Name: Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Lernen Sie eine Ex-vivo-Gehirnschnittmethode mit Rattenhemischnitten zur Untersuchung früher molekularer Veränderungen bei Neurodegeneration. Diese Technik ermöglicht direkte Vergleiche zwischen behandelten und unbehandelten Bedingungen.

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Diese Arbeit wurde von Neuro-Bio Ltd. finanziert. Wir möchten Dr. Giovanni Ferrati und Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) Danke für ihre Kommentare und Ratschläge auf dem Manuskript.

Unter anerkannten Protokolle wurden alle Tierversuche durchgeführt.
Hinweis: In diesem Abschnitt die Reihenfolge der wichtigsten Phasen durchgeführt während der Versuchsdurchführung und der vorgeschlagenen zeitlichen Abstand erfolgt (Abbildung 1). Darüber hinaus wird eine schrittweise Beschreibung des Protokolls ergänzt durch ein Bedienfeld "illustrative", mit kritischen Aktionen von Gehirnentfernung bis hin zu Gewebe Homogenisierung nach der Inkubationszeit (Abbildung 2). Die Details bezüglich der Materialien und die Anweisungen, um das Gerät und die nachfolgende Phase für die WB-Analyse zu bauen sind zuvor beschriebenen22.
(1) chirurgische Werkzeuge, Vibratome Einstellungen und Vorbereitung der Behandlung
Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte vor dem Start der Versuchsdurchführung:
<ol><li>Bereiten Sie zwei unterschiedlichen künstliche Liquor Flüssigkeiten (aCSFs), verwendet für das Schneiden von Gehirn und die andere für die inkubationsschritt29wie zuvor beschrieben. Kurz, die Arbeiten-Konzentrationen (in Mmol) von zwei aCSFs sind für die "schneiden" ACFS: 120 NaCl, 5 KCl, 20 Nahco33, 2,4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4und 10 Glukose; 6.7 HEPES Salz und 3,3 HEPES Säure; pH-Wert: 7,1. Während für die "Aufnahme" ACFS: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 Nahco33, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 KH2PO4und 10 Glukose; pH-Wert: 7,1.</li>
	<li>Die Lösungen gut mischen und dann auf Eis gelegt und slicing ACFS um es Kälte beim Entfernen des Gehirns und das anschließende Schneiden mit Sauerstoff. Halten Sie Sie bei Raumtemperatur (RT) und Versorgungsmaterial Sauerstoff Aufnahme ACFS.</li>
	<li>Legen Sie die Instrumente unter der Dissektion Haube für die Enthauptung und Gehirn entfernen, d. h., Guillotine, chirurgischen Präparation Kit (Schere, Pinzette, Messer) und Spachtel.</li>
	<li>Richten Sie die Vibratome Parameter, indem er die Scheibendicke (300 µm in dieser Zubereitung) und die Häufigkeit von 7 und die Geschwindigkeit, mit 6. Legen Sie die Vibratome Kammer an der entsprechenden Stelle und mit Eis umgeben.</li>
	<li>Öffnen Sie das Carbogen (95 % O2, 5 % CO2) Ventil um das "Aufschneiden" (ACFS) während das Gehirn Schneiden mit Sauerstoff. Wählen Sie die minimale Durchflussmenge um 2 mL/min.</li>
	<li>Nehmen Sie zwei 15-mL-Röhren, die Bedingungen zu testen. Fügen Sie in eine Röhre 10 mL der "Aufnahme" ACFS allein (Kontrollgruppe) und in der anderen 10 mL der "Aufnahme" ACFS angereichert mit T30 in einer Konzentration von 2 µM (behandelten Gruppe). Vortex sowohl Rohre und halten sie auf dem Eis bis zu ihrer Verwendung in der Setup-Vorbereitungsphase (Abschnitt 3).</li>
</ol>(2) Anästhesie, Gehirn-Extraktion und schneiden
Hinweis: In dieser Studie wurden 9 Wildtyp P14 männliche Wistar-Ratten verwendet. Gehirn-Extraktion und anschließende schneiden dar einen wichtigen Bestandteil des Protokolls, da sie schnell (innerhalb von 10 min) erfolgen sollte, um zu verhindern oder zumindest verlangsamen Gewebe Degeneration Prozesse.
<ol><li>Fügen Sie 1,5 mL 100 % w/w von Isofluran auf einer baumwollschicht in die Induktion Kammer hinzu, legen Sie das Tier innen und schließen Sie den Deckel. Warten Sie, bis das Tier tief betäubt ist, bestätigt das Fehlen der Pedal-Reflex, und dann enthaupten Sie das Tier mit der Guillotine zu.</li>
	<li>Halten Sie den Kopf des Tieres in einen Topf mit eiskaltem schneiden ACFS im Gehirn Entfernung Schritt (Abbildung 2A -C).</li>
	<li>Einschneiden der Haut über den Schädel mit einem chirurgischen Klinge, dann schneiden Sie den Schädel mit einer Schere nach der Mittellinie aus dem hinteren Teil und fahren Sie körpertiefe bis zum Erreichen des Knochens über der OBs (Abbildung 2A).</li>
