Name: Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Erfahren Sie die fehlerkorrigierte Sequenzierung mit Illumina-Chemie zur Erkennung seltener Mutationen in DNA- und RNA-Proben. Diese Methode ermöglicht die sensitive Detektion klonaler Varianten für genomische Analysen.

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Wir danken die Teilnehmern in der Kinder-Onkologie-Gruppe AAML1531-Studie und der Nurses' Health Studie für ihre Beiträge in Form von Patientenproben. Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (UM1 CA186107, RO1 CA49449 und RO1 CA149445), der Kinderuni Discovery Institute of Washington St. Louis Children Hospital (MC-II-2015-461) und Eli Seth Matthews Leukämie Stiftung finanziert.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier zeigen wir eine Reihe von Fehler korrigiert Sequenzierung Protokolle, die leicht umsetzbar sind, um Mutationen mit niedrigen VAFs bei verschiedenen Krankheiten zu studieren. Der wichtigste Faktor ist die Einarbeitung von UMIs mit jedem Molekül vor der Sequenzierung, da sie Fehlerkorrektur des rohen lautet ermöglichen. Die hier beschriebenen Methoden erlauben Forschern, maßgeschneiderte UMIs zu handelsüblichen gen Panels und selbst entworfenen Gen-spezifischen Oligos zu integrieren.
Standardprotokoll NGS schließt den Nachweis von Mutationen mit VAF unter 2 % aufgrund der Sequenzierung Fehlerquote, und dies schränkt die Anwendung der NGS in Studien, in denen der Nachweis von seltenen Varianten entscheidend ist. Unter Umgehung den Normalsatz der NGS-Fehler, ermöglicht ECS empfindliche Detektion dieser rohen Varianten. Nachweis von pathogenen Mutationen, wenn diese Mutationen erst entstehen (also mit niedrigen VAF) unbedingt zum Beispiel Frühförderung der Krankheit14,15zu informieren. In der Leukämie-Forschung, die Erkennung von minimal Residual Krankheit (residual leukämischen Zellen nach der Behandlung) informiert risikostratifizierung und Behandlungsmöglichkeiten in einer Art und Weise zu informieren, die binäre Fluss durchflusszytometrischen Bewertungen können nicht genutzt werden. Darüber hinaus gilt ECS zirkulierenden Tumor Nukleinsäure erkennen und bewerten metastasiertem Potenzial bei soliden Tumorpatienten durch die Bewertung für die Anwesenheit/Abwesenheit sowie die Variante Belastung durch bestimmte Mutationen, die Merkmale des primären Tumor-16.
Wie in Tabelle 1gezeigt hat, hängt die Macht der Verwendung Binomialverteilung-basierte Position-spezifischen Fehlermodell Varianten nennen die Anzahl der sequenzierten Bibliotheken sowie die Tiefe der Sequenzierung verwendet, um das Fehlermodell zu bauen. Die Robustheit des Modells Fehler steigt mit höheren Anzahl von Proben und Sequenzierung eingehender. Es wird empfohlen, mindestens 10 sequenzierte Proben mit einem Durchschnitt von Fehler-Korrektur lesen Sie Abdeckung von 3000 X pro Probe verwenden, um für jede Probe ein Fehler-Profil zu erstellen. Die Position-spezifischen Ansatz ist ähnlich wie MAGERI, sondern anstelle einer aggregierten Fehlerquote für alle sechs unterschiedliche Substitution (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, modellieren wir jede Ersetzung unabhängig voneinander in jeder Position. Zum Beispiel eine Fehlerrate von C > T an einer bestimmten genomische Position unterscheidet sich von einer anderen Position. Unser Ansatz berücksichtigt auch eine Sequencing Batch Wirkung, wie die Basis Substitution Rate beobachtet in einem Sequenzierung Lauf laufen unterschiedlich sein könnte. Daher ist es wichtig, jede Position für alle Arten der Substitution zu modellieren, vor allem, wenn Proben aus verschiedenen Sequenzierung läuft für die Modellerstellung zusammengefasst sind.
Ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung ein ECS-Experiment ist der gewünschte Nachweisgrenze. Die Schönheit der NGS Studien ist, dass sie in Bezug auf die Gene/Ziele von Interesse, Nachweisgrenze (diktiert von der Tiefe der Sequenzierung) und Anzahl der Personen abgefragt leicht skaliert werden können. Zum Beispiel, wenn die Forscher interessiert, seltene Mutationen in zwei Amplifikate mit einer Nachweisgrenze von 0,0001 zu finden sind, können sie maximal 75 Proben in einem einzigen Sequenzierung mit MiSeq V2-Chemie, die bis zu 15 Millionen mal gelesen Ausgänge ausgeführt bündeln (2 Amplifikate * 10.000 Moleküle * 10 liest für Fehlerkorrektur * 75 Proben = 15 Millionen Sequenzierung liest). Forscher können die Anzahl der Moleküle ins Sequenzierung oder die Anzahl der gepoolten Proben in einer einzigen Sequenzierung ausgeführt, um die Nachweisgrenze anpassen variieren. In unseren Studien sollen wir Mutationen mit einer Nachweisgrenze von 0,0001 VAF (01:10, 000) mit dem Illumina-gen-Panel. Wir verwenden routinemäßig 250 ng DNA, um sicherzustellen, dass genügend Moleküle erfasst werden, zur Erreichung die oben genannten Nachweisgrenze zu starten. Forscher können um mit geringeren Menge an DNA zu beginnen (50 ng empfohlen) Wenn die gewünschte Nachweisgrenze liegt > 0,001 VAF.
Da die UMIs auf die i5-Indizes angehängt sind, verfügen über Sequenzierung Einstellungen entsprechend geändert werden. Zum Beispiel wir 16 N UMIs verwendet, und die Sequenzierung Einstellungen waren 2 x 144 gekoppelten Ende liest, 8 Zyklen der Index 1 und 16 Zyklen von Index 2 im Gegensatz zu den üblichen 8 Zyklen der Index 2. Der Index 2 Takt ist durch einen Rückgang der Gesamtzahl der Zyklen zugeteilt, der liest ausgeglichen. Wenn Forscher 12N UMIs10,17verwenden entscheiden, sollten die Einstellungen 12 Zyklen der Index 2 geändert werden.
Diese UMI-basierte Sequenzierung Methode ist optimiert, um für Sequenzierung Fehler zu korrigieren. Es bleibt suboptimale im Umgang mit PCR-Jackpotting, das ist ein Thema für alle Verstärkung basierende Methode. Wir Runden von Post-Sequenzierung und Post-Bioinformatik-Validierung mit DdPCR durchgeführt, und wir kaum erkennen Fehlalarme durch PCR Jackpotting. Dennoch empfiehlt es sich, dass Forscher die Experimente mit High Fidelity Polymerase um zu niedrige Verstärkung Fehler zu gewährleisten.

Wie wir Alter, Belastung durch Mutagene und stochastische Fehler während der Zellteilung führen zu die Ansammlung von somatischen Aberrationen in das Genom, und dies zugrunde liegt die grundlegende Pathogenese der malignen Transformation, Neuro-developmental Krankheiten, pädiatrische Störungen und normalem Altern1,2. Somatische Mutationen mit Krankheit fahren Potenzial sind wichtige diagnostische und prognostische Biomarker zur Früherkennung und Risiko Management3,4,5. Um physiologische Clonogenesis besser zu verstehen, ist die klinische informieren und Entscheidungen, die genaue Quantifizierung Charakterisierung dieser Mutationen und von vorrangiger Bedeutung. Next Generation Sequencing (NGS) wird derzeit zur klonale Mutationen in heterogenen DNA-Proben zu studieren; NGS ist jedoch begrenzt zur Identifizierung von Mutationen bei > 0,02 Variante Allel Bruchteil (VAF) – aufgrund der inhärenten Fehler-Rate von 0,5-2,0 % der Sequenzierung Plattformen6,7,8. Infolgedessen tracking diagnostisch und prognostisch bedeutende somatische Varianten am unteren VAF gelingt nicht mit standard NGS.
