Generation der menschlichen Nase Epithelzelle Sphäroide für individualisierte Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Studie

Insgesamt besteht das Ziel dieses Verfahrens darin, humane Nasenzell-Sphäroide zu erzeugen, die letztendlich als Assay für funktionelle CFTR-Studien verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Mukoviszidose zu beantworten, wie z. B. die Beurteilung des Ansprechens eines einzelnen Probanden auf CFTR-verändernde Medikamente in einem ex vivo-Modellsystem. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von Sphäroiden in relativ kurzer Zeit aus einer kleinen Nasenzellprobe erzeugt wird, was umfangreiche Tests ermöglicht.

Das Verfahren wird von Lauren Strecker und Jessica Moncivaiz, Technikerinnen aus meinem Labor, vorgeführt. Nach der Verarbeitung und Expansion von humanen Nasenepithel- oder HNE-Zellen auf Feeder-Fibroblasten gemäß dem Textprotokoll ist das zuvor vorbereitete Expansionsmedium, das Differenzierungsmedium, die 0,1%ige Trypsin-EDTA-Lösung und das sterile PBS über 30 Minuten auf Raumtemperatur zu bringen. Verwenden Sie dann 70 % Ethanol, um die Behälter zu reinigen, und bringen Sie sie in eine saubere Biosicherheitswerkbank.

Verwenden Sie in der Biosicherheitswerkbank eine Pasteurpipette, die an einer Vakuumleitung befestigt ist, um das Medium aus der HNE-Kultur abzusaugen und zu entsorgen. Verwenden Sie dann mit einer sauberen serologischen Pipette fünf Milliliter PBS, um das Geschirr zu spülen, indem Sie den Puffer hinzufügen, schwenken und aspirieren. Geben Sie fünf Milliliter 0,1 %ige Trypsin-EDTA-Lösung in die Kultur und stellen Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator zurück.

Überprüfen Sie dann unter einem inversen Mikroskop bei vier bis 10X, ob sich die Zellen von der Schale lösen, rund werden und schweben. Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite der Kulturschale, um die Zellen zu entfernen, und inkubieren Sie die Schale bei Bedarf für weitere fünf Minuten, bis die meisten Zellen abgelöst sind. Geben Sie anschließend mit einer serologischen 10-Liter-Pipette fünf Milliliter Expansionsmedium in die Schale und sammeln Sie die gesamte Flüssigkeit in einem beschrifteten sterilen konischen 50-Milliliter-Röhrchen.

Wenn Zellen nach drei Trypsinisierungsrunden immer noch an der Kulturschale haften, verwenden Sie einen sterilen Zellschaber, um die verbleibenden Zellen vorsichtig freizusetzen, und waschen Sie mit fünf Millilitern Expansionsmedium den Schaber und die Schale und sammeln Sie den Inhalt in demselben beschrifteten konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 360 mal g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und verwenden Sie einen Milliliter Expansionsmedium, um das Zellpellet zu resuspendieren.

Verwenden Sie dann ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Tauen Sie die Basalmembranmatrix gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Eis auf. Trennen Sie eine geeignete Anzahl von differentiell trypsinisierten Passagezellen für eine Endkonzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter der Matrix.

Verwenden Sie für eine Vier-Well-Platte 200.000 Zellen und sammeln Sie sie in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellmischung bei nicht mehr als 360 mal g für fünf Minuten. Saugen Sie dann mit einer Ein-Milliliter-Pipette das Medium vollständig und vorsichtig ab und verwerfen Sie es, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet nicht zu stören.

Halten Sie das Röhrchen mit den Zellen auf Eis, wenn Sie es nicht aktiv anfassen. Verwenden Sie eine Pipettenspitze von einem Milliliter, um 100 Mikroliter der Basalmembranmatrix pro geplanter Vertiefung in die Zellen zu geben. Während Sie die Pipettenspitze nicht vollständig entleeren, um das Eindringen von Luftblasen zu vermeiden, pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen vorsichtig und gründlich zu resuspendieren.