	<li>Ziehen Sie seitlich die beiden Seiten des Schädels mit einer Zange um Zugriff auf das Gehirn (Abb. 2 b) erhalten. Legen Sie einen Spachtel ventral zum Gehirn, schöpfen Sie sanft es aus, und halten Sie es im eiskalten "schneiden" ACFS für ca. 5 min (Abbildung 2) hydratisiert.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Gehirn auf Filterpapier und schneiden Sie das Kleinhirn mit einer Klinge (Abb. 2D). Kleben Sie das Gehirn vertikal auf der Vibratome CD und legen Sie sie in der speziellen Kammer, füllen Sie ihn mit eiskalten "schneiden" ACFS und liefern Sie Sauerstoff (Abb. 2E).</li>
	<li>Passen Sie es schneiden, und fahren Sie mit dem Gehirn-Schnitt (Abb. 2F). Sammeln Sie die Abschnitte mit der Region von Interesse, wie die medialen Scheidewand (MS), Diagonale Band von Broca (DBB) und Substantia Innominata (SI), wie zuvor beschrieben22. Von oben nach unten enthalten die drei Scheiben die rostral (R), Mittelstufe (I) und kaudalen (C) Teil der BF (Abbildung 2).</li>
	<li>Teilen Sie entlang der Mittellinie jeder Abschnitt mit einer kleinen Schere, erhalten zwei spiegelnde Hemislices (Abb. 2 H), einzeln als Kontrolle und behandelten Zustand bei der gleichen anatomischen Ebene verwendet.</li>
	<li>Halten Sie die Hemisections in der Vibratome Kammer für 5-10 min, dann mit einer Glaspipette in einem sprudelnden Topf mit Aufnahme ACFS überführen. Halten Sie bei RT für ca. 30 min zu erholen.</li>
	<li>Füllen Sie in der Zwischenzeit drei Glasfläschchen mit 3 mL Aufnahme ACFS allein (zuvor im Schritt 1.6 für die Kontrollgruppe bereit) und drei Fläschchen mit 3 mL ACFS angereichert mit T30 (zuvor im Schritt 1.6 bereit) für die behandelten Gruppe.</li>
</ol>3. Setup Vorbereitung
<ol><li>Die Hemisections in ihre entsprechenden Glasfläschchen (Abbildung 2I) zu übertragen, um drei aufeinander folgende Hemislices (einschließlich der rostral, zwischen- und kaudalen BF-Region) für die Kontrollgruppe (grüner Rahmen, Abbildung 2J) haben und deren passenden Partnern bei der behandelten Gruppe (roter Rahmen, Abbildung 2J).</li>
	<li>Übertragen Sie das Hirngewebe mit zwei verschiedenen Pinseln, eine für die Steuerung Hemislices und eine weitere für die behandelten Gegenstücke, um eine Kontamination zwischen Bedingungen zu verhindern.</li>
	<li>Jede Glasflasche mit dem entsprechenden Deckel, präsentieren die Sauerstoff Nadel (21G) (Abb. 2J) zu versiegeln. Verbinden Sie das Hauptrohr des Apparates mit Carbogen Quelle (Abbildung 2 K). Sauerstoff für die Hemislices während der Inkubationszeit mit einer minimalen Flussrate von 2 mL/min zu liefern, um jede Bewegung des Hirngewebes und mechanische Beschädigungen während des Versuchs zu vermeiden. Starten Sie die 5 h Inkubation. Führen Sie die Schritte 3.1-3.3 innerhalb von 5 Minuten. Hinweis: Prüfen Sie häufig (alle 15-20 min) ob der Sauerstoff in die Fläschchen versorgt wird und seinen Fluss nicht das Gewebe von unten bewegt.</li>
</ol>4. Probe Homogenisierung
<ol><li>Nach der Inkubation stoppen Sie der Sauerstoffzufuhr zu und entfernen Sie den Deckel aus dem Fläschchen. Übertragen Sie die Hemislices, mit der richtigen Bürsten, in 1,5 mL Röhrchen mit 250 µL Lyse Puffer, Aufrechterhaltung der Rohre auf dem Eis (Abbildung 2 L). Machen die Lyse Puffern, mischen PBS 1 X mit Phosphatase und Protease-Hemmer Cocktails sowohl 1: 100 verdünnt und Homogenisieren des Gewebes mit verschiedenen Stößel, Kontamination zwischen den Proben zu verhindern. Füllen Sie diese Aktionen innerhalb von 10-15 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Gehirn lysate bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Transfer des Überstands in neue Schläuche und halten die Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>5. Lesen der Proteinkonzentration und Western-Blot Analyse
<ol><li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe zu und anschließend bereiten Sie die Aliquote der Western-Blot Analyse als zuvor beschriebenen22 vor.</li>
	<li>Führen Sie statistische Analyse, um die Bewertung der Auswirkungen der Behandlung auf Protein-Expression.</li>
</ol>

