Name: Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Lernen Sie eine Ex-vivo-Gehirnschnittmethode mit Rattenhemischnitten zur Untersuchung früher molekularer Veränderungen bei Neurodegeneration. Diese Technik ermöglicht direkte Vergleiche zwischen behandelten und unbehandelten Bedingungen.

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Diese Arbeit wurde von Neuro-Bio Ltd. finanziert. Wir möchten Dr. Giovanni Ferrati und Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) Danke für ihre Kommentare und Ratschläge auf dem Manuskript.

Unter anerkannten Protokolle wurden alle Tierversuche durchgeführt.
Hinweis: In diesem Abschnitt die Reihenfolge der wichtigsten Phasen durchgeführt während der Versuchsdurchführung und der vorgeschlagenen zeitlichen Abstand erfolgt (Abbildung 1). Darüber hinaus wird eine schrittweise Beschreibung des Protokolls ergänzt durch ein Bedienfeld "illustrative", mit kritischen Aktionen von Gehirnentfernung bis hin zu Gewebe Homogenisierung nach der Inkubationszeit (Abbildung 2). Die Details bezüglich der Materialien und die Anweisungen, um das Gerät und die nachfolgende Phase für die WB-Analyse zu bauen sind zuvor beschriebenen22.
(1) chirurgische Werkzeuge, Vibratome Einstellungen und Vorbereitung der Behandlung
Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte vor dem Start der Versuchsdurchführung:
<ol><li>Bereiten Sie zwei unterschiedlichen künstliche Liquor Flüssigkeiten (aCSFs), verwendet für das Schneiden von Gehirn und die andere für die inkubationsschritt29wie zuvor beschrieben. Kurz, die Arbeiten-Konzentrationen (in Mmol) von zwei aCSFs sind für die "schneiden" ACFS: 120 NaCl, 5 KCl, 20 Nahco33, 2,4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4und 10 Glukose; 6.7 HEPES Salz und 3,3 HEPES Säure; pH-Wert: 7,1. Während für die "Aufnahme" ACFS: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 Nahco33, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 KH2PO4und 10 Glukose; pH-Wert: 7,1.</li>
	<li>Die Lösungen gut mischen und dann auf Eis gelegt und slicing ACFS um es Kälte beim Entfernen des Gehirns und das anschließende Schneiden mit Sauerstoff. Halten Sie Sie bei Raumtemperatur (RT) und Versorgungsmaterial Sauerstoff Aufnahme ACFS.</li>
	<li>Legen Sie die Instrumente unter der Dissektion Haube für die Enthauptung und Gehirn entfernen, d. h., Guillotine, chirurgischen Präparation Kit (Schere, Pinzette, Messer) und Spachtel.</li>
	<li>Richten Sie die Vibratome Parameter, indem er die Scheibendicke (300 µm in dieser Zubereitung) und die Häufigkeit von 7 und die Geschwindigkeit, mit 6. Legen Sie die Vibratome Kammer an der entsprechenden Stelle und mit Eis umgeben.</li>
	<li>Öffnen Sie das Carbogen (95 % O2, 5 % CO2) Ventil um das "Aufschneiden" (ACFS) während das Gehirn Schneiden mit Sauerstoff. Wählen Sie die minimale Durchflussmenge um 2 mL/min.</li>
	<li>Nehmen Sie zwei 15-mL-Röhren, die Bedingungen zu testen. Fügen Sie in eine Röhre 10 mL der "Aufnahme" ACFS allein (Kontrollgruppe) und in der anderen 10 mL der "Aufnahme" ACFS angereichert mit T30 in einer Konzentration von 2 µM (behandelten Gruppe). Vortex sowohl Rohre und halten sie auf dem Eis bis zu ihrer Verwendung in der Setup-Vorbereitungsphase (Abschnitt 3).</li>
</ol>(2) Anästhesie, Gehirn-Extraktion und schneiden
Hinweis: In dieser Studie wurden 9 Wildtyp P14 männliche Wistar-Ratten verwendet. Gehirn-Extraktion und anschließende schneiden dar einen wichtigen Bestandteil des Protokolls, da sie schnell (innerhalb von 10 min) erfolgen sollte, um zu verhindern oder zumindest verlangsamen Gewebe Degeneration Prozesse.
<ol><li>Fügen Sie 1,5 mL 100 % w/w von Isofluran auf einer baumwollschicht in die Induktion Kammer hinzu, legen Sie das Tier innen und schließen Sie den Deckel. Warten Sie, bis das Tier tief betäubt ist, bestätigt das Fehlen der Pedal-Reflex, und dann enthaupten Sie das Tier mit der Guillotine zu.</li>
	<li>Halten Sie den Kopf des Tieres in einen Topf mit eiskaltem schneiden ACFS im Gehirn Entfernung Schritt (Abbildung 2A -C).</li>
	<li>Einschneiden der Haut über den Schädel mit einem chirurgischen Klinge, dann schneiden Sie den Schädel mit einer Schere nach der Mittellinie aus dem hinteren Teil und fahren Sie körpertiefe bis zum Erreichen des Knochens über der OBs (Abbildung 2A).</li>
