Name: Generation der menschlichen Nase Epithelzelle Sphäroide für individualisierte Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Erfahren Sie die Generierung von Sphäroiden aus menschlichen Nasenepithelzellen zur Untersuchung der CFTR-Funktion bei Mukoviszidose. Diese Methode ermöglicht personalisierte Tests von CFTR-modulierenden Medikamenten.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Zahl CLANCY14XX0 zu gewähren und durch Cystic Fibrosis Foundation, Gewährungsnummer CLANCY15R0. Die Autoren danken Kristina Ray für ihre Unterstützung bei der Rekrutierung von Patienten und Beaufsichtigung. Die Autoren möchte auch HNE Arbeitsgruppe, unterstützt durch die Cystic Fibrosis Foundation, die Generation von HNE Kultur Funktionen unterstützt: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols Scott Randell, Steve Rowe, G. Marty Solomon und Katherine Tuggle.

<ol><li>Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra043184">Cystic fibrosis.</a> N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).</li>
<li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+chromosome+walking+and+jumping%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).</li>
<li>Anderson, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoside+triphosphates+are+required+to+open+the+CFTR+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel.</a> Cell. 67 (4), 775-784 (1991).</li>
<li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+ion+transport.+Part+one%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Human airway ion transport. Part one.</a> Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).</li>
<li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%3A+an+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).</li>
<li>Accurso, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+VX-770+in+persons+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D-CFTR+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation.</a> N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).</li>
<li>De Boeck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+a+non-G551D+gating+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation.</a> J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).</li>
<li>Moss, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+who+have+an+Arg117His-CFTR+mutation%3A+a+double-blind%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial.</a> Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. , (2015).</li>
<li>Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor+alone+and+combined+with+ivacaftor%3A+preclinical+and+clinical+trial+experience+of+F508del+CFTR+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction.</a> Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CFTR2+Database%22">CFTR2 Database</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.cftr2.org">www.cftr2.org</a> (2017).</li>
<li>Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+for+cystic+fibrosis%3A+establishing+human+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems.</a> Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).</li>
<li>Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+epithelial+cell+models+for+cystic+fibrosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research.</a> Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).</li>
<li>Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biphasic+chamber+system+for+maintaining+polarity+of+differentiation+of+cultured+respiratory+tract+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).</li>
<li>Worthington, E. N., Tarran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+ASL+measurements+and+mucus+transport+rates+in+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).</li>
<li>Van Goor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+the+F508del-CFTR+protein+processing+defect+in+vitro+by+the+investigational+drug+VX-809%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).</li>
<li>Hug, M. J., Tummler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+current+measurements+to+diagnose+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis.</a> J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).</li>
<li>van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+biochemical+analysis+of+CFTR+in+human+rectal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies.</a> Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+correction+of+distinct+CFTR+folding+mutants+in+rectal+cystic+fibrosis+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids.</a> Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).</li>
<li>Dekkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioassay+using+intestinal+organoids+to+measure+CFTR+modulators+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma.</a> J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).</li>
<li>Zomer-van Ommen, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+premature+termination+codon+suppression+by+read-through+agents+in+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids.</a> J Cyst Fibros. , (2015).</li>
<li>Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+and+control+nasal+epithelial+cells+harvested+by+a+brushing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).</li>
<li>Di Lullo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+%26%2334%3Bex+vivo+model%26%2334%3B+contributing+to+the+diagnosis+and+evaluation+of+new+drugs+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otorhinolaryngol+Ital%22%5BJournal%5D)">An &#34;ex vivo model&#34; contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis.</a> Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).</li>
<li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Sci Rep. 7 (1), 7375(2017).</li>
<li>Devalia, J. L., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+and+bronchial+epithelial+cells+in+culture%3A+an+overview+of+their+characteristics+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy+Proc%22%5BJournal%5D)">Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function.</a> Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).</li>
<li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).</li>
<li>Thavagnanam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+epithelial+cells+can+act+as+a+physiological+surrogate+for+paediatric+asthma+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies.</a> PLoS One. 9 (1), e85802(2014).</li>
<li>Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preservation+and+regeneration+of+cilia+on+human+nasal+epithelial+cells+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro.</a> Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+CFTR+function+and+modulation+in+primary+human+nasal+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids.</a> J Cyst Fibros. , (2017).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+downregulation+of+distinct+chloride+channels+in+cystic+fibrosis-affected+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia.</a> PLoS One. 9 (9), e106842(2014).</li>
<li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+airway+surface+dehydration+as+the+initiating+event+in+CF+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease.</a> J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt die Generation des Patienten abgeleitet nasale Sphäroid Zellkulturen in der Lage, eine individuelle, spezifische Modell der CFTR-Funktion zu produzieren. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Prozess, der eng anwesend sein sollten, um Schwierigkeiten zu vermeiden. Zunächst ist eine gute Probe Akquisition von der Nase des Patienten. Eine gute Probe hätte > 50.000 Zellen begrenzt Schleim/Schutt, und seien Sie bereit für die Verarbeitung innerhalb von 4 h (wenn auch Erfolg mit Übernachtung auf dem...

