Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Transgenexpression durch die Verabreichung des chemischen Induktors Tebufenozid zu modulieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zell- und Molekularbiologie zu beantworten, z. B. wann Sie die Expression eines Gens von Interesse zu einem gewünschten Zeitpunkt mit der gewünschten Stärke stimulieren müssen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass durch die Kombination aller für die Transgenexpression erforderlichen Elemente in einem einzigen Vektor die Transgenexpression durch die Verabreichung des chemischen Induktors Tebufenozid stimuliert werden kann.

Nach der Subklonierung der EGFP- oder ANKRD13A-Transgene gemäß dem Textprotokoll sind vier Zellkulturschalen vorzubereiten, die frisch passageierte HEK 293-Zellen in fünf Millilitern DMEM enthalten, die mit fünf bis 10 %igen FBS und Antibiotika ergänzt werden, die im Folgenden als Kulturmedium bezeichnet werden. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen eine Dichte von 50 bis 60 % erreichen, fügen Sie drei Mikroliter Transfektionsreagenz zu 200 Mikrolitern Verdünnungsmittel hinzu, das die DNA enthält.

Nachdem die Reaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde, geben Sie die Mischung zu den HEK 293-Zellen. Verwenden Sie zwei Schalen für die Transfektion und lassen Sie die anderen beiden als Kontrollen unbehandelt. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 12 bis 24 Stunden.

Nach der Inkubation wird Teb zu einer der transfizierten Proben und zu einer der nicht transfizierten Kontrollen gegeben. Lassen Sie die beiden anderen Proben als Versuchskontrollen unbehandelt. Inkubieren Sie die Platten 12 bis 48 Stunden lang.

Wenn Sie den EGFP-Einsatz verwenden, analysieren Sie die EGFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop. Andernfalls verwenden Sie zur Ernte der Zellen für das Immunblotting eiskaltes PBS, um die Zellen zweimal zu spülen. Entfernen Sie sie dann mit einem Zellschaber von der Platte und geben Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Als nächstes drehen Sie die Röhrchen zwei Minuten lang bei 21.000 g und 18 bis 25 Grad Celsius. Dann, nachdem Sie das PBS verworfen haben, fügen Sie 0,5 Milliliter eiskaltes Säugetierprotein-Extraktionsreagenz (M-PER) und Proteaseinhibitor zum Pellet hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen mit mehreren Pipettierungsrunden.

Inkubieren Sie dann die Zellsuspension bei 18 bis 25 Grad Celsius und Raumtemperatur für 15 Minuten. Schleudern Sie das Zelllysat bei 21.000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Übertragen Sie dann den wässrigen Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und analysieren Sie ihn durch Immunblotting mit den entsprechenden Antikörpern.

Um die Teb-Stimuli zu löschen, entfernen Sie das Teb-haltige Kulturmedium aus den Zellen und spülen Sie die Zellen mit vorgewärmtem PBS zweimal aus. Fügen Sie dann einen Milliliter 0,25 % Trypsin/EDTA hinzu und inkubieren Sie die Zellen eine Minute lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 10 Milliliter vorgewärmtes, Teb-freies Kulturmedium zu den Zellen und verwenden Sie einen Zellschaber, um sie zu ernten.

Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Dann drehen Sie die Zellen zwei Minuten lang bei 21.000 g und 18 bis 25 Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Millilitern vorgewärmtem, Teb-freiem Kulturmedium und geben Sie fünf Milliliter der Zellen in drei 60-Millimeter-Frischzellkulturschalen.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 24, 48 bzw. 72 Stunden. Ernten Sie schließlich die Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten und messen Sie die Expressionsniveaus des Transgens mittels Immunblotting. In diesem Experiment, in dem die Aktivität und Dichtheit von pEUI-plus-EGFP untersucht wurde, zeigten Mock-Vektor-Transfektantien unabhängig von der Teb-Behandlung kein Fluoreszenzsignal.

pEUI-plus-EGFP-Transfektantien wurden jedoch zunehmend sensibilisiert gegenüber der zunehmenden Menge an Teb. Noch wichtiger ist, dass pEUI-plus-EGFP-Transfektantien, die nicht mit Teb behandelt wurden, keine nachweisbaren EGFP-Signale hervorriefen. FLAG-getaggte ANKRD13A wurden verwendet, um die Reaktionsfähigkeit von pEUI-plus auf Teb weiter zu validieren.

Wie in diesem Western Blot mit Anti-FLAG-Antikörpern gezeigt wurde, zeigten transfizierte HEK 293-Zellen nach einer 24-stündigen Behandlung mit Teb eine starke ANKRD13A Expression. Darüber hinaus zeigte die Depletion von Teb die Reversibilität des pEUI-plus-Genschalters, da ANKRD13A in Zellen, die ohne Teb kultiviert wurden, nicht mehr nachweisbar war. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass fast das gesamte Experiment unter keimfreien Bedingungen durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie das Tet-On- oder Tet-Off-System, angewendet werden, um zwei unterschiedliche Transgene differentiell zu exprimieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie, die molekulare Physiologie auf zellulärer Ebene zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie der pEUI-plus-Genschaltervektor verwendet werden kann, um die Transgenexpression zu einem gewünschten Zeitpunkt mit der gewünschten Stärke zu induzieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tebufenozid gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Tragen eines Laborkittels, bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.