismus, der ist billiger und schneller zu erhöhen. Tumoren entwickelt im Zebrafisch repräsentieren eine 3D Zelle Kultur Ansatz aber innerhalb der in Vivo -Einstellung eines Wirbeltier-9.
Insgesamt verwenden wir hier drei verschiedene 3D Culture Ansätze einschließlich aufgewendete, SFAs und Zebrafisch in Vivo Tumorbildung um die Anti-Krebs der Hydroxycoumarin OT48 in einem Lungenkrebs Krebs A549 Zellmodell in Kombination mit BH3-Mimetika unter Beweis zu stellen.

<table><tbody><tr><td><stark>Erforderliche Materialien für Assays zur Koloniebildung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Zellkulturflasche T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS-Lösung</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1,5 ml Röhrchen</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 Well Platte</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Thiazolylblaues Tetrazoliumbromid (MTT-Pulver)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>Erforderliche Materialien für den Sphäroidbildungsassay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Zellkulturkolben T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS-Lösung</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>RT Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra Low Attachemnt 96 Well Platte</td><td>Corning</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikroskopie</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>Erforderliche Materialien für Zebrafisch-Xenotransplantate</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Zellkulturflasche T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Zellkulturflasche T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Zellkulturflasche T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>1,5 ml Röhrchen</td><td>Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS-Lösung</td><td>Hyklon</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Calciumnitrat-Tetrahydrat (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>HEPES-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat (Tricain)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Phenolrotlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil-Farbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>C7001-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Glaskapillare</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Shutter Instrument, USA</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro Loader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskopie</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

präklinische bewertung der bioaktivität der anti-krebs cumarin ot48 sphäroide, kolonie bildung assays und zebrafisch xenotransplantate

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

In Vitro und in Vivo prä-klinischen Screening von neuartiger Therapeutika sind ein wesentliches Instrument in der Drogeentdeckung Krebs. Obwohl menschliche Krebszelllinien therapeutischen Verbindungen in 2D (dreidimensionale) Monoschicht Zellkulturen Rechnung zu tragen, wurden 3D Culture Systeme entwickelt, um die Wirksamkeit von Medikamenten in mehr physiologisch relevanten Modelle zu verstehen. In den letzten Jahren verzeichneten ein Paradigmenwechsel in der präklinischen Forschung, die Potenz der neuen Moleküle in 3D Culture Systeme, genauer imitiert den Tumor Mikroumgebung zu validieren. Diese Systeme den Krankheitszustand zu charakterisieren, in gewissem Sinne mehr physiologisch relevanten und helfen, besser mechanistische Einblicke und Verständnis der pharmakologischen Potenz eines bestimmten Moleküls. Darüber hinaus ist mit dem aktuellen Trend in Vivo Krebs Modelle zu verbessern, Zebrafisch entstanden, als ein wichtiges fest gefügten Modell zu bewerten in Vivo Tumorbildung und Studie die Wirkung von therapeutischen Wirkstoffen. Hier untersuchten wir die therapeutische Wirksamkeit des Hydroxycoumarin OT48 allein oder in Kombination mit BH3-Mimetika in Lunge-Krebs-Zell-Linie A549 mithilfe von drei verschiedenen 3D Culture-Systeme einschließlich der Kolonie Bildung Assays (CFA), Sphäroid Bildung Assay (SFA) und in Vivo Zebrafisch Xenotransplantate.

In Abbildung 2Lungenkrebs Zelllinie, die A549 in MCBM Form Kolonien nach der Behandlung mit OT48 allein oder in Kombination mit BH3 mimetischen A1210477 in den angegebenen Konzentrationen ausgesät wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kombination Anzahl, Größe und Fläche der Kolonien nach 10 Tagen Inkubation deutlich reduziert.
In Abbildung 3A549 Zellen wurden mit OT4...

Hier präsentieren wir Ihnen die präklinische Vorführung von krebsbekämpfende Cumarine mit 3D Culture und Zebrafisch.