Cystische Fibrose (CF) ist eine fatale, autosomal rezessive Erkrankung, die mehr als 70.000 Menschen weltweit1. Diese lebensverkürzende genetische Krankheit verursacht durch Mutationen in der Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Protein (CFTR)2. CFTR ist Mitglied der Adenosintriphosphat-bindende Kassette Familie und Funktionen als einen Ionenkanal, so dass Bewegung von Chlorid und Bikarbonat über den apikalen Membranen mehrere polarisierte Epithelien einschließlich Magen-Darm-Trakt, Schweißdrüsen, und der Atemwege Baum, unter anderem3,4. Als solche führt dysfunktionalen CFTR zu multisystemischen epitheliale Dysfunktion, mit den meisten Sterblichkeit infolge der Erkrankung der Atemwege-1. In der CF-Lunge, Verlust von CFTR-driven Atemwege Oberfläche flüssig (ASL) Regulierung und Schleim Freisetzung führt zu verdickten Schleim, Atemwegsobstruktion, chronische Infektion und progressive Atemwege Umbau und der Lunge Funktion1,5.
Trotz der Identifizierung der CFTR-Dysfunktion als Ursache der Krankheit Therapien in CF traditionsgemäß auf Milderung der Symptome (z.B., Pankreas-Enzym-Ersatz-Therapie, Atemwege Abstand Therapien)1konzentriert. Dieser Ansatz wurde vor kurzem durch das Aufkommen neuer Therapeutika, genannt "CFTR-Modulatoren,", die auf direkt dysfunktionalen CFTR revolutioniert. Dieser Ansatz hat verlagerte sich die klinischen Landschaft von Symptom-Management, Disease modifying Pflege aber trägt mehrere Einschränkungen6,7,8,9,10. Modulator-Aktivität ist spezifisch für die Protein-Mangel begleiten jede CFTR-Mutation und beschränkt sich auf genetische Populationen11wählen. Diese Einschränkung wird durch die Heterogenität der Protein-Mängel, sondern auch durch die Unmöglichkeit von klinischen Studien in seltenen Mutation Gruppen Gefahren. Darüber hinaus gibt es unter Patienten mit gut untersuchte Genotypen (z.B.F508del/F508del CFTR die häufigsten CFTR-Mutation), große Variabilität in Krankheit Belastung und Modulator Antwort6,7,8 ,9,11.
Um diese beiden Probleme zu überwinden, haben die Ermittler die Verwendung von personalisierten Modelle für präklinische Tests12vorgeschlagen. Dieses Konzept nutzt Patienten-spezifischen Gewebe erzeugen eine individualisierte ex Vivo -Modell-System für zusammengesetzte testen, Vorhersage in Vivo Thema Antwort auf Therapien auf individuelle Weise. Nach der Validierung, könnte ein solches Modell von Ärzten zu Laufwerk Präzision Therapie unabhängig von der zugrunde liegenden CFTR-Genotyp des Patienten verwendet werden.
Menschlichen Bronchien (HBE) Epithelzellen Explant Gewebe entnommen, zum Zeitpunkt der Lungentransplantation etabliert die Möglichkeit eines solchen Modells für CF13,14. HBEs angebaut an ein Air-Liquid-Schnittstelle (ALI) ermöglichen funktionelle CFTR-Quantifizierung direkt durch elektrophysiologische Tests oder indirekt durch Maßnahmen der ASL Homöostase13,15. Dieses Modell ist für das Verständnis von CFTR-Biologie kritisch gewesen und war ein Schlüsselfaktor bei der Entwicklung von CFTR-Modulatoren16. HBE-Modelle sind leider nicht haltbar als personalisierte Modell durch die invasive Art des Erwerbs (Lungen-Transplantation oder bronchiale Bürsten) und Mangel an Proben für Menschen mit seltenen Mutationen oder mildem Krankheitsverlauf. Im Gegensatz dazu Darmgewebe, rektale oder Zwölffingerdarm Gewebeproben entnommen Darm Strommessung (ICM) oder eine Schwellung-basierte organoide Assay einsetzbar für individualisierte CFTR-Funktion17,18, zu studieren 19. organoide Assays, insbesondere sind sehr sensible Modelle von CFTR-Aktivität20,21,22. Beide Modelle sind durch die Gewebe-Quelle (Darmgewebe, während die meisten Krankheit Pathologie Atemwege ist) und die semi-invasive Methode der Erwerb begrenzt. Alternativ haben einige Forscher menschliche Nase (HNE) Epithelzellen, Modell CFTR Restaurierung23,24,25untersucht. HNEs mit Pinsel oder Kürettage bei Patienten jeden Alters sicher geerntet werden kann und wenn ALI, kultiviert rekapitulieren viele Merkmale des HBEs25,26,27,28. HNE Monolayer-Kulturen haben traditionell durch Plattenepithel Transformation und lange Reife29begrenzt. Darüber hinaus berichtet Kurzschluss Strommessungen im HNEs sind kleiner als die in HBEs, was auf ein kleineres Fenster um therapeutische Wirksamkeit25zu erkennen.
