Name: Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikel von Erwachsenen Schistosoma japonicum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Lernen Sie die Isolierung extrazellulärer Vesikel von adulten Schistosoma japonicum aus Kurzzeit-In-vitro-Kulturmedium. Diese Methode minimiert Parasitenstress und ermöglicht physiologische EV-Sekretion für parasitologische Forschung.

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Diese Studie war, im Teil oder im ganzen, unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (31472187 und 31672550) und The Agricultural Science and Technology Innovation Program von der chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften.

Alle Tierversuche wurden genehmigt durch die lokale Ethikkommission des Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences (erlauben Nummer: SHVRIAU-14-0101).
1. in-vitro- Kultur von Schistosomen
Hinweis: Schistosomen repräsentieren ein Biohazard. Arbeiter tragen Latex Handschuhe überhaupt mal beim Umgang mit Würmern, schistosomal Suspensionen oder anderen biologische Materialien im Zusammenhang. Neuseeland-Kaninchen wurden mit ~ 2.000 Cercariae über Abdominal-Belichtung infiziert. Schistosomen Stadium der Leber wurden gesammelt von Kaninchen mit S. Japonicum Cercariae auf 28 Tage nach der Infektion durch Durchblutung der Leber und mesenterialen Adern angesteckt. Die Verfahren der Wurm Sammlung haben in früheren Publikationen Berichten Studien an Mäusen18verwiesen.
<ol><li>Parasiten in einen 500-mL-Becherglas zu sammeln. Waschen Sie sie gründlich und sanft 3 X mit 200 mL vorgewärmt (37 ° C) PBS (pH 7,4).</li>
	<li>~ 200 Wurm Paare für jedes 90 mm Petrischale zu trennen. Waschen Sie die Parasiten gründlich und sanft 2 X mit 50 mL vorgewärmt (37 ° C) RPMI-1640 Kulturmedium mit 100 U von Penicillin und 100 mg/mL von Streptomycin.</li>
	<li>Pflegen Sie Parasiten in 40 mL vorgewärmten RPMI-1640 Kulturmedium ohne Antibiotika bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 bei einer Dichte von ~ 5 Wurm Paare /mL für 2 Stunden in 90 mm Petri dish. Noten: RPMI 1640 Medium sollte nicht Serum enthalten, ansonsten exogene extrazelluläre Vesikel vorgestellt werden.</li>
</ol>(2) vorbehandelten Zustand Medien
<ol><li>Sammeln Sie das Kulturmedium zu und Zentrifugieren Sie das Medium bei 4 ° C bei 2.000 × g für 30 min Eiern entfernen und Wurm tegmental Schutt.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand auf eine frische Rohr und Filtern Sie dann die Lösung mit Hilfe eines Filters 0,22 µm Spritze.</li>
	<li>Die filtrierte Lösung in einem dialysierter Beutel zu sammeln (Molekulargewicht Cut-Off: 3.5kD) und dann die Lösung mit 8 % PEG8000 Lösung bei 4 ° C über Nacht Dialyse. Noten: Dieser Schritt ist wichtig, SjEVs zu bereichern, zur Erhöhung der Ausbeute der SjEVs Isolation.</li>
</ol>(3) die Isolierung des SjEVs
<ol><li>Übertragen der dialysierten Lösung zu einem neuen Schlauch und fügen Sie 0,5 Volumen des gesamten exosom Isolierung Reagens.</li>
	<li>Mischen Sie die Lösung gut durch aufschütteln oder pipettieren rauf und runter um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung bei 2 ° C bis 8 ° C über Nacht.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Mischung bei 15.000 × g für 1 h bei 2 ° C bis 8 ° C.</li>
	<li>Aspirieren und den überstand verwerfen. Noten: EVs enthalten die Kugel am unteren Ende der Röhre (in den meisten Fällen nicht sichtbar).</li>
	<li>Aufschwemmen der EVs Pellet in 2 mL PBS und speichern Sie anschließend die EVs-Lösung bei-80 ° C bis zur weiteren Analyse.</li>
</ol>4. Charakterisierung der EVs von Western Blotting