Vor kurzem wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Fehlerquote von NGS8,9,10,11zu umgehen. Diese Methoden nutzen Molekulare Kennzeichnung, wodurch Fehlerkorrektur nach Sequenzierung. Jedes Molekül oder genomische Fragment in der Sequenzierung Bibliothek ist mit einer zufälligen einzigartige molekulare Bezeichner (UMI) markiert, die spezifisch für dieses Molekül ist. Die UMIs sind von Permutationen einer Reihe von randomisierten Nukleotiden (8 – 16 N) gebaut. Ein zweite Probe-spezifischen Barcode ist auch in den Workflow integriert, die es ermöglicht, Multiplexen mehrerer Proben in der gleichen NGS-Sequenzierung ausgeführt. PCR-Amplifikation erfolgt auf der Molekular tagged Bibliothek, und anschließend wird die Bibliothek für die Sequenzierung gesendet. Während der Vorbereitung der Bibliothek wird erwartet, dass Fehler nach dem Zufallsprinzip auf die genomische Fragment während der PCR-Amplifikation und Sequenzierung8eingeführt werden. Um zufällige Abfolge Fehler zu entfernen, sind rohe Sequenzierung liest nach UMI gruppiert. Artefakte aus Sequenzierung sollen nicht in alle Lesevorgänge mit der gleichen UMI an derselben genomische Position durch die stochastische Natur der Einführung, vorhanden sein, während eine wahre Variante wird originalgetreu verstärkt und sequenziert in alle Lesevorgänge, die die gleichen UMI teilen. Die Artefakte sind Bioinformatically entfernt. Hier beschreiben wir drei Methoden der Fehler korrigiert Sequenzierung (ECS) optimiert, im Labor für DNA, Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs) und kleinen einfügen-Löschungen (Indels) zu identifizieren, und RNA zur Quantifizierung der Genexpression unten erleichtern die NGS Fehlerschwellenwert.
Die erste Methode beschreibt eine Möglichkeit, somatische selten mit Gen spezifische Primer entwickelt von Forschern zu suchen. Vor der Bibliothek Vorbereitung sollten Forscher Primer an die Fragmente von Interesse gezielt gestalten. Wir haben die Web-app-Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Amplifikate von 200 – 250 bp sind ideal für Polymerase-Kettenreaktion (PCR), da diese werden sobald UMIs eingeflossen sind, erzeugen, überlappende gepaart Ende liest mit 150 bp gepaart Ende liest. Die optimale Grundierung Gestaltung Bedingungen verwendet werden: Grundierung Mindestgröße = 19; Optimale Grundierung Größe = 25; Maximale Grundierung Größe = 30; Minimale Tm = 64 ° C; Optimale Tm = 70 ° C; Maximale Tm = 74 ° C; Maximale Differenz Tm = 5 ° C; Minimale GC-Gehalt = 45; Maximale GC-Gehalt = 80; Anzahl zurück = 20; Maximal 3' Ende Stabilität = 100.