Angesichts der Notwendigkeit für eine persönliche, nicht-invasive, Atemwege Gewebekultur-Modell des CFTR-Funktion, haben wir versucht, die Empfindlichkeit eines Schwellung basierende organoide Assays mit nicht-invasiv und Atemwege Artder HNEs zusammenführen. Hier beschreiben wir unsere Methode 3-dimensionale "Sphäroid" Kulturen der HNEs für individualisierte CFTR-Studie in einer Schwellung basierende Assays30zu erzeugen. HNE Sphäroide polarisieren zuverlässig mit der epithelialen Spitze in Richtung Mitte der Kugel oder Lumen. Dieses Modell zahlreiche Merkmale eine geringere respiratorische Epithel rekapituliert und reift schneller als ALI Kulturen. Als eine funktionelle Assay quantifizieren HNE Sphäroide zuverlässig eine Palette von CFTR-Funktion sowie die Modulation in gut untersuchte Mutation Gruppen (z. B.F508del CFTR). Diese Schwellung basierende Assays nutzt die Ion/Salz Transporteigenschaften von CFTR, indirekt messende Flüssigkeit Zustrom in den Sphäroid, wie Wasser apikalen Salz Efflux folgt. Auf diese Weise anschwellen angeregt Sphäroide mit voll funktionsfähigen CFTR robust, während diejenigen mit dysfunktionalen CFTR weniger anschwellen oder schrumpfen. Dies wird durch Bildanalyse von Pre quantifiziert und 1 h nach Stimulation Sphäroide, luminalen Messfläche und Bestimmung der Prozent ändern. Diese Maßnahme kann dann über experimentelle Gruppen zum Bildschirm für die Droge Bioaktivität in Patienten-spezifischen Weise verglichen werden.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Eppendorf Tube</td><td>USA Wissenschaftlich</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>150 mL Filterkolben</td><td>Midsci&nbsp;</td><td>TP99150</td><td>Zum Filtern von Medien</td></tr><tr><td>15 mL Konisches Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td>TP91015</tr><tr><td>1 L Filterkolben</td><td>Midsci&nbsp;</td><td>TP99950</td><td>Zum Filtern von Medien</td></tr><tr><td>35 mm Glasbodenschale</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td>Optional</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AC228420010&nbsp;</td><td>Bereiten Sie eine 100 mM Stammlösung von 22,0 mg in 1 ml DMSO vor</td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>in der Mitte;</td><td>&nbsp; </td><td></td>TP91050</tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td><td>AT-104</td><td>Zellablösungslösung</td></tr><tr><td>Adenin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2786-25G</td><td>Siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-100MG</td><td>Siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>Rinderhirnextrakt (9mg/ml)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4098</td><td>Siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>Ceftazidimhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3809-1G</td><td>Siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>Zellschaber 20 cm&nbsp;</td><td>Mittelmäßig;</td><td></td><td></td>TP99010</tr><tr><td>CFTR Inh172</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3430</td><td>Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von 4,0 mg in 1 ml DMSO</td></tr><tr><td>Cholera Toxin B (aus Vibrio cholerae)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052-.5MG</td><td>Siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>CYB-1</td><td>Medical Packaging Corporation</td><td>CYB-1</td><td>Zytologiebürste</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes&nbsp;</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11330-057</td><td>Basis Mittel; Siehe Tabellen 1 und 2</td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (rekombinantes humanes Protein, frei tierischen Ursprungs)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG6045</td><td>Siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>Epinephrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4250-1G</td><td>Siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scient&nbsp;</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0135-500ML</td><td>16,6 mM Lösung; Siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>TCI America&nbsp;</td><td>E0084</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (Hochleistungs-FBS)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10082147</td><td>Siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886-50</td><td>Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von 4,1 mg in 1 ml DMSO</td></tr><tr><td>Growth Factor-Reduced Matrigel</td><td>Corning, Inc. vor.