Präklinische Bewertung der Bioaktivität der Anti-Krebs Cumarin OT48 Sphäroide, Kolonie Bildung Assays und Zebrafisch Xenotransplantate

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Wirkstoffforschung zu beantworten, um die Anti-Krebs-Wirkung zu identifizieren und einen besseren mechanistischen Einblick in neuartige Moleküle unter Verwendung von in vitro- und in vivo 3D-Kultursystemen zu gewinnen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Vielfalt der pharmakologischen Wirkung von Verbindungen in einem physiologisch relevanteren in vivo-Modell. Zu Beginn werden 20.000 A549-Zellen pro Quadratzentimeter in 15 Milliliter RPMI 1640 Zellkulturmedium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika, in einem 75 Quadratzentimeter großen Kolben abgefüllt.Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Verwenden Sie am Tag des Experiments ein Hämozytometer, um die Zellkonzentration zu bestimmen. Sammeln Sie 50.000 Zellen in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 400 g für sieben Minuten und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern sterilem 1x PBS.Geben Sie mit einer Mehrfachpipette 1,1 Milliliter halbfestes Medium auf Methylcellulosebasis (MCBM) in Röhrchen ab und bereiten Sie ein Röhrchen für jede Bedingung vor. Geben Sie dann 110 Mikroliter FBS in jedes Röhrchen. Sparen Sie anschließend 1000 Zellen pro Milliliter.Pipettieren Sie dann 2,4 Mikroliter der Stammzellenlösung in die Röhrchen von MCBM und FBS. Halten Sie die Röhrchen nach dem Hinzufügen der Zellen senkrecht und wirbeln Sie sie eine Minute lang mit höchster Geschwindigkeit, um das MCBM und die Zellen gründlich zu mischen. Geben Sie nun die Testverbindung OT48 allein oder in Kombination mit A1210477 zu den Proben.Bereiten Sie ein separates Röhrchen zur Kontrolle des verwendeten Lösungsmittels vor, z. B. DMSO. Wirbeln Sie dann die Proben eine Minute lang durch. Pipettieren Sie für jeden Assay einen Milliliter der Mischung in die mittlere Vertiefung einer 12-Well-Zellkulturplatte.Verwenden Sie dann einen Milliliter steriles Wasser oder PBS, um die leeren Vertiefungen zu füllen. Inkubieren Sie die Platten 10 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Geben Sie dann 200 Mikroliter einer MTT-Stammlösung von fünf Milligramm pro Milliliter in jede Vertiefung.Nachdem Sie die Platten zehn Minuten lang inkubiert haben, prüfen Sie, ob lebensfähige Kolonien violett werden. Nehmen Sie mit einer weißen Hintergrundplatte Bilder mit den folgenden Einstellungen auf:Wählen Sie als Methode die Option Digitalisieren. Wählen Sie als Belichtungstyp die Option "Präzision" aus.Wählen Sie für die Belichtungszeit manuell und eine Sekunde aus. Wählen Sie für Empfindlichkeit und Auflösung die Option Hohe Auflösung. Speichern Sie dann die aufgenommenen Bilder im TIFF-Format.Mit der ImageJ-Software können Sie lebensfähige Kolonien quantifizieren, indem Sie das Menü image, type, 8-bit auswählen. Wählen Sie Menü, Anpassung und Schwellenwert aus. Legen Sie den Schwellenwert für die Steuerung fest und halten Sie ihn für alle Bedingungen konstant.Wählen Sie dann das Menü Analysieren, Partikel analysieren. Speichern Sie die Daten und analysieren Sie sie mit einer Statistiksoftware zur grafischen Darstellung. Nach der Aufbereitung der Stammreagenzien gemäß dem Textprotokoll trennen Sie einen weiblichen und einen männlichen Zebrafisch in einem Trennbecken, das mit UV-sterilisiertem und gefiltertem Leitungswasser bei 28,5 Grad Celsius gefüllt ist, und legen Sie sie in die Dunkelheit.Entfernen Sie nach 24 Stunden der Trennung die Trennwand, um die Paarung zu starten. Übertragen Sie befruchtete Eier aus dem Begattungsbecken in eine Petrischale, die fünf Milliliter frische Danios-Lösung enthält. Waschen Sie die Eier mit fünf Millilitern Danios-Lösung dreimal, indem Sie die Eier mit einer Pipette vorsichtig absaugen und in fünf Milliliter frische Lösung umfüllen.Dann brüten Sie die Eier acht Stunden lang bei 28,5 Grad Celsius aus. Wechseln Sie zu Danios-Lösung mit 0,03 % PTU, um die Pigmentierung zu hemmen und undurchsichtige, unbefruchtete Eier auszusortieren, um eine Kontamination zu verhindern. Verwenden Sie 24 Stunden nach der