In Methode 2 beschreiben wir eine Methode kombiniert die ECS-DNA-Protokoll mit Illumina Chemie für klonale SNVs und so selten wie 0,0001 VAF mit handelsüblichen gen-Paneele, die Hunderte von Amplifikate enthalten kleine Indels vermessen. Wir haben die TruSight myeloische Sequenzierung Panel (Illumina) für unser Experiment verwendet und entwickelt eine erweiterte Gruppe um zusätzliche Gene von Interesse für pädiatrische myeloische Erkrankungen gehören. Diese Platten haben nicht eindeutige molekularen Kennungen (UMIs) angeboten, die Fehlerkorrektur, erleichtern würde, so dass wir unsere eigene Adapter Strategie diese Platten hinzugefügt haben. ECS sollte funktionieren ebenso gut mit allen anderen Panels entwickelt, um nach Genen verbunden mit verschiedenen Krankheiten zu bereichern. Nach DNA-Isolierung und anschließende Quantifizierung von Gewebe oder Probe von Interesse, es wird empfohlen, mindestens 500 ng des Bestandes DNA pro Probe. Wir machen regelmäßig eine einzelne Sequenzierung Bibliothek mit 250 ng DNA um flussabwärts als viel einzigartige genomische Fragment wie möglich erfassen liest Deduplizierung und VAF-Berechnung. Eine optionale replizieren Sequenzierung Bibliothek vorgenommen werden, mit dem restlichen 250 ng DNA. Wir machen immer zwei replizieren Bibliotheken pro Probe, und wir betrachten nur die Ereignisse, die unabhängig voneinander in beide Replikate als richtig positive Ergebnisse festgestellt. Wir implementierten auch eine genomische Position-spezifischen binomische Fehlermodell zur Erhöhung der Genauigkeit der Variante4,13aufrufen.
Schließlich beschreiben wir eine Methode, die Kopplung von ECS an RNA Sequenzierung für Transkript Quantifizierung mit handelsüblichen QIAseq gezielt RNA-Paneele (Qiagen). Die UMIs erforderlich für Deduplizierung können und Fehlerkorrektur in den Kits aufgenommen wurden, und Forscher Bibliotheken nach Empfehlungen des Herstellers. Bioinformatically, können Forscher folgen die Pipeline für ECS-DNA, die im Detail im Abschnitt Protokoll erklärt werden skizziert.

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5 Adapter Sequenzen</td><td>Integrated DNA</td> <td>Technologies-NEBNext</td><td></td></tr> <tr><td>Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchenerzeugungsöl für EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchen-Digital-PCR-System</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well-Platten</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Kartuschen für QX200/QX100 Tröpfchengenerator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Dichtungen für QX200/QX100 Tröpfchengenerator</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalysator</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight Myeloisches Sequenzierungspanel</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td>Johns Hopkins</td> <td>University-Customized</td><td></td></tr> <tr><td>QIAseq Targeted RNA Panel</td><td>Qiagen-Rneasy</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

seltenes ereigniserkennung mit fehler korrigiert dna und rna sequenzierung

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Techniken der konventionellen Next Generation Sequencing (NGS) haben immense genomische Charakterisierung für mehr als zehn Jahren ermöglicht. Insbesondere wurde NGS verwendet, das Spektrum der klonalen Mutationen in Bösartigkeit zu analysieren. Obwohl wesentlich effizienter als herkömmliche Sanger, NGS Kämpfe mit der Identifizierung von seltenen klonaler und subclonal Mutationen aufgrund seiner hohen Fehlerquote von ~0.5–2.0 %. So standard NGS hat ein Limit von Erkennung für Mutationen, die > 0,02 Variante Allel Bruchteil (VAF). Während die klinische Signifikanz für Mutationen dieser selten bei Patienten ohne bekannte Krankheit unklar für Leukämie behandelte Patienten haben sich deutlich verbessert Ergebnisse wenn Resterkrankung ist < 0,0001 durch Durchflusszytometrie. Um diese artifizielle Hintergrund der NGS zu mildern, wurden zahlreiche Methoden entwickelt. Hier beschreiben wir eine Methode für Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung (ECS), die Kennzeichnung einzelner Moleküle mit einem 16 bp zufällige Index für Fehlerkorrektur und 8 bp patientenspezifische Index für multiplexing beinhaltet. Unsere Methode erkennt und klonale Mutationen bei Variante Allel Brüche (VAFs) zwei Größenordnungen niedriger als die Nachweisgrenze von NGS und so selten wie 0,0001 VAF zu verfolgen.