</td><td>356231</td><td>Corning Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembranmatrix, phenolrotfrei, LDEV-frei, 10 ml.</td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Humane Kollagenlösung, Typ I (VitroCol; 3 mg/ml)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5007-A</td><td>Kollagenlösung</td></tr><tr><td>HyClone (aka FetalClone II)&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30066.03HI</td><td>Siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>StemCell Technologies</td><td>07904</td><td>Siehe Tabellen 1 und 2</td></tr><tr><td>Insulin, humane rekombinante Zinklösung</td><td>Life Technologies</td><td>12585014</td><td>4 mg/ml Lösung; siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>IVF 4-Well-Schale, unbehandeltes</td><td>NUNC (via Fisher Scientific)</td><td>12566350</td><td>4-Well-Platte für Sphäroide; ähnliche Well-Größe wie eine 24-Well-Platte</td></tr><tr><td>MEF-CF1-IRR</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6001G</td><td>Bestrahlte murine embryonale Fibroblasten</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Analysesoftware; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software für ein Angebot</td></tr><tr><td>Olympus IX51 Inverses Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>Abgekündigtes</td><td>bildgebendes Mikroskop. Ersatz: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/&nbsp; für ein Angebot</td></tr><tr><td>Pen</td><td>Strep Life Technologies&nbsp;</td><td>15140122</td><td>Siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>Phsophoryletheanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0503-5G</td><td>Siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>Rhinoprobe</td><td>Arlington Scientific, Inc.</td><td>96-0905</td><td>Nasenkürette</td></tr><tr><td>Slidebook 5.5</td><td>3i, Intelligent Imaging Innovations</td><td>Abgekündigte</td><td>Bildgebungssoftware. Austausch: Diabook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook für ein Angebot</td></tr><tr><td>Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Wasser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschale 100</td><td>Techno Plastic Products</td><td>93100</td><td>Gewebekulturschale zur Expansion</td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>Siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>Transferrin (Humanes Transferrin 0,5 ml)</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>CC-4205</td><td>Siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>Trijodthryonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397-1G</td><td>3,3&prime;,5-Trijod-L-thyronin-Natriumsalz&nbsp; [T3]; Siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>Trypsin aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser-G</td><td>Crescent Chemical (über Fisher Scientific)</td><td>NC0393024</td><td>20 mL lypophilisiertes Pulver; Siehe Tabelle 2</td></tr><tr><td>Vancomycinhydrochlorid aus Streptomyces orientalis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2002-5G</td><td>Siehe Tabelle 1</td></tr><tr><td>VX770</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td>Herstellung einer 1 mM Stammlösung von 0,4 mg in 1 mL DMSO</td></tr><tr><td>VX809</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1565</td><td>Kauf oder Herstellung einer 10 mM Stammlösung von 4,5 mg in 1 ml DMSO</td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid ROCK-Inhibitor</td><td>Enzo LifeSciences&nbsp;</td><td>ALX-270-333-M025&nbsp;</td><td>Siehe Tabelle 1</td></tr></tbody></table>