<ol><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Schliebs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+forebrain+cholinergic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease--interrelationship+with+beta-amyloid%2C+inflammation+and+neurotrophin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling.</a> Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).</li>
<li>Schmitz, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+forebrain+degeneration+precedes+and+predicts+the+cortical+spread+of+Alzheimer%27s+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology.</a> Nature Communications. 7, 13249(2016).</li>
<li>Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+normal+in+normal+aging%3F+Effects+of+aging%2C+amyloid+and+Alzheimer%27s+disease+on+the+cerebral+cortex+and+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus.</a> Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).</li>
<li>Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+centres+in+Alzheimer%27s+disease%3A+olfactory+bulb+is+involved+in+early+Braak%27s+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages.</a> Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).</li>
<li>Winblad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defeating+Alzheimer%27s+disease+and+other+dementias%3A+a+priority+for+European+science+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society.</a> The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).</li>
<li>Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+rejecting+the+amyloid+cascade+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis.</a> Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).</li>
<li>De Strooper, B., Karran, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+Phase+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular Phase of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 164 (4), 603-615 (2016).</li>
<li>Scheltens, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(15)01124-1/abstract">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).</li>
<li>Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+in+Alzheimer%27s+disease+resemble+embryonic+development-A+study+of+molecular+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms.</a> Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).</li>
<li>Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+and+the+basal+forebrain+cholinergic+system%3A+relations+to+%CE%B2-amyloid+peptides%2C+cognition%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies.</a> Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).</li>
<li>Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neurone+loss+in+Alzheimer%27s+disease%3A+cortical+or+subcortical%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical?</a> Acta Neuropathol Commun. 3, 10(2015).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+Pivotal+Factor+or+The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+Pivotal+Factor+or+Side+Show%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show?</a> Learn Mem. , 43-49 (2004).</li>
<li>Schliebs, R., Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholinergic+system+in+aging+and+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The cholinergic system in aging and neuronal degeneration.</a> Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).</li>
<li>Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cholinergic+pathways+in+the+rat%3A+An+overview+based+on+an+alternative+nomenclature+%28Ch1-Ch6%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6).</a> Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).</li>
<li>Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+cortex+by+the+basal+forebrain%3A+cytochemistry+and+cortical+connections+of+the+septal+area%2C+diagonal+band+nuclei%2C+nucleus+basalis+%28substantia+innominata%29%2C+and+hypothalamus+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey.</a> J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).</li>
<li>Greenfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+and+targeting+the+basic+mechanism+of+neurodegeneration%3A+The+role+of+peptides+from+the+C-terminus+of+acetylcholinesterase%3A+Non-hydrolytic+effects+of+ache%3A+The+actions+of+peptides+derived+from+the+C-terminal+and+their+relevance+to+neurodegenerat%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat.</a> Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).</li>
<li>Garcia-Ratés, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28I%29+Pharmacological+profiling+of+a+novel+modulator+of+the+%CE%B17+nicotinic+receptor%3A+Blockade+of+a+toxic+acetylcholinesterase-derived+peptide+increased+in+Alzheimer+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">(I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains.</a> Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).</li>
<li>Eimerl, S., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantity+of+calcium+that+appears+to+induce+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The quantity of calcium that appears to induce neuronal death.</a> Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).</li>
<li>Greenfield, S., Vaux, D. J. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/0d25/c7e053b9eed98e759c2e2879cb53195c084e.pdf">Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism.</a> Science. 113 (3), 485-492 (2002).</li>
<li>Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28II%29+Physiological+profiling+of+an+endogenous+peptide+in+the+basal+forebrain%3A+Age-related+bioactivity+and+blockade+with+a+novel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">(II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator.</a> Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).</li>
<li>Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+Vivo+Model+to+Investigate+the+Underlying+Mechanisms+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291(2017).</li>
<li>Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+rat+hippocampus+slices+following+in+vivo+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia.</a> Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).</li>
<li>Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Adenosine+Receptor-Mediated+Regulation+of+Diverse+Thalamocortical+Short-Term+Plasticity+in+the+Mouse+Whisker+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway.</a> Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li>
<li>Badin, A. S., John, E., Susan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+spatio-temporal+bioactivity+of+a+novel+peptide+revealed+by+optical+imaging+in+rat+orbitofrontal+cortex+in+vitro%3A+Possible+implications+for+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases.</a> Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).</li>
<li>Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+rat+brain+suggests+a+previously+missing+link+between+top-down+and+bottom-up+nervous+system+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function.</a> Neurophotonics. 4, 31213(2017).</li>
<li>Opitz-Araya, X., Barria, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3197400/">Organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).</li>
<li>Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+active+rat+brain+slices+as+a+model+to+study+the+regulation+of+protein+phosphorylation+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain.</a> Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen. Susan A. Greenfield ist der Gründer und Präsident der Neuro-Bio-Limited, ein privat geführtes Unternehmen und hält Anteile an der Gesellschaft. Emanuele Brai und Antonella Cogoni sind Mitarbeiter von Neuro-Bio Ltd.

Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls, basiert auf der bewährten ex Vivo -Gehirn-Technik ermöglicht zwei spiegelnde Hemislices, gewonnen aus der gleichen anatomischen Ebene, Überwachung ihrer Reaktion nach der Anwendung eines bestimmten synchron zu testen Zustand (Steuern oder behandelt); Dies bietet daher eine experimentellere Paradigma so streng kontrolliert wie möglich. Die Möglichkeit der Bewertung in einer Zeit, Dosis und ortsspezifische Weise verschiedene Neurochemikalien, die im Zusammenhang mit neurona...

AD ist eine chronische Krankheit gekennzeichnet durch allmähliche Neurodegenerative Beeinträchtigung beeinflussen verschiedene Hirnareale wie entorhinalen Kortex (EG), BF, Hippocampus (HC) und Riechkolben (OB)1,2,3, 4,5. Im Spätstadium der Entwicklung AD führen zu einem progressive kognitive Rückgang, so dass diese Erkrankung die häufigste Form der Demenz, entfallen etwa 70 % von allen Fällen6. Trotz umfangreicher Versuche zu verstehen, der Anfangsphase verursacht AD ist nicht derzeit eine definierte experimentelle Indikation Aufklärung sie. Darüber hinaus ist die populärste Theorie - "Amyloid-Hypothese" - zunehmend in Frage gestellt, da es nicht bietet ein vollständiges Profil in der Erklärung der AD Pathobiologie, noch eine pharmazeutische Ziel, die wirksame7,8 bewährt hat ,9.
Eine alternative Theorie, die zunehmend Beachtung deutet darauf hin, dass die anfängliche Mechanismen bei der Neurodegeneration zu einem neuronalen Cluster vor allem anfällig in AD3,10,11 zusammenhängen , 12 , 13 , 14. dieser heterogenen zellulären Hub umfasste innerhalb der BF, Mittelhirn und Hirnstamm, Projekte auf mehrere Regionen, wie z. B. die EG, HC und OB15,16. Trotz ihrer Vielfalt in neuronale Morphologie und Neurotransmitter-Synthese teilt diesen Kern der Zellen ein gemeinsames Merkmal im Ausdruck AChE, die auch ein nicht-enzymatische Funktion17,18haben kann. Diese nicht-klassischen Rolle als Roman Signaltechnik Molekül Kalzium (Ca2 +) fließen in Neuronen vermittelt die trophische oder toxische Ereignissen in Bezug auf Ca2 + Dosis, Verfügbarkeit und neuronale Alter17,18 unterzogen werden können , 19.
Während Neurodegeneration die beobachteten zelluläre Verlust daher möglicherweise mit diesem nicht-enzymatische Funktion17,18,20, was auf ein 30mer Peptid (T30) gespalten aus dem C-Terminus AChE zurückzuführen ist 20. im Einklang mit früheren Ergebnissen, geweitermacht Zellkultur und optische Bildgebung18,21 Vorbereitungen, wir unter Beweis gestellt, durch einen neuartigen Ansatz basierend auf ex Vivo Ratte Gehirnscheiben mit BF Strukturen, die induzierte T30 ein AD-ähnlichen Profil22. Insbesondere bietet diese neue Methodik ein physiologischer Szenario als Zellkultur, da es viele der Merkmale von einem intaktem Gewebe von anatomischen bis hin zu Schaltung Konservierung, wenn auch nur für ein Zeitfenster von Stunden unterhält. Wir angewendet dieses Protokoll zur Erkundung der Ereignisse in den frühen Phasen der Neurodegeneration, Überwachung der akuten Reaktion auf T30-Antrag.