	<li>Ziehen Sie seitlich die beiden Seiten des Schädels mit einer Zange um Zugriff auf das Gehirn (Abb. 2 b) erhalten. Legen Sie einen Spachtel ventral zum Gehirn, schöpfen Sie sanft es aus, und halten Sie es im eiskalten "schneiden" ACFS für ca. 5 min (Abbildung 2) hydratisiert.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Gehirn auf Filterpapier und schneiden Sie das Kleinhirn mit einer Klinge (Abb. 2D). Kleben Sie das Gehirn vertikal auf der Vibratome CD und legen Sie sie in der speziellen Kammer, füllen Sie ihn mit eiskalten "schneiden" ACFS und liefern Sie Sauerstoff (Abb. 2E).</li>
	<li>Passen Sie es schneiden, und fahren Sie mit dem Gehirn-Schnitt (Abb. 2F). Sammeln Sie die Abschnitte mit der Region von Interesse, wie die medialen Scheidewand (MS), Diagonale Band von Broca (DBB) und Substantia Innominata (SI), wie zuvor beschrieben22. Von oben nach unten enthalten die drei Scheiben die rostral (R), Mittelstufe (I) und kaudalen (C) Teil der BF (Abbildung 2).</li>
	<li>Teilen Sie entlang der Mittellinie jeder Abschnitt mit einer kleinen Schere, erhalten zwei spiegelnde Hemislices (Abb. 2 H), einzeln als Kontrolle und behandelten Zustand bei der gleichen anatomischen Ebene verwendet.</li>
	<li>Halten Sie die Hemisections in der Vibratome Kammer für 5-10 min, dann mit einer Glaspipette in einem sprudelnden Topf mit Aufnahme ACFS überführen. Halten Sie bei RT für ca. 30 min zu erholen.</li>
	<li>Füllen Sie in der Zwischenzeit drei Glasfläschchen mit 3 mL Aufnahme ACFS allein (zuvor im Schritt 1.6 für die Kontrollgruppe bereit) und drei Fläschchen mit 3 mL ACFS angereichert mit T30 (zuvor im Schritt 1.6 bereit) für die behandelten Gruppe.</li>
</ol>3. Setup Vorbereitung
<ol><li>Die Hemisections in ihre entsprechenden Glasfläschchen (Abbildung 2I) zu übertragen, um drei aufeinander folgende Hemislices (einschließlich der rostral, zwischen- und kaudalen BF-Region) für die Kontrollgruppe (grüner Rahmen, Abbildung 2J) haben und deren passenden Partnern bei der behandelten Gruppe (roter Rahmen, Abbildung 2J).</li>
	<li>Übertragen Sie das Hirngewebe mit zwei verschiedenen Pinseln, eine für die Steuerung Hemislices und eine weitere für die behandelten Gegenstücke, um eine Kontamination zwischen Bedingungen zu verhindern.</li>
	<li>Jede Glasflasche mit dem entsprechenden Deckel, präsentieren die Sauerstoff Nadel (21G) (Abb. 2J) zu versiegeln. Verbinden Sie das Hauptrohr des Apparates mit Carbogen Quelle (Abbildung 2 K). Sauerstoff für die Hemislices während der Inkubationszeit mit einer minimalen Flussrate von 2 mL/min zu liefern, um jede Bewegung des Hirngewebes und mechanische Beschädigungen während des Versuchs zu vermeiden. Starten Sie die 5 h Inkubation. Führen Sie die Schritte 3.1-3.3 innerhalb von 5 Minuten. Hinweis: Prüfen Sie häufig (alle 15-20 min) ob der Sauerstoff in die Fläschchen versorgt wird und seinen Fluss nicht das Gewebe von unten bewegt.</li>
</ol>4. Probe Homogenisierung
<ol><li>Nach der Inkubation stoppen Sie der Sauerstoffzufuhr zu und entfernen Sie den Deckel aus dem Fläschchen. Übertragen Sie die Hemislices, mit der richtigen Bürsten, in 1,5 mL Röhrchen mit 250 µL Lyse Puffer, Aufrechterhaltung der Rohre auf dem Eis (Abbildung 2 L). Machen die Lyse Puffern, mischen PBS 1 X mit Phosphatase und Protease-Hemmer Cocktails sowohl 1: 100 verdünnt und Homogenisieren des Gewebes mit verschiedenen Stößel, Kontamination zwischen den Proben zu verhindern. Füllen Sie diese Aktionen innerhalb von 10-15 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Gehirn lysate bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Transfer des Überstands in neue Schläuche und halten die Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>5. Lesen der Proteinkonzentration und Western-Blot Analyse
<ol><li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe zu und anschließend bereiten Sie die Aliquote der Western-Blot Analyse als zuvor beschriebenen22 vor.</li>
	<li>Führen Sie statistische Analyse, um die Bewertung der Auswirkungen der Behandlung auf Protein-Expression.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen. Susan A. Greenfield ist der Gründer und Präsident der Neuro-Bio-Limited, ein privat geführtes Unternehmen und hält Anteile an der Gesellschaft. Emanuele Brai und Antonella Cogoni sind Mitarbeiter von Neuro-Bio Ltd.

Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls, basiert auf der bewährten ex Vivo -Gehirn-Technik ermöglicht zwei spiegelnde Hemislices, gewonnen aus der gleichen anatomischen Ebene, Überwachung ihrer Reaktion nach der Anwendung eines bestimmten synchron zu testen Zustand (Steuern oder behandelt); Dies bietet daher eine experimentellere Paradigma so streng kontrolliert wie möglich. Die Möglichkeit der Bewertung in einer Zeit, Dosis und ortsspezifische Weise verschiedene Neurochemikalien, die im Zusammenhang mit neurona...

AD ist eine chronische Krankheit gekennzeichnet durch allmähliche Neurodegenerative Beeinträchtigung beeinflussen verschiedene Hirnareale wie entorhinalen Kortex (EG), BF, Hippocampus (HC) und Riechkolben (OB)1,2,3, 4,5. Im Spätstadium der Entwicklung AD führen zu einem progressive kognitive Rückgang, so dass diese Erkrankung die häufigste Form der Demenz, entfallen etwa 70 % von allen Fällen6. Trotz umfangreicher Versuche zu verstehen, der Anfangsphase verursacht AD ist nicht derzeit eine definierte experimentelle Indikation Aufklärung sie. Darüber hinaus ist die populärste Theorie - "Amyloid-Hypothese" - zunehmend in Frage gestellt, da es nicht bietet ein vollständiges Profil in der Erklärung der AD Pathobiologie, noch eine pharmazeutische Ziel, die wirksame7,8 bewährt hat ,9.
Eine alternative Theorie, die zunehmend Beachtung deutet darauf hin, dass die anfängliche Mechanismen bei der Neurodegeneration zu einem neuronalen Cluster vor allem anfällig in AD3,10,11 zusammenhängen , 12 , 13 , 14. dieser heterogenen zellulären Hub umfasste innerhalb der BF, Mittelhirn und Hirnstamm, Projekte auf mehrere Regionen, wie z. B. die EG, HC und OB15,16. Trotz ihrer Vielfalt in neuronale Morphologie und Neurotransmitter-Synthese teilt diesen Kern der Zellen ein gemeinsames Merkmal im Ausdruck AChE, die auch ein nicht-enzymatische Funktion17,18haben kann. Diese nicht-klassischen Rolle als Roman Signaltechnik Molekül Kalzium (Ca2 +) fließen in Neuronen vermittelt die trophische oder toxische Ereignissen in Bezug auf Ca2 + Dosis, Verfügbarkeit und neuronale Alter17,18 unterzogen werden können , 19.
Während Neurodegeneration die beobachteten zelluläre Verlust daher möglicherweise mit diesem nicht-enzymatische Funktion17,18,20, was auf ein 30mer Peptid (T30) gespalten aus dem C-Terminus AChE zurückzuführen ist 20. im Einklang mit früheren Ergebnissen, geweitermacht Zellkultur und optische Bildgebung18,21 Vorbereitungen, wir unter Beweis gestellt, durch einen neuartigen Ansatz basierend auf ex Vivo Ratte Gehirnscheiben mit BF Strukturen, die induzierte T30 ein AD-ähnlichen Profil22. Insbesondere bietet diese neue Methodik ein physiologischer Szenario als Zellkultur, da es viele der Merkmale von einem intaktem Gewebe von anatomischen bis hin zu Schaltung Konservierung, wenn auch nur für ein Zeitfenster von Stunden unterhält. Wir angewendet dieses Protokoll zur Erkundung der Ereignisse in den frühen Phasen der Neurodegeneration, Überwachung der akuten Reaktion auf T30-Antrag.