generation der menschlichen nase epithelzelle sphäroide für individualisierte cystic fibrosis transmembrane leitwert regler studie

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Während die Einführung Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regulator (CFTR) Modulator Arzneimittel Pflege bei zystischer Fibrose (CF) revolutioniert hat, hat das unter der Regie von Genotyp Therapie-Modell derzeit im Einsatz mehrere Einschränkungen. Erste, seltene oder erforschten Mutation Gruppen sind vom endgültigen klinischen Studien ausgeschlossen. Darüber hinaus als zusätzliche Modulator Medikamente auf den Markt kommen, wird es der Modulator-Möglichkeiten für ein individuelles Thema optimieren schwieriger. Diese beiden Probleme richten sich mit dem Einsatz von Patienten abgeleitet, individuelle vorklinische Modellsysteme der CFTR-Funktion und Modulation. Menschlichen nasale Epithelzellen (HNEs) sind eine leicht zugängliche Quelle für Atemwege Gewebe für ein solches Modell. Hier beschreiben wir die Generation eines dreidimensionalen Sphäroid-Modells von CFTR-Funktion und Modulation mit primären HNEs. HNEs sind isoliert von Themen in einem minimal-invasiven Mode, bedingte Neuprogrammierung Bedingungen ausgebaut und in die Kultur der Sphäroid ausgesät. Innerhalb von 2 Wochen nach der Aussaat Sphäroid Kulturen erzeugen HNE Sphäroide, die mit 3', 5'-zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) gefördert werden können-Generierung von Agonisten CFTR-Funktion zu aktivieren. Sphäroid Schwellung wird dann als Proxy CFTR-Aktivität quantifiziert. HNE Sphäroide profitieren Sie von der minimal-invasiven noch Atemwege Ursprung der nasale Zellen um eine zugängliche, personalisierte Modell auf ein Epithel reflektieren Krankheit Morbidität und Mortalität zu erzeugen. Im Vergleich zu den Air-Liquid-Schnittstelle HNE Kulturen, sind Sphäroide relativ schnell zu Reifen, wodurch die Gesamtrate der Kontamination. In seiner jetzigen Form wird das Modell durch niedrigen Durchsatz begrenzt, obwohl dies durch die relative Leichtigkeit der Gewebe Erwerb ausgeglichen. HNE Sphäroide können verwendet werden, um zuverlässig zu quantifizieren und zu charakterisieren, CFTR-Aktivität auf der individuellen Ebene. Eine laufende Studie, binden diese Quantifizierung in Vivo Medikament Antwort bestimmt, ob HNE Sphäroide sind eine wahre präklinischen Prädiktor für die geduldige Beantwortung CFTR-Modulation.