Trotz der großen Körper der Literatur auf Gehirn Scheiben zu untersuchen molekulare Signalwege in neuronale Schäden impliziert oder Neurogenese23,24, dieses Protokoll bietet zum ersten Mal eine direktere und Sensitive ausgelesen im Vergleich für die gemeinsame Nutzung von organotypischen Scheiben. Jedoch wie der Fall für organotypischen Gehirn Abschnitte ist, kann dieser akuten Slice-Verfahren auch für verschiedene Zwecke, wie die Auswertung der neuroprotektive oder neurotoxische Moleküle, Entdeckung der primären molekulare Veränderungen in einem bestimmten Prozess angenommen werden, immunhistochemische Analysen und pharmakologischen Tests für zentrale Nervensystem im Zusammenhang mit Krankheiten.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>S7653</td><td>Reagenz für die aCSF-Zubereitung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>P9333</td><td>Reagenz für die aCSF-Zubereitung</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>S5761</td><td>Reagenz für die aCSF-Zubereitung</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 (7H2O))</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>63138</td><td>Reagenz für die Liquoraufbereitung</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat einbasisch (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>P5655</td><td>Reagenz für die Liquoraufbereitung</td></tr><tr><td>Hepessalz</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>H7006</td><td>Reagenz für die Liquoraufbereitung</td></tr><tr><td>Hepessäure</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>H3375</td><td>Reagenz für die Liquoraufbereitung</td></tr><tr><td></td><td>Glucose Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>G7528</td><td>Reagenz für die aCSF-Aufbereitung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dehydrat</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>223506</td><td>Reagenz für die aCSF-Präparation</td></tr><tr><td>T30-Peptid</td><td>Genosphere Biotechnologies, Frankreich</td><td></td><td>AChE-abgeleitetes Peptid getestet</td></tr><tr><td>Chirurgisches Präparierset</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>Artikel #: MOUSEKIT</td><td>Schritt zur Entfernung des Gehirns</td></tr><tr><td>Chirurgische Klingen</td><td>Swann-Morton, UK</td><td>BS 2982</td><td>Schritt zur Entfernung des Gehirns</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>11566873</td><td>Vorbereitung des Gehirns zum Schneiden</td></tr><tr><td>Kleber</td><td></td><td></td><td>Vorbereitung des Gehirns zum Schneiden</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Deutschland</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Schneidebürsten</td><td></td><td></td><td>Handhabung von Gewebe</td></tr><tr><td>Sauerstoffkanister</td><td></td><td></td><td>Schnitt- und Inkubationsphase</td></tr><tr><td>1x Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>BP2438-4</td><td>Homogenisierungsschritt</td></tr><tr><td>Phosphatasehemmer</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1284-1650</td><td>Homogenisierungsschritt</td></tr><tr><td>Proteaseinhibitoren</td><td>Roche complete PIC, USA</td><td>4693116001</td><td>Homogenisierungsschritt</td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Starlab, UK</td><td>I1415-5390</td><td>Homogenisierungsschritt</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm Proteinassay</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>22660</td><td>Proteinkonzentration</td></tr></tbody></table>