<ol><li>Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins der SjEVs Probe, z. B. durch BCA-Assay.</li>
	<li>10-20 µg des EFD in 22,5 µL RIPA Puffer vorzubereiten. Dann fügen Sie 7,5 µL 4 x laden Puffer und Hitze für 5 min bei 95 ° C.</li>
	<li>Trennen Sie SjEVs Proteine durch 12 % SDS-PAGE Gel.</li>
	<li>Die Proteine auf PVDF-Membran übertragen und dann mit Anti-CD63-Antikörper (1:1, 000 Verdünnung), gefolgt von sondieren mit Anti-Kaninchen IgG-HRP (1:5, 000 Verdünnung) Sonde.</li>
	<li>Verwenden Sie ECL-Erkennung Reagenz für Membranentwicklung und erkennen Sie die Signale zu, indem eine Chemilumineszenz imaging-System.</li>
</ol>5. Charakterisierung der EVs von Transmissions-Elektronenmikroskopie
<ol><li>200 Mesh Formvar-beschichtete Netze 2 µL der isolierten SjEVs hinzu und dann bei Raumtemperatur trocknen lassen.</li>
	<li>Färben mit 2 % Phosphotungstic Acid für 1 min und dann bei Raumtemperatur trocknen lassen.</li>
	<li>Laden Sie die Gitter auf dem Probenhalter des Transmissions-Elektronenmikroskop und einen 80 kV Elektronenstrahl für Bilderfassung ausgesetzt.</li>
</ol>6. SjEVs Label mit PKH67 und Zelle-Aufnahme-Test
Noten: Alle weiteren Schritte wurden bei Raumtemperatur (20-25 ° C), durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>5 µg SjEVs Lösung in einem konischen Boden aus Polypropylen Röhrchen zu übertragen und die Lautstärke bis 12 mL durch Hinzufügen von RPMI 1640 Medium.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die SjEVs bei 110.000 × g für 90 min bei 4 ° C um SjEVs pellet.</li>
	<li>Aspirieren Sie nach Zentrifugation sorgfältig überstand. Hinweis: Der PKH67 ethanolische Farbstoff sollte nicht direkt an das Pellet SjEV hinzugefügt werden, heterogene Färbung und reduzierte Zellviabilität sonst würde.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 2 X EV Suspension Lösung durch Zugabe von 1 mL Verdünnungsmittel C zum Pellet SjEV; um komplette Dispersion zu gewährleisten, mit sanften pipettieren aufzuwirbeln.</li>
	<li>Kurz vor der Färbung im Verdünnungsmittel C, bereiten Sie einen frischen 2 x Farbstofflösung durch 1 mL Verdünnungsmittel C in einem Polypropylen Zentrifugenröhrchen 2 µL der PKH67 ethanolische Farbstofflösung hinzufügen und mischen um gut zu zerstreuen.</li>
	<li>Fügen Sie schnell die 1 mL 2 X EV Suspension (Schritt 6.4) zu 1 mL 2 x Farbstofflösung (Schritt 6.5) und sofort mischen die Probe durch pipettieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 4 min.</li>
	<li>Die Färbung durch Zugabe von 4 mL FBS zu stoppen und dann 1 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie RPMI1640 Medium, um die Lautstärke zu 12 mL und dann bei 110.000 × g bei 4 ° C für 90 min zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen des Überstands und RPMI1640 Medium, um die PKH67 mit der Bezeichnung SjEV Pellets aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 110.000 × g bei 4 ° C für 90 min. einmal waschen und dann hinzufügen PBS um die SjEVs Pellets aufzuwirbeln.</li>
</ol>7. SjEVs Zelle Aufnahme Assay
<ol><li>Samen Säugerzellen wie NCTC Klonen 1469 Zellen oder HEK293T in 6-Well-Platten (2 × 105 Zellen pro Well) und über Nacht Kulturzellen.</li>
	<li>5 µg PKH67 versehenen SjEVs hinzufügen und dann Kulturzellen bei 37 ° C für 2-4 h.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und waschen Sie die Zellen mit PBS zweimal.</li>
	<li>Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Formaldehyd-Lösung für 15 min und zweimal mit PBS gewaschen.</li>
	<li>Fleck Zellkerne mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Beobachten Sie die Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie.</li>
</ol>