HNEs sollte der Kulturschale beimessen und bilden kleine Inseln von Zellen innerhalb 72 h nach Aussaat; Beispiele für gute und schlechte Insel Formation in einer Woche werden in Abbildung 1A und 1 b, bzw. angezeigt. Diese Inseln sollte erweitert und um das Gericht im Laufe von 15-30 Tagen zu decken. Kleine oder suboptimale Proben können länger dauern und werden oft nicht sinnvoll Sphäroide Ausbeute. Kontamination mit Krankheitserregern wird d...

Hier beschreiben wir eine Methode um dreidimensionale Sphäroid Kulturen der menschlichen nasalen Epithelzellen zu generieren. Sphäroide werden dann Laufwerk Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regulator (CFTR) stimuliert-abhängigen Ion und Fluid-Sekretion, Quantifizierung der Änderung der Sphäroid luminalen Größe als Proxy für CFTR-Funktion.

Generation der menschlichen Nase Epithelzelle Sphäroide für individualisierte Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Studie

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Insgesamt besteht das Ziel dieses Verfahrens darin, humane Nasenzell-Sphäroide zu erzeugen, die letztendlich als Assay für funktionelle CFTR-Studien verwendet werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Mukoviszidose zu beantworten, wie z. B. die Beurteilung des Ansprechens eines einzelnen Probanden auf CFTR-verändernde Medikamente in einem ex vivo-Modellsystem. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine große Anzahl von Sphäroiden in relativ kurzer Zeit aus einer kleinen Nasenzellprobe erzeugt wird, was umfangreiche Tests ermöglicht.Das Verfahren wird von Lauren Strecker und Jessica Moncivaiz, Technikerinnen aus meinem Labor, vorgeführt. Nach der Verarbeitung und Expansion von humanen Nasenepithel- oder HNE-Zellen auf Feeder-Fibroblasten gemäß dem Textprotokoll ist das zuvor vorbereitete Expansionsmedium, das Differenzierungsmedium, die 0,1%ige Trypsin-EDTA-Lösung und das sterile PBS über 30 Minuten auf Raumtemperatur zu bringen. Verwenden Sie dann 70 % Ethanol, um die Behälter zu reinigen, und bringen Sie sie in eine saubere Biosicherheitswerkbank.Verwenden Sie in der Biosicherheitswerkbank eine Pasteurpipette, die an einer Vakuumleitung

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Nasen Epithelzellen, durch oberflächliche Schürf Biopsie der menschlichen Freiwilligen erhalten, werden erweitert und auf Gewebekultureinsätze übertragen. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen an der Luft Flüssigkeit-Grenzfläche angebaut, was Kulturen der Wimper und nicht-Geißelzellen. Differenzierte Nasen epithelialen Zellkulturen bieten tragfähige experimentelle Modelle für die Untersuchung der Schleimhaut der Atemwege.

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

Diese Veröffentlichung demonstriert Methoden zur erfolgreichen Probenahme und Kultivierung der Nasenepithelschleimhaut von Kindern und zur Reprogrammierung dieser Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs).

Pflegen Primäre Nasenepithelzellen von Kindern und umprogrammieren in induzierte pluripotente Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt einen Assay zur Messung der CFTR-Funktion und der CFTR-Modulatorreaktionen in kultiviertem Gewebe von Probanden mit Mukoviszidose (CF). Aus Biopsien gewonnene Darmorganoide schwellen cAMP-getrieben an, eine Reaktion, die bei CF-Organoiden defekt (oder stark reduziert) ist und durch Exposition gegenüber CFTR-Modulatoren wiederhergestellt werden kann.

