Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Diese Methode kann dazu beitragen, einige Schlüsselfragen in verschiedenen Forschungsbereichen zu beantworten, wie z. B. den Nachweis von präkanzerösen Klonen, die prognostische Beurteilung von Leukämiepatienten nach der Behandlung und die Identifizierung potenziell pathogener Mutationen bei Knochenmarkspendern. Spencer wird dieses Verfahren mit mir demonstrieren, er ist Techniker im Labor. In diesem Video wird beschrieben, wie das Error-corrected Sequencing Protocol mit der Illumina-Chemie und kommerziell erhältlichen Gen-Panels kombiniert werden kann, um klonale Einzelnukleotidvarianten und kleine Indels mit einer Sensitivität von eins zu 10.000 zu detektieren.

Um die erforderlichen eindeutigen molekularen Identifikatoren zu integrieren, verwenden kundenspezifische 16N i5- und i7-Adapter PCR. Bereiten Sie zunächst den Q5 Master Mix vor, der eine Polymerase mit höherer Wiedergabetreue als die im Handel erhältliche Alternative verwendet. Kombinieren Sie dann für jede Reaktion 37,5 Mikroliter Q5 Master Mix, sechs Mikroliter von fünf mikromolaren 16N i5-Adaptern, die die eindeutigen molekularen Identifikatoren sind, und sechs Mikroliter i7-Adapter.

Wenn das Ziel Multiplexing ist, verwenden Sie verschiedene i7-Adapter in separaten Beispielen. Führen Sie nun die PCR mit den folgenden Parametern durch: dreißig Sekunden bei 98 Grad Celsius, gefolgt von vier bis sechs Zyklen von zehn Sekunden bei 98 Grad Celsius, dreißig Sekunden bei 66 Grad Celsius und dreißig Sekunden bei 72 Grad Celsius. Beenden Sie die Reaktion mit einer zweiminütigen Verlängerung bei 72 Grad Celsius und halten Sie sie bei vier Grad Celsius.

Dann hängen die beiden PCR-Zyklen, die Sie an ihnen durchführen müssen, höchstwahrscheinlich von der Größe des Gen-Panels ab, das Sie verwenden, aus unserer Erfahrung ist eine Vier-Zyklus-PCR ausreichend, wenn das Gen-Panel etwa 1500 verschiedene Wege genspezifischer Oligos aufweist, während ein Panel mit etwa fünf bis 600 Oligopaaren etwa sechs PCR-Zyklen erfordert. Als nächstes reinigen Sie die PCR-Reaktionen mit magnetischen Kügelchen, fügen Sie 56,25 Mikroliter magnetische Bead-Lösung in jedes 75-Mikroliter-PCR-Produkt hinzu, übertragen Sie dann jede Reaktion in ein separates 1,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung, mischen Sie es durch mindestens zehnmaliges Auf- und Abpipettieren und warten Sie fünf Minuten. Übertragen Sie dann die Mischungen in einen Magnethalter und lassen Sie die Überstände zwei Minuten lang klar.

Entfernen und entsorgen Sie dann die Überstände. Fügen Sie dann 200 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu, warten Sie dreißig Sekunden und entfernen Sie dann das Ethanol. Wiederholen Sie diesen Ethanol-Waschschritt einmal und lassen Sie die Kügelchen dann fünf Minuten lang an der Luft trocknen.

Zum Schluss eluieren Sie die modifizierten Bibliotheken aus den Kügelchen in zwanzig Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser. Legen Sie dann die Röhrchen auf ein Magnetgestell, um die magnetischen Kügelchen vom Eluenten zu trennen. Führen Sie zunächst zehnfache serielle Verdünnungen der ECS-Bibliotheken aus dem vorherigen Schritt durch, bis zu einem Teil pro 1.000 in PCR-Streifen.

Bereiten Sie als Nächstes einen Master Mix in einer 1,5-Milliliter-Tube vor. Kombinieren Sie für jede Reaktion 10 Mikroliter ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 Mikroliter P5-Primer, 0,2 Mikroliter P7-Primer und 4,6 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser. Pipettieren Sie dann 15 Mikroliter des EvaGreen Master Mix in einen neuen Satz Röhrchen und fügen Sie schließlich fünf Mikroliter eines bis 1.000 ECS gereinigten Produkts zum Master Mix hinzu.

Stellen Sie als Nächstes PCR-Tröpfchen mit dem Tröpfchengenerator her. Laden Sie zuerst die Kassette, pipettieren Sie 70 Mikroliter Tröpfchenerzeugungsöl in die Vertiefung der Kassette, markiertes Öl und pipettieren Sie 20 Mikroliter des ddPCR-Reaktionsgemisches in die gut markierte Probe. Decken Sie dann die Kassette mit einer Gummidichtung ab und laden Sie sie in den Tröpfchengenerator, und die gesamte Tröpfchenerzeugung wird fortgesetzt.