ein alternativer ansatz zur primären ereignissen in neurodegeneration mit ex vivo ratte gehirnscheiben studieren

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Trotz zahlreicher Studien, die versuchen, zuverlässige Tiermodellen zu entwickeln, welche reflektieren die primären zugrunde liegenden Neurodegeneration Prozesse, wurden nur sehr wenige weithin akzeptiert. Hier schlagen wir ein neues Verfahren aus der bekannten ex-Vivo Gehirn Stück Technik, die eine engere in Vivobietet angepasst-wie Szenario als in-vitro- Vorbereitungen für die Untersuchung der frühen Ereignisse auslösen Zelldegeneration, als bei der Alzheimer-Krankheit (AD) beobachtet. Diese Variante besteht aus einfachen und leicht reproduzierbar Schritten, die Erhaltung der anatomischen Cytoarchitecture der ausgewählten Hirnregion und seine lokalen Funktionalität in einem physiologischen Milieu zu ermöglichen. Verschiedene anatomische Bereiche erhalten Sie bei demselben Gehirn, bietet die Möglichkeit, mehrere Experimente mit den fraglichen Behandlungen in einer Website, Dosis und Zeit-abhängigen Weise durchführen. Mögliche Einschränkungen betreffen die Ergebnisse im Zusammenhang mit dieser Methodik beziehen sich auf die Erhaltung des Gewebes, d. h. die Aufrechterhaltung seiner anatomischen Integrität während der Schneiden und Inkubation Schritte und die Schnittdicke die die biochemische und immunhistochemische Analyse beeinflussen. Dieser Ansatz kann für verschiedene Zwecke, wie die Erforschung der molekularer Mechanismen in physiologische oder pathologische Bedingungen, Drogen-Screening oder Dosis-Wirkungs-Assays eingesetzt werden. Dieses Protokoll könnte schließlich auch die Zahl der Tiere in Verhaltensstudien beschäftigt reduzieren. Die Anwendung hier berichtet wurde vor kurzem beschrieben und zum ersten Mal auf ex-Vivo Ratte Gehirnscheiben mit basalen Vorderhirn (BF), eines der zerebralen AD in erster Linie betroffenen Regionen getestet. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass die Verwaltung eines giftigen Peptids, abgeleitet aus dem C-Terminus der Acetylcholinesterase (AChE) eine AD-wie Profil, Auslösung, entlang der Antero-posterioren Achse der BF, eine differentielle Expression der veranlassen könnte Proteine verändert n. Chr., wie z. B. den alpha7 Nikotin-Rezeptor (α7-nAChR) phosphoryliert Tau (p-Tau) und Beta-Amyloid (Aβ).