Mit Targeted Error-Corrected für die DNA-Sequenzierung haben wir einen Nachweis der Prinzip Experiment verdünnen mutierten Patienten DNA in kommerziellen genomischer DNA durchgeführt. Der Patient hatte eine Mutation im GATA1 (ChrX:48650264, C &gt; G) mit original VAF von 0,19. In Abbildung 1 zeigen wir, dass ECS quantitative auf ein Niveau von 1: 10.000 für Einzel-Nukleotid-Variante ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Abbildung 1: Verdünnungsreihen GATA1 SNV nachzuweisen, dass ECS quantitative auf das Niveau von 1: 10.000 ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Wir zeigen auch, dass die ECS-DNA zuverlässig seltene klonale Mutationen in Genen wiederkehrend in Erwachsenen akute myeloische Leukämie (AML) bei gesunden älteren Personen4 erkennt. Wir erhalten buffy Coat Proben von 20 gesunde Individuen in der Nurse Health Study überhöht etwa ~ 10 Jahre auseinander. An diesen Proben haben wir das ECS-DNA-Panel-Protokoll angewendet. Für dieses Experiment wir die Illumina TruSight myeloische Sequenzierung Panel, das besteht aus 568 Amplifikate (Weitere Informationen auf Gen-Liste auf https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html) angepasst und sequenziert 80 Bibliotheken ab 20 Personen (2 Sammlungen zu verschiedenen Zeitpunkten, 2 Wiederholungen pro Person pro Zeit Punkt) mit Illumina NextSeq Plattform, die einen Durchschnitt von 47,7 Millionen gepaart Ende liest und einen Durchschnitt von 3,4 Millionen Fehler korrigiert generiert Konsensus-Sequenzen pro Bibliothek4. Die mittlere Nukleotid-Abdeckung pro Bibliothek war etwa 6.000 x (3,4 Millionen geteilt durch 568). Für jede Probe errichteten wir ein Position-spezifische Fehler Profil sequenzierte Bibliotheken, die nicht aus derselben Probe verwenden. Wir fanden 109 klonale somatische Mutationen, die in beiden Wiederholungen mindestens eine Sammelstelle Zeit vorhanden waren. Diese Mutationen haben VAF von 0,0003 – 0.1451. Wir wählten 21 Mutationen mit bekannten kosmischen Darstellungen und überprüft alle 21 Mutationen in ein oder zwei Sammlung Zeit Punkt(e) mit DdPCR (n = 34, Abbildung 2, adaptiert von jungen Et Al. 20164).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Abbildung 2: Mutationen von ECS identifiziert wurden über DdPCR mit höchst konkordante VAFs verifiziert. (n = 34, modifiziert von jung Et Al. 20164). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
In Bezug auf Fehler korrigiert Ausdruck mit ECS-RNA-Protokoll wir ein Gen Panel mit QIAseq-Chemie, die besteht aus 416 Gene bekannt, verbunden mit verschiedenen Krebsarten (adaptiert von QIAseq menschlichen Krebs Transkriptom-Panel), und wir werden angepasst die am häufigsten geäußerten Exon eines bestimmten Gens (Gen Liste in ergänzenden Material 1) verstärkt. Wir sequenziert die Bibliotheken mit Illumina MiSeq Plattform in gepaart-End-Format, die durchschnittlich 8,3 Millionen Lesevorgänge pro Bibliothek gegeben hat, und uns gelungen, einen Durchschnitt von 0,417 Millionen Fehler korrigiert Konsensus-Sequenzen einzufangen. Wir zeigten, dass die Expression von niedrigen Fülle Transkript (&lt; 1.000 Transkript Graf in 50 ng von Gesamt-RNS) ist sehr reproduzierbar auf Wiederholungen (Datenpunkt n = 300, Abbildung 3). Validierung von DdPCR (sechs ausgewählter Gene von unterschiedlichem Ausmaß des Ausdrucks) gezeigt, dass die Expression von Genen durch das ECS-Protokoll ohne die Notwendigkeit einer Normalisierung korrekt eingenommen worden war.