Trotz der großen Körper der Literatur auf Gehirn Scheiben zu untersuchen molekulare Signalwege in neuronale Schäden impliziert oder Neurogenese23,24, dieses Protokoll bietet zum ersten Mal eine direktere und Sensitive ausgelesen im Vergleich für die gemeinsame Nutzung von organotypischen Scheiben. Jedoch wie der Fall für organotypischen Gehirn Abschnitte ist, kann dieser akuten Slice-Verfahren auch für verschiedene Zwecke, wie die Auswertung der neuroprotektive oder neurotoxische Moleküle, Entdeckung der primären molekulare Veränderungen in einem bestimmten Prozess angenommen werden, immunhistochemische Analysen und pharmakologischen Tests für zentrale Nervensystem im Zusammenhang mit Krankheiten.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>S7653</td><td>Reagenz für die aCSF-Zubereitung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>P9333</td><td>Reagenz für die aCSF-Zubereitung</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>S5761</td><td>Reagenz für die aCSF-Zubereitung</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 (7H2O))</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>63138</td><td>Reagenz für die Liquoraufbereitung</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat einbasisch (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>P5655</td><td>Reagenz für die Liquoraufbereitung</td></tr><tr><td>Hepessalz</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>H7006</td><td>Reagenz für die Liquoraufbereitung</td></tr><tr><td>Hepessäure</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>H3375</td><td>Reagenz für die Liquoraufbereitung</td></tr><tr><td></td><td>Glucose Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>G7528</td><td>Reagenz für die aCSF-Aufbereitung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dehydrat</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>223506</td><td>Reagenz für die aCSF-Präparation</td></tr><tr><td>T30-Peptid</td><td>Genosphere Biotechnologies, Frankreich</td><td></td><td>AChE-abgeleitetes Peptid getestet</td></tr><tr><td>Chirurgisches Präparierset</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>Artikel #: MOUSEKIT</td><td>Schritt zur Entfernung des Gehirns</td></tr><tr><td>Chirurgische Klingen</td><td>Swann-Morton, UK</td><td>BS 2982</td><td>Schritt zur Entfernung des Gehirns</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>11566873</td><td>Vorbereitung des Gehirns zum Schneiden</td></tr><tr><td>Kleber</td><td></td><td></td><td>Vorbereitung des Gehirns zum Schneiden</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Deutschland</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Schneidebürsten</td><td></td><td></td><td>Handhabung von Gewebe</td></tr><tr><td>Sauerstoffkanister</td><td></td><td></td><td>Schnitt- und Inkubationsphase</td></tr><tr><td>1x Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>BP2438-4</td><td>Homogenisierungsschritt</td></tr><tr><td>Phosphatasehemmer</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1284-1650</td><td>Homogenisierungsschritt</td></tr><tr><td>Proteaseinhibitoren</td><td>Roche complete PIC, USA</td><td>4693116001</td><td>Homogenisierungsschritt</td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Starlab, UK</td><td>I1415-5390</td><td>Homogenisierungsschritt</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm Proteinassay</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>22660</td><td>Proteinkonzentration</td></tr></tbody></table>