Die hier vorgestellten Protokoll zeigt an, dass die Verwaltung eines giftigen Peptids, T30, in eine Website-abhängigen Weise die Expression von α7-nAChR, p moduliert-Tau und Aβ in BF-haltigen Abschnitten (Abb. 3A). Der Nikotin-Rezeptor zeigt eine deutliche Steigerung in der rostral behandelt Hemislice im Vergleich zu seiner Kontrolle Gegenstück (Scheibe 1, p = 0.0310) (Abb. 3 b), während die mittlere Scheibe Änderungen z...

Wir präsentieren eine Methode, die bieten weitere Einblicke in die frühe Ereignisse zugrunde liegenden Neurodegeneration und basiert auf der etablierten Ex-Vivo -Gehirn-Technik verbindet die Vorteile eines in Vivo und in Vitro Experimente. Darüber hinaus stellt es eine einzigartige Gelegenheit zum direkten Vergleich von behandelten und unbehandelten Gruppe in der gleichen anatomischen Ebene.

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gleichzeitig zwei spiegelnde Hemischeiben zu untersuchen, die aus derselben anatomischen Ebene gewonnen wurden, und die Auswirkungen nach einer Behandlung zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, entscheidende Fragen im Bereich der molekularen Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die primären Ereignisse, die Schlüsselmoleküle beeinflussen, die an neurodegenerativen Prozessen beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie molekulare Kaskaden bereitstellen und durchführen kann, die neurodegenerativen Ereignissen zugrunde liegen.Obwohl diese Methode Einblicke in primäre Ereignisse bei der Neurodegeneration geben kann, kann sie auch zur Untersuchung von Tiermodellen verschiedener Erkrankungen oder anderer Organ- und Gewebeeigenschaften angewendet werden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von zwei verschiedenen künstlichen Liquoren. Einer wird für das Schneiden des Gehirns verwendet, der andere für den Inkubationsschritt.Nachdem Sie das ACSF in Scheiben geschnitten haben, mischen Sie die Lösung und halten Sie sie auf Eis. Bereiten Sie auf ähnliche Weise den ACSF-Aufzeichnungsmodus vor, aber bewa

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

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Behandlung von koronalen Schnitten der Ratte mit einem neurotoxischen Peptid

Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.

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Wir haben eine Hirnschnittmodell, das verwendet werden kann, um die molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität-vermittelten-Hirn-Verletzungen beteiligt untersuchen entwickelt. Diese Technik erzeugt lebensfähigen reifen Hirngewebe und reduziert die für Experimente erforderlichen Tiernummern, unter Beibehaltung der neuronalen, zellulären Interaktionen und postsynaptischen Fächer teilweise intakt.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Dieses Protokoll veranschaulicht die Implementierung einer optimierten N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) schützende Wiederherstellungsmethode der Gehirn-Scheibe-Vorbereitung. Eine einziges Medium Formulierung wird verwendet, um Tiere jeden Alters und für verschiedenste experimentelle Anwendungen zuverlässig gesunde Gehirnscheiben einzuholen.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von horizontalen Hippocampus-entorhinalen Kortex-Scheiben (HEC) von Mäusen, die eine spontane scharfe Wellenwelligkeit saufen. Slices werden in einer vereinfachten Grenzraum-Haltekammer inkubiert und Aufnahmen werden unter getauchten Bedingungen mit schnell fließender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchgeführt, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes und die spontane Entstehung von Netzwerkaktivität zu fördern.

Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

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In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Lernen Sie eine Ex-vivo-Gehirnschnittmethode mit Rattenhemischnitten zur Untersuchung früher molekularer Veränderungen bei Neurodegeneration. Diese Technik ermöglicht direkte Vergleiche zwischen behandelten und unbehandelten Bedingungen.

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

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