Befruchtung eine scharfe Pinzette, um die Embryonen zu dechorionieren.Inkubieren Sie die Embryonen dann bis zu 48 Stunden nach der Befruchtung in Danios-Lösung mit PTU. Nachdem Sie A549-Zellen ausgesät und 24 Stunden vor Ende der Behandlung mit Verbindungen gemäß dem Textprotokoll inkubiert haben, fügen Sie vier Mikromolaren des fluoreszierenden Zelltracker-Farbstoffs CM-Dil hinzu, um die Zellen zu färben und zwei Stunden lang zu inkubieren. Verwenden Sie nach der Inkubation 0,05 % Trypsin-EDTA, um die Zellen zu trypsinisieren.Verdünnen Sie dann vor der Injektion zehn bis sechste Zellen in 50 Mikrolitern phenolroter PBS-Lösung. Um eine Mikroinjektion von Krebszellen durchzuführen, ziehen Sie eine 1,0 Millimeter große Glaskapillare mit den folgenden Programmeinstellungen:Schneiden Sie die Kapillare mit einer Spritze so ab, dass eine scharfe Kante entsteht. Beladen Sie dann die Mikrokapillare mit 20 Mikrolitern der Zellphenolrotlösung.Nach der Betäubung des Zebrafisches gemäß dem Textprotokoll injizieren Sie 100 bis 200 Zellen in den Dottersack, indem Sie sechs bis zehn Nanoliter über drei bis fünf Injektionen injizieren. Mikroinjektionen sollten sehr sorgfältig und präzise durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das richtige Volumen der Zellen injiziert wird und die Injektionsverletzung minimal ist und der Kohlendioxiddruck optimal ist, um eine Fissur lateral zu vermeiden. Lassen Sie den Fisch nach der Injektion zehn bis 30 Minuten lang in fünf Millilitern frischer Danios-Lösung, die PTU enthält, erholen.Den Fisch mit einem Milliliter Danios PTU-Lösung in 24-Well-Platten umfüllen und 72 Stunden lang bei 28,5 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation, nachdem Sie die Fische gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, immobilisieren Sie sie auf einem Objektträger mit einem Tropfen 3%iger Methylcellulose. Nehmen Sie 5x fluoreszierende Bilder bei einer Wellenlänge von 620 bis 750 Nanometern auf.Verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Größe von Fluoreszenztumoren zu quantifizieren, indem Sie "Analysieren" und "Messen" auswählen. Speichern Sie dann die Fluoreszenzwerte und analysieren Sie sie mit einer Statistiksoftware zur grafischen Darstellung. In diesem Experiment wurde die Lungenkrebszelllinie A549 in MCBM ausgesät, um nach Behandlung mit OT48 allein oder in Kombination mit dem BH3-Mimetikum A1210477 in der hier gezeigten Konzentration Kolonien zu bilden.Die Ergebnisse zeigten, dass die Kombination die Anzahl, Größe und Gesamtoberfläche der Kolonien nach zehntägiger Inkubation signifikant reduzierte. Hier wurden die Zellen nach der Behandlung mit OT48 allein oder in Kombination mit dem BH3-Mimetikum A1210477 unter Verwendung der U-Bodenplattentechnik kugelförmig gebildet. Nach einer dreitägigen Inkubation wurden die Sphäroide abgebildet und quantifiziert sowie 3D-Bilder erstellt.Diese Abbildung veranschaulicht das inhibitorische Potenzial von OT48 und/oder A1210477 auf die Tumorbildung aus der Quantifizierung von fluoreszierenden Tumoren, die bei der Injektion behandelter Zellen in den Dottersack des Zebrafisches erzeugt wurden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Anzahl der Fische für jede Bedingung bei etwa zehn oder mehr zu halten, um die wichtigen Schwankungen zu vermeiden, die die statistische Auswertung der Daten beeinträchtigen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die histologische Analyse durchgeführt werden, um die Expression des Zielproteins in Zebrafisch-Xenotransplantaten zu bestimmen.Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Wirkstoffforschung den Weg, um die Wirksamkeit von Verbindungen in einer In-vivo-Mikroumgebung in Zebrafisch-Xenotransplantaten zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Wirksamkeit von Arzneimitteln in einer 3D-Kulturumgebung validieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Krebsforschung

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Präklinische Bewertung der Bioaktivität der Anti-Krebs Cumarin OT48 Sphäroide, Kolonie Bildung Assays und Zebrafisch Xenotransplantate (Video) | JoVE Journal

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