ein alternativer ansatz zur primären ereignissen in neurodegeneration mit ex vivo ratte gehirnscheiben studieren

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Trotz zahlreicher Studien, die versuchen, zuverlässige Tiermodellen zu entwickeln, welche reflektieren die primären zugrunde liegenden Neurodegeneration Prozesse, wurden nur sehr wenige weithin akzeptiert. Hier schlagen wir ein neues Verfahren aus der bekannten ex-Vivo Gehirn Stück Technik, die eine engere in Vivobietet angepasst-wie Szenario als in-vitro- Vorbereitungen für die Untersuchung der frühen Ereignisse auslösen Zelldegeneration, als bei der Alzheimer-Krankheit (AD) beobachtet. Diese Variante besteht aus einfachen und leicht reproduzierbar Schritten, die Erhaltung der anatomischen Cytoarchitecture der ausgewählten Hirnregion und seine lokalen Funktionalität in einem physiologischen Milieu zu ermöglichen. Verschiedene anatomische Bereiche erhalten Sie bei demselben Gehirn, bietet die Möglichkeit, mehrere Experimente mit den fraglichen Behandlungen in einer Website, Dosis und Zeit-abhängigen Weise durchführen. Mögliche Einschränkungen betreffen die Ergebnisse im Zusammenhang mit dieser Methodik beziehen sich auf die Erhaltung des Gewebes, d. h. die Aufrechterhaltung seiner anatomischen Integrität während der Schneiden und Inkubation Schritte und die Schnittdicke die die biochemische und immunhistochemische Analyse beeinflussen. Dieser Ansatz kann für verschiedene Zwecke, wie die Erforschung der molekularer Mechanismen in physiologische oder pathologische Bedingungen, Drogen-Screening oder Dosis-Wirkungs-Assays eingesetzt werden. Dieses Protokoll könnte schließlich auch die Zahl der Tiere in Verhaltensstudien beschäftigt reduzieren. Die Anwendung hier berichtet wurde vor kurzem beschrieben und zum ersten Mal auf ex-Vivo Ratte Gehirnscheiben mit basalen Vorderhirn (BF), eines der zerebralen AD in erster Linie betroffenen Regionen getestet. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass die Verwaltung eines giftigen Peptids, abgeleitet aus dem C-Terminus der Acetylcholinesterase (AChE) eine AD-wie Profil, Auslösung, entlang der Antero-posterioren Achse der BF, eine differentielle Expression der veranlassen könnte Proteine verändert n. Chr., wie z. B. den alpha7 Nikotin-Rezeptor (α7-nAChR) phosphoryliert Tau (p-Tau) und Beta-Amyloid (Aβ).

Die hier vorgestellten Protokoll zeigt an, dass die Verwaltung eines giftigen Peptids, T30, in eine Website-abhängigen Weise die Expression von α7-nAChR, p moduliert-Tau und Aβ in BF-haltigen Abschnitten (Abb. 3A). Der Nikotin-Rezeptor zeigt eine deutliche Steigerung in der rostral behandelt Hemislice im Vergleich zu seiner Kontrolle Gegenstück (Scheibe 1, p = 0.0310) (Abb. 3 b), während die mittlere Scheibe Änderungen z...

