Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikel von Erwachsenen Schistosoma japonicum

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, extrazelluläre Vesikel aus dem Medium von in vitro kultiviertem adultem Schistosoma japonicum zu isolieren. Mit dieser Methode kann EV in in vitro Kulturmedium effizient aus adultem Schistosoma japonicum isoliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, extrazelluläre Vesikel effizient aus kurzfristigem In-vitro-Kulturmedium zu isolieren, wodurch der Stress minimiert werden kann, der möglicherweise zu einer unphysiologischen EV-Sekretion führt.

Die Demonstration wird von Juntao Liu, einem Techniker aus meinem Labor, durchgeführt. Sammeln Sie die Parasiten in einem 500-Milliliter-Becherglas und waschen Sie sie dreimal gründlich, aber vorsichtig mit 200 Millilitern warmem PBS. Halten Sie die Waschungen kurz und nutzen Sie die Schwerkraftsedimentation, um die Parasiten zu trennen.

Als nächstes werden auf 90-Millimeter-Schalen etwa 200 Wurmpaare pro Schale angerichtet. Waschen Sie die Parasiten in der Schüssel noch zweimal durch Schwerkraftsedimentation. Verwenden Sie für diese Wäschen warmes RPMI-Medium, das mit Stift-Streptokokken ergänzt wird.

Ersetzen Sie die zweite Wäsche durch 40 Milliliter des Mediums ohne Antibiotika. Kultivieren Sie die Parasiten dann zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid. Nach zwei Stunden wird das Medium von den Platten in Zentrifugenröhrchen umgefüllt und dann die Eier und Wurmreste bei 2.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zusammengefasst

Sammeln Sie dann den Überstand und geben Sie ihn in ein frisches Röhrchen. Als nächstes filtrieren Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikron-Spritzenvorsatzfilter und sammeln die gefilterte Lösung in einem Dialysierbeutel mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 3,5 Kilodalton. Dialysieren Sie dann die Lösung über Nacht mit 8%PEG8000 Lösung bei vier Grad Celsius.

Dieser Schritt ist wichtig, um die Ausbeute an extrazellulären Vesikeln zu erhöhen. Übertragen Sie am nächsten Tag die dialysierte Lösung in ein neues Röhrchen und fügen Sie 0,5 Volumina des gesamten Exosom-Isolationsreagenzes hinzu. Mischen Sie die Lösung, bis sie homogen ist, und inkubieren Sie sie über Nacht bei etwa fünf Grad Celsius.

Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie die Mischung bei 15.000 g für eine Stunde bei etwa fünf Grad Celsius. Als nächstes aspirieren und verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet der Elektrofahrzeuge in zwei Millilitern PBS. Das Pellet wird wahrscheinlich nicht sichtbar sein.

Für die Western-Blot-Analyse bestimmen Sie zunächst die Proteinkonzentration der Probe, z. B. mit dem BCA-Assay. Bereiten Sie dann 10 bis 20 Mikrogramm EVs in 22,5 Mikrolitern RIPA-Puffer vor. Fügen Sie als Nächstes 7,5 Mikroliter 4X-Ladepuffer hinzu und erhitzen Sie die Mischung fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius.

Nach der Wärmebehandlung trennen Sie die extrazellulären Vesikelproteine auf einem 12%%SDS-PAGE-Gel. Nach dem Ausführen des Gels werden die Proteine in die PVDF-Membran übertragen. Sondieren Sie die Membran mit Anti-CD63-Antikörpern in einer Verdünnung von eins bis 1.000.

Behandeln Sie dann die Membran mit Anti-Kaninchen-IgG-HRP in einer Verdünnung von ein bis 5.000. Verwenden Sie nun ein ECL-Detektionsreagenz, um die Membran zu entwickeln, und folgen Sie mit der Analyse auf einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. Beginnen Sie mit dem Transfer von fünf Mikrogramm Probe in ein Ultrazentrifugenröhrchen aus Polypropylen und stellen Sie das Volumen mit dem Medium RPMI-1640 auf 12 Milliliter ein.

Dann zentrifugieren Sie die Probe bei 110.000 g für 90 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig aspirieren und verwerfen. Bereiten Sie dann eine 2X extrazelluläre Vesikelsuspension vor, indem Sie dem Pellet einen Milliliter Verdünnungsmittel C hinzufügen.

Resuspendieren Sie das Pellet durch vorsichtiges Pipettieren. Bereiten Sie nun frische 2X-Färbelösung vor. Geben Sie zwei Mikroliter des ethanolischen Farbstoffs PKH67 zu einem Milliliter Verdünnungsmittel C in einem Mikrofuge-Röhrchen und mischen Sie es gut.

Färben Sie dann die Probe, indem Sie die beiden Lösungen miteinander mischen und die Mischung vier Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Stoppen Sie als Nächstes die Färbung, indem Sie vier Milliliter FBS hinzufügen und eine weitere Minute warten. Fügen Sie dann RPMI-1640 Medium hinzu, um das Volumen auf 12 Milliliter einzustellen, und schleudern Sie die Suspension herunter, um die gefärbten Vesikel zu isolieren.

Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Suspendieren Sie dann die pelletierten, PKH67-markierten Elektrofahrzeuge in 12 Millilitern RPMI-1640-Medium. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation, aber sammeln Sie diesmal die Vesikel in einem Milliliter PBS.

den Aufnahmeassay über Nacht Kulturen von Säugetierzellen in Sechs-Well-Platten vor. Geben Sie am nächsten Morgen fünf Mikrogramm PKH67-markierte Vesikel in jede Vertiefung und setzen Sie die Kultur zwei bis vier Stunden lang fort. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.

Fixieren Sie dann die Zellen für 15 Minuten, waschen Sie sie zweimal mit PBS und färben Sie sie vor der Bildgebung mit DAPI. Schistosomen im Leberstadium wurden 28 Tage nach der Infektion von Kaninchen entnommen. Extrazelluläre Vesikel wurden dann aus den Schistosomenwürmern entnommen und analysiert.

Ihre Partikelgröße, die durch die Malvern-Nanopartikelanalyse bestimmt wurde, lag zwischen 100 und 400 Nanometern, wobei der Großteil der Bevölkerung bei 220 Nanometern lag. Die Transmissionselektronenmikroskopie ergab, dass die extrazellulären Vesikel rund sind und einen Durchmesser zwischen 100 und 200 Nanometern haben. Die Western-Blotting-Analyse zeigte, dass die isolierten extrazellulären Vesikel mit CD63-Antikörpern erkannt wurden, die ein typischer extrazellulärer Vesikelmarker sind.

Die Fluoreszenzmikroskopie von PKH67-markierten extrazellulären Vesikel, die von den NCTC-Klon-1469-Zellen internalisiert wurden, zeigte, dass die extrazellulären Vesikel hauptsächlich im Zytoplasma der Empfängerzellen verteilt waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie EV in In-vitro-Kulturmedium aus adultem Schistosoma japonicum isoliert werden kann.