Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Das übergeordnete Ziel dieser zufälligen Mutagenese ist es, nach Mutationen zu suchen, die das Heterochromatin destabilisieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich des Heterochromatins zu beantworten, wie z. B. Faktoren, die die Bildung und Aufrechterhaltung von Heterochromatin regulieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie spezifisch auf ein gewünschtes Gen für die Mutagenese abzielen kann, auch wenn das Gen essentiell ist.

Bereiten Sie zunächst Hefeextrakt mit Nahrungsergänzungsmitteln oder JA ohne Adenin, Pombe Glutamate Medium oder PMG und PMG ohne Adenin vor, indem Sie die Komponenten wie in dieser Tabelle gezeigt mischen. Nach dem Autoklavieren und ggf. Zugabe von G418 das Medium weitere fünf bis zehn Minuten umrühren. Dann aliquotieren Sie das Medium in 90-Milliliter-Petrischalen und lagern die Platten bei vier Grad Celsius.

Unter Verwendung des klonierten rpt4-positiven mit seinen fünf Prime- und drei Prime-UTRs und stiller Mutation sowie den Primern p5 und p6 und einer speziellen Polymerase, die eine hohe Fehlerrate erzeugen soll, wird eine fehleranfällige PCR in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern durchgeführt. Nach der Erzeugung eines Transformations-Fusions-Konstrukts gemäß dem Textprotokoll werden zehn Milliliter YES-Medium mit Hefe beimpft und mehr als 16 Stunden lang bis zur Sättigung inkubiert. Verwenden Sie 200 Milliliter YES-Medium, um die Zellen auf einen OD600 von 0,2 zu verdünnen, und inkubieren Sie die Kultur bei 30 Grad Celsius unter Schütteln für fünf bis sechs Stunden auf einen OD600 von 0,6 bis 0,8.

Berechnen Sie das Volumen der Zellen, die sich zu OD600 von 30 addieren. Geben Sie dann die Zellen in vier konische 50-Milliliter-Röhrchen und kühlen Sie sie 10 Minuten lang auf Eis. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1050 g und vier Grad Celsius für drei Minuten.

Legen Sie dann die Mikrofuge-Röhrchen mit der Kassetten-DNA und 10 Elektroküvetten auf Eis. Während Sie noch auf Eis sind, entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 15 Milliliter 1,2-molares Sorbit hinzu, schütteln Sie die Röhrchen vorsichtig, um die Zellen wieder zu suspendieren, und zentrifugieren Sie die Zellen dann drei Minuten lang bei 1050 g und vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und führen Sie eine zweite Sorbitolwäsche durch.

Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand zu verwerfen. Suspendieren Sie dann die Zellen wieder und sammeln Sie sie alle in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes fügen Sie 1,2 molaren Sorbit bis zu 2,4 Milliliter hinzu.

Halten Sie die Röhre mit den Zellen auf Eis. Geben Sie dann 200 Mikroliter Sorbit-suspendierte Zellen in ein Röhrchen mit dem Fusions-PCR-Konstrukt, mischen Sie es gut und geben Sie die Probe in eine Elektroküvette. Es ist wichtig, keine übermäßige Menge PCR-Kassette zu verwenden, da dies zu Entladefehlern führen kann.

Elektropopolieren Sie die Zellen mit den folgenden Optionen:Geben Sie 600 Mikroliter 1,2-molares Sorbit zu jeder Elektroküvette für ein Gesamtvolumen von 800 Mikrolitern. Verteilen Sie dann die Zellen auf vier YES-Platten. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius.

Führen Sie dann eine Replik-Beschichtung auf YES plus G418 durch, bevor Sie die Platten weitere drei Tage lang inkubieren. Führen Sie für jede YES plus G418-Platte eine Replik-Beschichtung auf YES ohne Adenin und PMG ohne Adenin-Platten durch. Inkubieren Sie die Nachbildungen der Platten bei 30 Grad Celsius für ein bis zwei Tage, bis einige der Kolonien auf den YES ohne Adeninplatten eine weiße Färbung aufweisen.

Vergleichen Sie JA ohne Adenin und PMG ohne Adeninplatten und wählen Sie Zellen aus, die auf der YES ohne Adeninplatte rosa oder weiß erscheinen und auch auf der PMG ohne Adeninplatte wachsen. Wählen Sie keine Völker ohne Wachstum auf PMG ohne Adenin aus, da es sich um falsch positive Ergebnisse handelt. Pflücken Sie jede Kolonie und geben Sie sie zu 10 Mikrolitern SPZ-Lösung, die 2,5 Milligramm pro Milliliter Zymolyase 100T enthält.

Inkubieren Sie die Bienenvölker dann mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie nach der Inkubation einen Mikroliter dieser Lösung als Ausgangsvorlage für die Kolonie-PCR. Nach der Verdauung ausgewählter Kolonien und der Durchführung der Gelelektrophorese gemäß dem Textprotokoll werden die Kolonien markiert, deren PCR-Produkte mit XHO1 geschnitten wurden, und auf YES plus G418-Platten gepatcht.

Nach der Isolierung der gDNA aus Spalthefezellen und der Sequenzierung der PCR-Produkte gemäß dem Textprotokoll wird die erhaltene Sequenz mit der Wildtyp-Sequenz verglichen, um Mutationen zu identifizieren. Sobald die Mutationen wieder in Wildtyp-Zellen eingeführt wurden, verwenden Sie Spotting, um den Phänotyp in den neu hergestellten mutierten Zellen zu bestätigen. Die rpt4-Mutanten, die mit dem in diesem Video gezeigten Protokoll erzeugt wurden, können analysiert werden, indem die Farben der Kolonien bewertet werden.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, wurden die Kolonien in abnehmender Zellzahl auf den entsprechenden Platten gesichtet. Der in die Heterochromatin-Region eingefügte Adenin-Reporter wird in Wildtyp-Zellen zum Schweigen gebracht und produziert rote Kolonien auf YES ohne Adeninplatten. Sobald das Heterochromatin destabilisiert und der Adeninreporter exprimiert ist, können weiße Kolonien auf dem YES ohne Adeninplatten beobachtet werden, wie bei der clr4-delta-Mutante.

Die gescreenten rpt4-Mutanten sind wie gezeigt, wobei die rpt4-1-Mutante die schwerste Heterochromatin-Destabilisierung aufweist. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei Wochen durchgeführt werden, um die gewünschten Mutanten zu erhalten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Fehlalarme zu eliminieren, da sie häufiger als erwartet auftreten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Proteinaufreinigung und Enzymaktivitätstests durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Art der Proteine. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mutanten in einem Zielgen mit dem gewünschten Phänotyp erzeugt.