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<li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+roles+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Neuere Studien über EFD nachgewiesen, dass Schistosome EVs spielen eine wichtige Rolle in Wirt-Pathogen Interaktionen3,9,12,16. Weitere Adresse unbedingt ihre Regulierungsaufgaben EVs von Schistosomen zu isolieren. Hier beschreiben wir eine alternative Methode zur SjEV Isolierung. Diese Methode führt zu eine breiten Palette Größe von SjEVs, von 100 nm bis 400 nm, bei Erwachsenen S. Japonicu...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind eine Bevölkerung von kleinen Membrane-springen Vesikel mit verschiedenen Proteine, Lipide und Nukleinsäuren gekapselt. Jüngste Studien gezeigt, dass EVs eine entscheidende Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation spielen und sind beteiligt an der Regulation des zahlreiche physiologische Prozesse, einschließlich der Zellentwicklung, Immunregulation, Angiogenese und Zelle Migration2, 3,4,5. Sammeln Beweise gibt, dass EVs, zirkulierenden exosomen und ihre Fracht MiRNA potenzielle Biomarker für bestimmte Krankheiten6darstellt.
Einige Protozoen wie Trichomonas Vaginalis, Trypanosomen Trypanosomaund Leishmania Spp., haben gezeigt, dass EVs; absondern zu können Helminthen zusätzlich gefunden wurden, EVs in lebenden absondern beherbergt7. Parasitäre EVs wurden gezeigt, bei der Aufrechterhaltung der Infektion, Pathogenität8und Immunregulation9einbezogen werden. Aktuelle Studien in Schistosomen beide Schistosoma Mansoni (S. Mansoni) 10,11 und S. Japonicum12 haben gezeigt, dass Erwachsene Schistosomen exosom erinnernden Bläschen absondern, die möglicherweise die funktionale Vorschriften bestimmte biologische Prozesse beteiligt.
Bisher wurden verschiedene Methoden zur extrazellulären Vesikel, wie Ultrazentrifugation, Ultrafiltration13, die Verwendung von Polymer-basierten Reagenzien, Größe-Ausschluss-Chromatographie und immunoaffinitäts Isolation isolieren. Diese verschiedenen Methoden besitzen ihre eigenen Vorzüge und Grenzen14. Im Allgemeinen gilt Ultrazentrifugation die Goldstandard-Methode für die Vesikel Isolierung. Allerdings leidet diese Methode aus der Beschränkung des potenziellen EV Aggregation14.
In Schistosomen, eine Reihe von Methoden zur Isolierung der EV gemeldet wurden: dazu gehören Ultrazentrifugation11,12,10 und die Verwendung von kommerziellen EV Isolation Kit16 für mehrere Stufen (Eiern16, Schistosomula11, Erwachsene Schistosomen10,12,17). Da die Microvesicles einer breiten Palette von mehreren hundert Nanometer bis tausend Nanometer groß sind, entwickelten wir einer alternativen Methode, die kombiniert mit dem Einsatz von Bank-Zentrifuge, Ultrafiltration und eine kommerzielle EV isolierungskit der EVs von isolieren Erwachsenen Schistosoma Japonicum. Die isolierten EVs in der Regel besaß einen Durchmesser von 100-400 nm und wurden erfolgreich durch den empfängerzellen verinnerlicht.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total Exosome Isolation Reagenz (aus Zellkulturmedien)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>Zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln von S. japonicum</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>Zur Markierung von Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC 11875119</td><td></td><td>Zur Parasitenkultur</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC 15140122</td> 0,22 <td>μm</td><td></td></tr><tr><td> m Spritzenfilter</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialyseschlauch</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&Handel; Immobilon&Handel; Westliches chemilumineszierendes HRP-Substrat (ECL)</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>WBKLS0100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>BCA-Kit</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Antikörper</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungssäure</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTC Klon 1469 Zellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CCL-9.1&Handel;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Chemolumineszenz-Bildgebungssystem</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskopie</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Wasser</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Zentrifuge 5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP Ultrazentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und charakterisierung von extrazellulären vesikel von erwachsenen schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind häutig Vesikel, die von einer Vielzahl von Zellen in der extrazellulären Mikroumgebung veröffentlicht. EFD repräsentieren eine Bevölkerung von heterogenen Vesikel, deren Größe zwischen 40 und 1.000 nm. Gesammelte Beweise gezeigt, dass EVs in Erreger-Wirt Interaktionen eine wichtige regulatorische Rolle spielen. Ein tiefes Verständnis der schistosome-EVs soll Einblicke in die Mechanismen schistosome--Wirt Interaktionen, ermöglicht die Entwicklung neuer Strategien gegen Bilharziose. Hier wollen wir weiter studieren EVs Funktionen in Schistosomen durch Vorlage eines Protokolls für die Isolierung und Charakterisierung des EFD vom Erwachsenen Schistosoma Japonicum (S. Japonicum). EVs wurden von in-vitro- Kulturmedium mit Zentrifugation kombiniert mit einem kommerziellen exosom isolierungskit isoliert. Die isolierten S. Japonicum EVs (SjEVs) in der Regel besitzen einen Durchmesser von 100-400 nm, und zeichnen sich durch Übertragung elektronischer Mikroskopie und westliche Beflecken. Die Verwendung von PKH67 Farbstoff-markierten SjEVs hat gezeigt, dass SjEVs durch den empfängerzellen internalisiert werden. Insgesamt bietet unser Protokoll eine alternative Methode zur Isolierung von EVs von Erwachsenen Schistosomen; die isolierten SjEVs möglicherweise für Funktionsanalyse geeignet.