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Abbildung 3: Top, Korrelation der Mitschrift zählt von ECS-RNA auf Wiederholungen der gleichen Probe (n = 300). Unten, Abschrift, die Grafen von ECS identifiziert wurden durch DdPCR überprüft (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Diese Methode kann dazu beitragen, einige Schlüsselfragen in verschiedenen Forschungsbereichen zu beantworten, wie z. B. den Nachweis von präkanzerösen Klonen, die prognostische Beurteilung von Leukämiepatienten nach der Behandlung und die Identifizierung potenziell pathogener Mutationen bei Knochenmarkspendern. Spencer wird dieses Verfahren mit mir demonstrieren, er ist Techniker im Labor. In diesem Video wird beschrieben, wie das Error-corrected Sequencing Protocol mit der Illumina-Chemie und kommerziell erhältlichen Gen-Panels kombiniert werden kann, um klonale Einzelnukleotidvarianten und kleine Indels mit einer Sensitivität von eins zu 10.000 zu detektieren.Um die erforderlichen eindeutigen molekularen Identifikatoren zu integrieren, verwenden kundenspezifische 16N i5- und i7-Adapter PCR. Bereiten Sie zunächst den Q5 Master Mix vor, der eine Polymerase mit höherer Wiedergabetreue als die im Handel erhältliche Alternative verwendet. Kombinieren Sie dann für jede Reaktion 37,5 Mikroliter Q5 Master Mix, sechs Mikroliter von fünf mikromolaren 16N i5-Adaptern, die die eindeutigen molekularen Identifikatoren sind, und sechs Mikroliter i7-Adapter.Wenn das Ziel Multiplexing ist, verwenden Sie verschiedene i7-Adapter in separaten Beispielen. Führen Sie nun die PCR mit den folgenden Parametern durch: dreißig Sekunden bei 98 Grad Celsius, gefolgt von vier bis sechs Zyklen von zehn Sekunden bei 98 Grad Celsius, dreißig Sekunden bei 66 Grad Celsius und dreißig Sekunden bei 72 Grad Celsius. Beenden Sie die Reaktion mit einer zweiminütigen Verlängerung bei 72 Grad Celsius und halten Sie sie bei vier Grad Celsius.Dann hängen die beiden PCR-Zyklen, die Sie an ihnen durchführen müssen, höchstwahrscheinlich von der Größe des Gen-Panels ab, das Sie verwenden, aus unserer Erfahrung ist eine Vier-Zyklus-PCR ausreichend, wenn das Gen-Panel etwa 1500 verschiedene Wege genspezifischer Oligos aufweist, während ein Panel mit etwa fünf bis 600 Oligopaaren etwa sechs PCR-Zyklen erfordert. Als nächstes reinigen Sie die PCR-Reaktionen mit magnetischen Kügelchen, fügen Sie 56,25 Mikroliter magnetische Bead-Lösung in jedes 75-Mikroliter-PCR-Produkt hinzu, übertragen Sie dann jede Reaktion in ein separates 1,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung, mischen Sie es durch mindestens zehnmaliges Auf- und Abpipettieren und warten Sie fünf Minuten. Übertragen Sie dann die Mischungen in einen Magnethalter und lassen Sie die Überstände zwei Minuten lang klar.Entfernen und entsorgen Sie dann die Überstände. Fügen Sie dann 200 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu, warten Sie dreißig Sekunden und entfernen Sie dann das Ethanol. Wiederholen Sie diesen Ethanol-Waschschritt einmal und lassen Sie die Kügelchen dann fünf Minuten lang an der Luft trocknen.Zum Schluss eluieren Sie die modifizierten Bibliotheken aus den Kügelchen in zwanzig Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser. Legen Sie dann die Röhrchen auf ein Magnetgestell, um die magnetischen Kügelchen vom Eluenten zu trennen. Führen Sie zunächst zehnfache