Nun werden mit einer Mehrkanalpipette langsam über fünf Sekunden 45 Mikroliter Tröpfchen aus jeder Kassettenvertiefung auf eine neue PCR-Platte geladen. Versiegeln Sie dann die PCR-Platte mit einer Aluminiumfolie. Verstärken Sie nun das Signal in den Tröpfchen unter den folgenden Bedingungen: fünf Minuten bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 40 Zyklen von dreißig Sekunden bei 95 Grad Celsius und einer Minute bei 63 Grad Celsius, dann kühlen Sie die Reaktion fünf Minuten lang auf vier Grad Celsius ab, bevor Sie sie für fünf Minuten auf 90 Grad Celsius erhöhen. und dann bei vier Grad Celsius halten.

Bereiten Sie als Nächstes die ddPCR-Vorlagen-Tröpfchenlesemaschine vor. Wählen Sie die Parameter für die absolute Quantifizierung und die Verwendung des QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Lassen Sie dann die Reaktionen durch den Tröpfchenleser laufen.

Wenn die ddPCR-Analyse abgeschlossen ist, wenden Sie auf jede Probe die gleichen divisiven Schwellenwerte an. Normalisieren Sie dann jede Bibliothek auf die gewünschte Anzahl von Molekülen. Beginnen Sie mit 50-Mikroliter-Reaktionen, bestehend aus 25 Mikrolitern Q5 Master Mix, zwei Mikrolitern einem mikromolaren P5-Primer, zwei Mikrolitern einem mikromolaren P7-Primer und 21 Mikrolitern normalisierter DNA-Bibliothek.

Führen Sie als Nächstes die PCR mit den folgenden Parametern durch: 30 Sekunden bei 98 Grad Celsius, gefolgt von 16 Zyklen von 10 Sekunden bei 98 Grad Celsius, dreißig Sekunden bei 66 Grad Celsius und dreißig Sekunden bei 72 Grad Celsius, dann zwei Minuten bei 72 Grad Celsius und Halten bei vier Grad Celsius. Quantifizieren Sie als Nächstes die DNA-Konzentration in den Bibliotheken und poolen Sie die Bibliotheken in gleichen molaren Mengen für die Sequenzierung, wobei Sie auf etwa vier Nanomolare abzielen. Sequenzieren Sie nun die gepoolte ECS-Bibliothek mit der Illumina-Sequenzierungsplattform mit den folgenden Sequenzierungseinstellungen: zwei mal 144 Paired-End-Lesevorgänge, acht Zyklen von Index eins und 16 Zyklen von Index zwei.

Die DNA eines Patienten mit einer Mutation in GATA1 wurde in kommerzieller genomischer DNA mit dem ursprünglichen VAF von 0,19 verdünnt. Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls erwies sich das ECS als quantitativ bis zu einem Niveau von eins bis 10.000 für die Einzelnukleotidvariante. Als nächstes wurden Buffy-Coat-Proben von zwanzig gesunden Personen mit einem kommerziellen Sequenzierungspanel analysiert, das aus 568 Amplikons besteht.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass 109 klonale somatische Mutationen in beiden Replikaten von mindestens einem Entnahmezeitpunkt vorhanden waren, wobei variante Allelfraktionen im Bereich von 0,0003 bis 0,1451,21 der Mutationen mit bekannten kosmischen Repräsentationen ausgewählt und jeweils mittels digitaler Tröpfchen-PCR validiert wurden. Um das fehlerkorrigierte Expressionsniveau des Protokolls zu demonstrieren, wurde ein angepasstes Genpanel, bestehend aus 415 Genen, von denen bekannt ist, dass sie mit verschiedenen Krebsarten assoziiert sind, verwendet, um eine Bibliothek zu erstellen, die aus dem am häufigsten exprimierten Exon jedes Gens erstellt wurde. Das Expressionsniveau des Transkripts mit geringer Abundanz war zwischen den Replikaten sehr gut reproduzierbar.

Die digitale Tröpfchen-PCR wurde dann verwendet, um sechs ausgewählte Gene mit unterschiedlicher Expression zu validieren. Ein Vergleich zeigt, dass das Expressionsniveau von Genen vom ECS-Protokoll korrekt erfasst wurde, ohne dass eine Normalisierung erforderlich war. Sobald Sie die Technik beherrschen, kann diese Technik bequem in eineinhalb Tagen durchgeführt werden.

Der Großteil der Zeit wird aus der Inkubation bestehen, und die manuelle Handhabung nimmt etwa 30-40 % der erforderlichen Gesamtzeit in Anspruch, je nachdem, wie viele Proben die Forscher gleichzeitig verarbeiten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, eine Replikatsequenzierungsbibliothek für dieselbe Probe zu haben. Dies gibt Ihnen mehr Sicherheit, dass eine niederfrequente Mutation wahr positiv ist, wenn die Mutation selbst in beiden Replikaten unabhängig voneinander Kern ist.

Nach diesem Verfahren könnten andere Angelegenheiten wie ECS-RNA durchgeführt werden, um Fragen wie den Nachweis eines Transkripts mit geringer Abundanz oder eines Fusionstranskripts zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, vor allem auf dem Gebiet der hämatologischen Malignome, und wir verwenden diese Technik, um präleukämische Klone bei gesunden Personen zu erforschen sowie um minimale Resterkrankungen bei Leukämiepatienten zu erkennen, die sich in Remission befinden.