Um die Ausbeute an isolierten SjEVs mit Hilfe der beschriebenen Protokoll zu quantifizieren, haben wir die Konzentration des Proteins von der isolierten SjEVs von 28 Tagen Erwachsene Schistosomen Zugriff auf BCA Protein Assay verwendet. Wie aus Tabelle 1hervorgeht, reichte die SjEV Proteinkonzentration von 208 µg bis 250 µg pro 100 mL Medium (Tabelle 1). Die Partikelgröße Malvern Nanopartikel Analyse bestimmt darauf hingewiesen, dass die isolierte SjEVs v...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur extrazellulären Vesikel (EVs) Isolierung in in Vitro kultivierten Medium von Erwachsenen Schistosoma Japonicumbeschreiben.

Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikel von Erwachsenen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, extrazelluläre Vesikel aus dem Medium von in vitro kultiviertem adultem Schistosoma japonicum zu isolieren. Mit dieser Methode kann EV in in vitro Kulturmedium effizient aus adultem Schistosoma japonicum isoliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, extrazelluläre Vesikel effizient aus kurzfristigem In-vitro-Kulturmedium zu isolieren, wodurch der Stress minimiert werden kann, der möglicherweise zu einer unphysiologischen EV-Sekretion führt.Die Demonstration wird von Juntao Liu, einem Techniker aus meinem Labor, durchgeführt. Sammeln Sie die Parasiten in einem 500-Milliliter-Becherglas und waschen Sie sie dreimal gründlich, aber vorsichtig mit 200 Millilitern warmem PBS. Halten Sie die Waschungen kurz und nutzen Sie die Schwerkraftsedimentation, um die Parasiten zu trennen.Als nächstes werden auf 90-Millimeter-Schalen etwa 200 Wurmpaare pro Schale angerichtet. Waschen Sie die Parasiten in der Schüssel noch zweimal durch Schwerkraftsedimentation. Verwenden Sie für diese Wäschen warmes RPMI-Medium, das mit Stift-Streptokokken ergänzt wird.Ersetzen Sie die zweite Wäsche durch 40 Milliliter des Mediums ohne Antibiotika. Kultivieren Sie die Parasiten dann zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid. Nach zwei Stunden wird das Medium von den Platten in Zentrifugenröhrchen umgefüllt und dann die Eier und Wurmreste bei 2.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zusammengefasst.Sammeln Sie dann den Überstand und geben Sie ihn in ein frisches Röhrchen. Als nächstes filtrieren Sie den Überstand durch einen 0,22-Mikron-Spritzenvorsatzfilter und sammeln die gefilterte Lösung in einem Dialysierbeutel mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 3,5 Kilodalton. Dialysieren Sie dann die Lösung über Nacht mit 8%PEG8000 Lösung bei vier Grad Celsius.Dieser Schritt ist wichtig, um die Ausbeute an extrazellulären Vesikeln zu erhöhen. Übertragen Sie am nächsten Tag die dialysierte Lösung in ein neues Röhrchen und fügen Sie 0,5 Volumina des gesamten Exosom-Isolationsreagenzes hinzu. Mischen Sie die Lösung, bis sie homogen ist, und inkubieren Sie sie über Nacht bei etwa fünf Grad Celsius.Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie die Mischung bei 15.000 g für eine Stunde bei etwa fünf Grad Celsius. Als nächstes aspirieren und verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet der Elektrofahrzeuge in zwei Millilitern PBS. Das Pellet wird wahrscheinlich nicht sichtbar sein.Für die Western-Blot-Analyse bestimmen Sie zunächst die Proteinkonzentration der Probe, z. B. mit dem BCA-Assay. Bereiten Sie dann 10 bis 20 Mikrogramm EVs in 22,5 Mikrolitern RIPA-Puffer vor. Fügen Sie als Nächstes 7,5 Mikroliter 4X-Ladepuffer hinzu und erhitzen Sie die Mischung fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius.Nach der Wärmebehandlung trennen Sie die extrazellulären Vesikelproteine auf einem 12%%SDS-PAGE-Gel. Nach dem Ausführen des Gels werden die Proteine in die PVDF-Membran übertragen. Sondieren Sie die Membran mit Anti-CD63-Antikörpern in einer Verdünnung von eins bis 1.000.Behandeln Sie dann die Membran mit Anti-Kaninchen-IgG-HRP in einer Verdünnung von ein bis 5.000. Verwenden Sie nun ein ECL-Detektionsreagenz, um die Membran zu entwickeln, und folgen Sie mit der Analyse auf einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. Beginnen Sie mit dem Transfer von fünf Mikrogramm Probe in ein Ultrazentrifugenröhrchen aus Polypropylen und stellen Sie das Volumen mit dem Medium RPMI-1640 auf 12 Milliliter ein.Dann zentrifugieren Sie die Probe bei 110.000 g für 90 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig aspirieren und verwerfen. Bereiten Sie dann eine 2X extrazelluläre Vesikelsuspension vor, indem Sie dem Pellet einen Milliliter Verdünnungsmittel C hinzufügen.Resuspendieren Sie das Pellet durch vorsichtiges Pipettieren. Bereiten Sie nun frische 2X-Färbelösung vor. Geben Sie zwei Mikroliter des ethanolischen Farbstoffs PKH67 zu einem Milliliter Verdünnungsmittel C in einem Mikrofuge-Röhrchen und mischen Sie es gut.Färben Sie dann die Probe, indem Sie die beiden Lösungen miteinander mischen und die Mischung vier Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Stoppen Sie als Nächstes die Färbung, indem Sie vier Milliliter FBS hinzufügen und eine weitere Minute warten. Fügen Sie dann RPMI-1640 Medium hinzu, um das Volumen auf 12 Milliliter einzustellen, und schleudern Sie die Suspension herunter, um die gefärbten Vesikel zu isolieren.Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Suspendieren Sie dann die pelletierten, PKH67-markierten Elektrofahrzeuge in 12 Millilitern RPMI-1640-Medium. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation, aber sammeln Sie diesmal die Vesikel in einem Milliliter PBS.Bereiten Sie für den Aufnahmeassay über Nacht Kulturen von Säugetierzellen in Sechs-Well-Platten vor. Geben Sie am nächsten Morgen fünf Mikrogramm PKH67-markierte Vesikel in jede Vertiefung und setzen Sie die Kultur zwei bis vier Stunden lang fort. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.Fixieren Sie dann die Zellen für 15 Minuten, waschen Sie sie zweimal mit PBS und färben Sie sie vor der Bildgebung mit DAPI. Schistosomen im Leberstadium wurden 28 Tage nach der Infektion von Kaninchen entnommen. Extrazelluläre Vesikel wurden dann aus den Schistosomenwürmern entnommen und analysiert.Ihre Partikelgröße, die durch die Malvern-Nanopartikelanalyse bestimmt wurde, lag zwischen 100 und 400 Nanometern, wobei der Großteil der Bevölkerung bei 220 Nanometern lag. Die Transmissionselektronenmikroskopie ergab, dass die extrazellulären Vesikel rund sind und einen Durchmesser zwischen 100 und 200 Nanometern haben. Die Western-Blotting-Analyse zeigte, dass die isolierten extrazellulären Vesikel mit CD63-Antikörpern erkannt wurden, die ein typischer extrazellulärer Vesikelmarker sind.Die Fluoreszenzmikroskopie von PKH67-markierten extrazellulären Vesikel, die von den NCTC-Klon-1469-Zellen internalisiert wurden, zeigte, dass die extrazellulären Vesikel hauptsächlich im Zytoplasma der Empfängerzellen verteilt waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie EV in In-vitro-Kulturmedium aus adultem Schistosoma japonicum isoliert werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