Forskolin-induzierte Quellung in Intestinale Organoide: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay für Fibrosis Patienten in Cystic Drug Response-Beurteilung

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zur Entwicklung von mukociliären Epithelorganoiden aus tiefen Ektodermzellen, die aus Xenopus laevis Embryonen isoliert sind. Die multipotenten Vorläufer regenerieren epitheliale Kelchenzellvorläufer und ermöglichen eine Live-Tracking der Initiation und Progression der Zellübergänge auf der Oberfläche von Organoiden.

Mukociliäre Epithelorganoide aus Xenopus Embryonal cells: Generation, Culture und High-Resolution Live Imaging

Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, um ein in vitro Organoidmodell aus menschlichen Nasenepithelzellen zu beschreiben. Das Protokoll bietet Optionen für Messungen, die Standardlaborgeräte erfordern, mit zusätzlichen Möglichkeiten für spezielle Geräte und Software.

Kultur und Bildgebung von humanen nasalen Epithelorganoiden

Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Expansion und Differenzierung nasaler Epithelzellen zu organotypischen Atemwegsepithelzellmodellen und die Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz mittels Live-Cell-Bildgebung und maßgeschneiderten Skripten.

Sammlung, Expansion und Differenzierung primärer humaner Nasensepithelzellmodelle zur Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz

Hier beschreiben wir die Isolierung, Amplifikation und Differenzierung von primären humanen Nasenepithelzellen (HNE) an der Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle und ein Biobanking-Protokoll, das es ermöglicht, erfolgreich einzufrieren und dann verstärktes HNE aufzutauen. Das Protokoll analysiert die elektrophysiologischen Eigenschaften differenzierter HNE-Zellen und die CFTR-bezogene Chloridsekretionskorrektur bei verschiedenen Modulatorbehandlungen.

Primäre humane Nasennebenhöhlen: Biobanking im Kontext der Präzisionsmedizin

Jüngste Fortschritte bei humaninduzierten pluripotenten Stammzelldifferenzierungsprotokollen ermöglichen die schrittweise Ableitung organspezifischer Zelltypen. Hier stellen wir detaillierte Schritte zur Erhaltung und Expansion von iPSC-abgeleiteten Atemwegsbasalzellen und deren Differenzierung zu einem mukoziliären Epithel in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen zur Verfügung.

Erzeugung von Atemwegs-Epithelzell-Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Wir präsentieren eine einfache Agarose-Overlay-Plattform, um 3D-mehrzellige Sphäroide mit neuroendokrinen Krebszellen wachsen. Diese Methode bietet eine sehr bequeme Möglichkeit, um die Wirkung von Medikamenten auf die neuroendokrine Tumorzellen zu untersuchen. Es könnte auch uns helfen, die menschliche neuroendokrinen Tumor Sphäroide für die Krebstherapie.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Pulmonale Rehabilitation ist weit verbreitet in der Behandlung von Erkrankungen der Atemwege anerkannt. Ein wichtiger Bestandteil für eine erfolgreiche pulmonale Rehabilitation ist die Einhaltung der empfohlenen Bewegungstraining. Der Zweck der vorliegenden Protokoll ist zu beschreiben, wie die kontinuierliche Daten Tracking-Technologie verwendet werden, um genau zu messen Einhaltung einer vorgeschriebenen aeroben Trainingsintensität werden.

Mit Continuous Data Tracking-Technologie, um die Einhaltung Übung bei pulmonaler Rehabilitation Studieren

Erfahren Sie die Generierung von Sphäroiden aus menschlichen Nasenepithelzellen zur Untersuchung der CFTR-Funktion bei Mukoviszidose. Diese Methode ermöglicht personalisierte Tests von CFTR-modulierenden Medikamenten.

Generation der menschlichen Nase Epithelzelle Sphäroide für individualisierte Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Studie (Video) | JoVE Journal

Generation der menschlichen Nase Epithelzelle Sphäroide für individualisierte Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Studie

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