Wir präsentieren eine Methode, die bieten weitere Einblicke in die frühe Ereignisse zugrunde liegenden Neurodegeneration und basiert auf der etablierten Ex-Vivo -Gehirn-Technik verbindet die Vorteile eines in Vivo und in Vitro Experimente. Darüber hinaus stellt es eine einzigartige Gelegenheit zum direkten Vergleich von behandelten und unbehandelten Gruppe in der gleichen anatomischen Ebene.

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gleichzeitig zwei spiegelnde Hemischeiben zu untersuchen, die aus derselben anatomischen Ebene gewonnen wurden, und die Auswirkungen nach einer Behandlung zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, entscheidende Fragen im Bereich der molekularen Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die primären Ereignisse, die Schlüsselmoleküle beeinflussen, die an neurodegenerativen Prozessen beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie molekulare Kaskaden bereitstellen und durchführen kann, die neurodegenerativen Ereignissen zugrunde liegen.Obwohl diese Methode Einblicke in primäre Ereignisse bei der Neurodegeneration geben kann, kann sie auch zur Untersuchung von Tiermodellen verschiedener Erkrankungen oder anderer Organ- und Gewebeeigenschaften angewendet werden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von zwei verschiedenen künstlichen Liquoren. Einer wird für das Schneiden des Gehirns verwendet, der andere für den Inkubationsschritt.Nachdem Sie das ACSF in Scheiben geschnitten haben, mischen Sie die Lösung und halten Sie sie auf Eis. Bereiten Sie auf ähnliche Weise den ACSF-Aufzeichnungsmodus vor, aber bewahren Sie ihn bei Raumtemperatur auf. Beide Lösungen mit Sauerstoff anreichern.Bereiten Sie als nächstes die Instrumente für die Enthauptung und Gehirnentfernung an der Präparierhaube vor. Richten Sie dann die Vibrationsparameter ein. Legen Sie die Schichtdicke nach Bedarf fest.Zum Beispiel dreihundert Mikrometer. Stellen Sie die Frequenz auf sieben und die Geschwindigkeit auf sechs ein. Setze dann die Vibratomkammer ein und umgib sie mit Eis.Für den Hirnschnitt öffnen Sie das Carbogen-Ventil, um das schneidende ACSF mit Sauerstoff zu versorgen. Wählen Sie die minimale Durchflussmenge von etwa zwei Millilitern pro Minute. Bereiten Sie nun in zwei 15-Milliliter-Tuben die Tus-Bedingungen vor.Laden Sie eine Röhre mit 10 Millilietern des Aufnahme-ACSF als Kontrolle. Laden Sie den anderen mit den 10 Millilitern ACSF-Aufnahme, die mit der Behandlung angereichert wurden. In diesem Fall zwei Mikromolaren von T30.Wirbeln Sie beide Röhren vor und halten Sie sie auf Eis, bis sie benötigt werden. Schneiden Sie die Haut über dem Schädel mit einer chirurgischen Klinge ein. Schneiden Sie dann mit einer Schere den Schädel entlang der Mittellinie vom Hinterteil bis zum Knochen über den Riechkolben ab.Ziehen Sie dann mit einer Pinzette seitlich an den beiden Seiten des Schädels, um Zugang zum Gehirn zu erhalten. Führen Sie einen Spatel ventral in das Gehirn ein. Schöpfen Sie es vorsichtig aus und halten Sie es etwa fünf Minuten lang in eiskaltem ACSF in Scheiben.Nach der Pause in kaltem ACSF übertragen Sie das Gehirn auf ein Filterpapier. Und nachdem Sie das Kleinhirn entfernt haben, kleben Sie das Gehirn senkrecht auf die Vibratomscheibe. Bringen Sie es dann in die mit eiskaltem ACSF gefüllte Trennkammer.Starten Sie nun den Sauerstofffluss zur Kammerlösung. Passen Sie dann das Schnittintervall an und fahren Sie mit der Gehirnsektion fort. Erfassen Sie die Schnitte, die den Interessenbereich enthalten, mit Standardmethoden.Teilen Sie nun jeden Abschnitt vorsichtig mit einer kleinen Schere entlang der Mittellinie auf, um zwei spiegelnde Hemischeiben