Dieser Artikel stellt Methoden zur Erzeugung, Reinigung und Quantifizierung von Caenorhabditis elegans extrazellulären Vesikeln vor.

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung von microRNAs aus Zeckenspeicheldrüsen und gereinigten extrazellulären Vesikeln. Dies ist ein universelles Verfahren, das häufig verwendete Reagenzien und Verbrauchsmaterialien kombiniert. Die Methode ermöglicht auch die Verwendung einer kleinen Anzahl von Zecken, was zu hochwertigen microRNAs führt, die leicht sequenziert werden können.

Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Hier beschreiben wir die Anreicherung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Leberkrebsgewebe durch eine optimierte differentielle Ultrazentrifugationsmethode.

Eine Anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel aus Leberkrebsgewebe

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Milz-Exosomen von Mäusen vor, wobei eine Kombination aus Verdau mit Kollagenase Typ I und Ultrazentrifugation verwendet wird.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Milzgewebe der Maus

Dieses Protokoll zielt darauf ab, interstitielle extrazelluläre Vesikel (SkM-EVs) der Skelettmuskulatur aus Muskelgewebe von Nagetieren durch mechanische Ablösung, enzymatische Dissoziation, Filtration und differentielle Ultrazentrifugation zu isolieren und zu reinigen. Es zeugt von Beständigkeit und Zuverlässigkeit. Die isolierten SkM-EVs liefern Einblicke in die Muskelhomöostase und -krankheiten, mit potenziellen Anwendungen als diagnostische Biomarker oder therapeutische Vehikel.

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Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskeln und Knochenmark mittels enzymatischer Verdauung und Größenausschlusschromatographie, wodurch reproproduzierbare Rückgewinnung von vesikelangereicherten Fraktionen aus strukturell komplexen, leistungsarmen Geweben für die nachgelagerte molekulare Analyse ermöglicht wird.

Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskulatur und Knochenmark mittels Größenausschlusschromatographie

Zerkarien Transformation und In-vitro- Anbau von Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosoma mansoni Eier sind potente Stimulatoren der T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2) Immunantwort, die charakteristisch für Parasitenbefall, Asthma und allergische Entzündung. Dieses Protokoll nutzt S. mansoni Ei Injektion an einen CD4 Th2-Zytokin-induzierte Entzündungsreaktion in der Lunge, Lunge durch Granulombildung um das Ei gekennzeichnet, Eosinophilie und Makrophagen-Aktivierung Alternative zu generieren.

Mit den Eizellen<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als ein<em&gt; In vivo</em&gt; Modell von Helminthen-induzierten Lungenentzündung

Lernen Sie die Isolierung extrazellulärer Vesikel von adulten Schistosoma japonicum aus Kurzzeit-In-vitro-Kulturmedium. Diese Methode minimiert Parasitenstress und ermöglicht physiologische EV-Sekretion für parasitologische Forschung.

Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikel von Erwachsenen Schistosoma japonicum

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