serielle Verdünnungen der ECS-Bibliotheken aus dem vorherigen Schritt durch, bis zu einem Teil pro 1.000 in PCR-Streifen.Bereiten Sie als Nächstes einen Master Mix in einer 1,5-Milliliter-Tube vor. Kombinieren Sie für jede Reaktion 10 Mikroliter ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 Mikroliter P5-Primer, 0,2 Mikroliter P7-Primer und 4,6 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser. Pipettieren Sie dann 15 Mikroliter des EvaGreen Master Mix in einen neuen Satz Röhrchen und fügen Sie schließlich fünf Mikroliter eines bis 1.000 ECS gereinigten Produkts zum Master Mix hinzu.Stellen Sie als Nächstes PCR-Tröpfchen mit dem Tröpfchengenerator her. Laden Sie zuerst die Kassette, pipettieren Sie 70 Mikroliter Tröpfchenerzeugungsöl in die Vertiefung der Kassette, markiertes Öl und pipettieren Sie 20 Mikroliter des ddPCR-Reaktionsgemisches in die gut markierte Probe. Decken Sie dann die Kassette mit einer Gummidichtung ab und laden Sie sie in den Tröpfchengenerator, und die gesamte Tröpfchenerzeugung wird fortgesetzt.Nun werden mit einer Mehrkanalpipette langsam über fünf Sekunden 45 Mikroliter Tröpfchen aus jeder Kassettenvertiefung auf eine neue PCR-Platte geladen. Versiegeln Sie dann die PCR-Platte mit einer Aluminiumfolie. Verstärken Sie nun das Signal in den Tröpfchen unter den folgenden Bedingungen: fünf Minuten bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 40 Zyklen von dreißig Sekunden bei 95 Grad Celsius und einer Minute bei 63 Grad Celsius, dann kühlen Sie die Reaktion fünf Minuten lang auf vier Grad Celsius ab, bevor Sie sie für fünf Minuten auf 90 Grad Celsius erhöhen. und dann bei vier Grad Celsius halten.Bereiten Sie als Nächstes die ddPCR-Vorlagen-Tröpfchenlesemaschine vor. Wählen Sie die Parameter für die absolute Quantifizierung und die Verwendung des QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Lassen Sie dann die Reaktionen durch den Tröpfchenleser laufen.Wenn die ddPCR-Analyse abgeschlossen ist, wenden Sie auf jede Probe die gleichen divisiven Schwellenwerte an. Normalisieren Sie dann jede Bibliothek auf die gewünschte Anzahl von Molekülen. Beginnen Sie mit 50-Mikroliter-Reaktionen, bestehend aus 25 Mikrolitern Q5 Master Mix, zwei Mikrolitern einem mikromolaren P5-Primer, zwei Mikrolitern einem mikromolaren P7-Primer und 21 Mikrolitern normalisierter DNA-Bibliothek.Führen Sie als Nächstes die PCR mit den folgenden Parametern durch: 30 Sekunden bei 98 Grad Celsius, gefolgt von 16 Zyklen von 10 Sekunden bei 98 Grad Celsius, dreißig Sekunden bei 66 Grad Celsius und dreißig Sekunden bei 72 Grad Celsius, dann zwei Minuten bei 72 Grad Celsius und Halten bei vier Grad Celsius. Quantifizieren Sie als Nächstes die DNA-Konzentration in den Bibliotheken und poolen Sie die Bibliotheken in gleichen molaren Mengen für die Sequenzierung, wobei Sie auf etwa vier Nanomolare abzielen. Sequenzieren Sie nun die gepoolte ECS-Bibliothek mit der Illumina-Sequenzierungsplattform mit den folgenden Sequenzierungseinstellungen: zwei mal 144 Paired-End-Lesevorgänge, acht Zyklen von Index eins und 16 Zyklen von Index zwei.Die DNA eines Patienten mit einer Mutation in GATA1 wurde in kommerzieller genomischer DNA mit dem ursprünglichen VAF von 0,19 verdünnt. Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls erwies sich das ECS als quantitativ bis zu einem Niveau von eins bis 10.000 für die Einzelnukleotidvariante. Als nächstes wurden Buffy-Coat-Proben von zwanzig gesunden Personen mit einem kommerziellen Sequenzierungspanel analysiert, das aus 568 Amplikons besteht.