zu erhalten. Verwenden Sie jedes Paar Hemischeiben für die Kontroll- und Behandlungsbedingung. Lassen Sie die Hemisektionen nach der Teilung fünf bis zehn Minuten in der Vibratomkammer ruhen.Nach der Pause werden die Hemisektionen vorsichtig mit einer Glaspipette in einen Sprudeltopf gegeben, in dem sich die ACSF-Aufzeichnung bei Raumtemperatur befindet. Lassen Sie dann die Hemisektionen etwa 30 Minuten lang erholen, bevor Sie fortfahren. Während der Pause werden drei Glasfläschchen mit drei Millilitern ACSF für die Kontrollgruppe und drei Durchstechflaschen mit drei Millilitern mit T30 angereichertem ACSF für die behandelte Gruppe geladen.Nach der 30-minütigen Ruhezeit geben Sie die Probe innerhalb von fünf Minuten in die Bäder. Laden Sie zunächst die aufeinanderfolgenden Hemischeiben mit einer Bürste in die Kontrolllösung. Übertragen Sie dann mit einer anderen Bürste die kontralateralen Hemisektionen auf die Behandlungslösung.Verschließen Sie anschließend die Fläschchen mit Kunststoffstopfen mit 21-Gauge-Nadeln für die Abgabe von Carbogen an die Probe. Geben Sie Sauerstoff mit einer minimalen Durchflussrate ab, z. B. zwei Milliliter pro Minute, um jegliche Bewegung des Gehirngewebes zu verhindern, die zu einer möglichen mechanischen Schädigung des Gewebes führt. Damit ist die Einrichtung abgeschlossen.Starten Sie nun eine fünfstündige Inkubation. Stoppen Sie nach der Inkubation den Sauerstofffluss und öffnen Sie die Deckel der Fläschchen. Übertragen Sie die Hemischeiben dann vorsichtig mit der entsprechenden Bürste auf 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 250 Mikrolitern Lysepuffer, die auf Eis aufbewahrt werden.Als nächstes mit separaten Stößeln jedes Gewebe homogenisieren. Schließen Sie die Transfer- und Homogenisierungsschritte für alle sechs Proben innerhalb von 10 bis 15 Minuten ab. Zentrifugieren Sie nun die homogenisierten Proben bei der 1.000-fachen Schwerkraft für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Schleudern werden die Überstände in neue Röhrchen überführt und die Proben bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Die Verabreichung eines toxischen Peptids, T30, an das Basilikum-Vorderhirn, das Hemisektionen enthielt, hatte drei ortsspezifische Wirkungen auf das Gewebe. Es modulierte die Expression des Alpha-7-Nikotinrezeptors, die Phosphorylierung von Tau und die Expression von Amyloid beta.Der Nikotinrezeptor zeigte eine signifikante Zunahme des rostral behandelten Hemislices, während die Zwischenscheibe keine Veränderung zwischen den beiden Erkrankungen zeigte. Im hinteren Abschnitt war eine signifikante Reduktion im T30-exponierten Teil vorhanden. Die phosphorylierten Tau-Spiegel waren im Frontzahnbereich signifikant erhöht.Auf der anderen Seite zeigen die beiden anderen Basilikum-Vorderhirnabschnitte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Erkrankungen. Amyloid beta war nach T30-Exposition in der rostralen und intermediären Hemisektion signifikant erhöht. Im Kodal-Objektträger gab es jedoch keinen messbaren Effekt auf die Amyloid-Beta-Expression.Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von sieben Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

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Organotypischen Kultur der E18 Gehirn von Ratten

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Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

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Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.

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Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

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