Bewegen Sie sich schnell, um eine Verfestigung der Matrix zu vermeiden. Um 100-Milliliter-Matrix-Aliquots in jede Vertiefung einer IVF-Kulturplatte mit vier Vertiefungen zu säen, schneiden Sie mit einer sauberen Schere die distalen drei bis vier Millimeter von einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab. Pipettieren Sie vorsichtig und langsam einen 100-Mikroliter-Tropfen Zellmatrixmischung in die Mitte jeder Vertiefung und achten Sie darauf, dass der Tropfen kugelförmig bleibt und die Seiten der Vertiefung nicht berührt.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid 30 Minuten lang, bis sie fest ist. Pipettieren Sie dann vorsichtig 500 Mikroliter Differenzierungsmedium in jede Vertiefung und achten Sie darauf, den Matrixtropfen nicht zu stören. Stellen Sie sicher, dass das Medium nur den Tropfen bedeckt und fügen Sie bei Bedarf mehr hinzu.

Um HNE-Sphäroide zu kultivieren, saugen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze vorsichtig das gesamte Medium aus der Vertiefung ab und vermeiden Sie dabei die Matrix, die die Sphäroide zerstört. Geben Sie dann mit einer frischen Pipettenspitze von einem Milliliter vorsichtig 500 Mikroliter Differenzierungsmedium in die Vertiefung um die Matrize herum, ohne die Matrix zu berühren oder zu stören. Inkubieren Sie die Sphäroide weiter und ersetzen Sie das Differenzierungsmedium dreimal wöchentlich, wie gerade gezeigt.

Beurteilen Sie die Morphologie der Sphäroide täglich unter einem inversen Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung. Sphäroide sollten sich innerhalb von drei bis fünf Tagen nach dem Plattieren bilden und innerhalb von etwa 10 Tagen die Reife erreichen. HNEs sollten sich innerhalb von 72 Stunden nach der Aussaat an die Kulturschale anheften und kleine Inseln bilden.

Beispiele für gute und schlechte Inselbildung nach einer Woche sind hier dargestellt. Die Inseln sollten sich im Laufe von 15 bis 30 Tagen ausdehnen, um das Gericht zu bedecken. Innerhalb der ersten drei bis vier Tage der Kultur sollten sich kleine zystische Strukturen in der Matrix zu bilden beginnen und über etwa 10 Tage zu reifen.

Wenn sie mit der beschriebenen Dichte plattiert werden, enthalten erfolgreiche Kulturen 50 bis 100 Sphäroide pro Matrixtropfen. Die Lumen können relativ klar sein wie bei der Wildtyp-CFTR oder mit Zelltrümmern und Schleim gefüllt sein, wie bei CF-Sphäroiden. Die Maskierung zur Abgrenzung der luminalen Fläche der Sphäroide wird in diesen beiden Tafeln demonstriert.

Hier sind Beispiele für schlecht geformte, erfolglose Sphäroidkulturen zu sehen. Wie in diesen Diagrammen aus funktionellen Assays dargestellt, sollten Sphäroide von Probanden mit Wildtyp-CFTR über eine Stunde anschwellen, wenn sie stimuliert werden, und weniger anschwellen oder schrumpfen, wenn sie in Gegenwart des CFTR-Inhibitors inh-172 stimuliert werden. Sphäroide von einem Probanden, der homozygot für F508del-CFTR ist, sollten entweder schrumpfen oder sehr leicht quellen, mit zunehmender Quellung oder weniger schrumpfen, wenn sie pharmakologisch mit den CFTR-Modulatoren VX809 und VX770 korrigiert werden.

Einmal gemeistert, kann die Aussaat von Nasenzell-Sphäroiden in 15 bis 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, saubere Betriebsabläufe innerhalb der Biosicherheitswerkbank aufrechtzuerhalten, um das Risiko einer Probenkontamination zu minimieren und Risiken für Ihre eigene Gesundheit zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Fixierung, Färbung und Mikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Zellmorphologie und -zusammensetzung zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre menschliche Nasenzell-Sphäroide erzeugt, die als personalisierter Assay der CFTR-Funktion verwendet werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit primärem menschlichem Gewebe gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die ordnungsgemäße Verwendung persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.