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass 109 klonale somatische Mutationen in beiden Replikaten von mindestens einem Entnahmezeitpunkt vorhanden waren, wobei variante Allelfraktionen im Bereich von 0,0003 bis 0,1451,21 der Mutationen mit bekannten kosmischen Repräsentationen ausgewählt und jeweils mittels digitaler Tröpfchen-PCR validiert wurden. Um das fehlerkorrigierte Expressionsniveau des Protokolls zu demonstrieren, wurde ein angepasstes Genpanel, bestehend aus 415 Genen, von denen bekannt ist, dass sie mit verschiedenen Krebsarten assoziiert sind, verwendet, um eine Bibliothek zu erstellen, die aus dem am häufigsten exprimierten Exon jedes Gens erstellt wurde. Das Expressionsniveau des Transkripts mit geringer Abundanz war zwischen den Replikaten sehr gut reproduzierbar.Die digitale Tröpfchen-PCR wurde dann verwendet, um sechs ausgewählte Gene mit unterschiedlicher Expression zu validieren. Ein Vergleich zeigt, dass das Expressionsniveau von Genen vom ECS-Protokoll korrekt erfasst wurde, ohne dass eine Normalisierung erforderlich war. Sobald Sie die Technik beherrschen, kann diese Technik bequem in eineinhalb Tagen durchgeführt werden.Der Großteil der Zeit wird aus der Inkubation bestehen, und die manuelle Handhabung nimmt etwa 30-40 % der erforderlichen Gesamtzeit in Anspruch, je nachdem, wie viele Proben die Forscher gleichzeitig verarbeiten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, eine Replikatsequenzierungsbibliothek für dieselbe Probe zu haben. Dies gibt Ihnen mehr Sicherheit, dass eine niederfrequente Mutation wahr positiv ist, wenn die Mutation selbst in beiden Replikaten unabhängig voneinander Kern ist.Nach diesem Verfahren könnten andere Angelegenheiten wie ECS-RNA durchgeführt werden, um Fragen wie den Nachweis eines Transkripts mit geringer Abundanz oder eines Fusionstranskripts zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, vor allem auf dem Gebiet der hämatologischen Malignome, und wir verwenden diese Technik, um präleukämische Klone bei gesunden Personen zu erforschen sowie um minimale Resterkrankungen bei Leukämiepatienten zu erkennen, die sich in Remission befinden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Pooled DNA-Sequenzierung ist eine schnelle und kostengünstige Strategie, um seltene Varianten mit komplexen Phänotypen assoziiert in großen Kohorten zu erkennen. Hier beschreiben wir die computergestützte Analyse von gepoolten, Next-Generation-Sequenzierung von 32 Krebs-Genen unter Verwendung des SPLINTER Software-Paket. Diese Methode ist skalierbar und für jeden interessierenden Phänotyp.

Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER

Dieses Video demonstriert die chipbasierte digitale PCR — eine Variation der digitalen PCR-Technik, die bei der Erkennung seltener Transkriptvarianten nützlich ist. Die PCR-Reaktion wird in die Kammern eines nanofluidischen Chips aufgeteilt, von denen jede als unabhängige Reaktion wirkt. Die Detektion von Fluoreszenzsignalen aus den Kammern mit amplifizierten Targets bestätigt das Vorhandensein seltener Transkriptvarianten in der Probe.

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Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

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