Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zytosolisches Protein zu erfassen, das an eine spezifische Sequenz bindet, die sich im RNA-Molekül in Mesotheliomzellen befindet. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der RNA-Biologie zu beantworten, z. B. ob ein vorhergesagtes RNA-bindendes Protein Adenosin oder eine uridinreiche Sequenz in einem Transkript binden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die funktionelle Charakterisierung stabilisierender oder destabilisierender Elemente ergänzt, die durch Reporterassays beurteilt werden.

Technik wird von Dr. Jelena Kresoja-Rakic, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Um das Protokoll zu beginnen, erhalten Sie zuvor präparierte ACC-MESO-4-Zellen mit einer Konfluenz von 80 bis 90 %. Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit 15 Millilitern 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und aspirieren Sie das PBS.

Fügen Sie dann drei Milliliter 0,25 %iges Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie den Kulturkolben drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie sieben Milliliter des supplementierten RPMI-1640-Mediums hinzu, sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie sie fünf Minuten lang mit 200-mal g herunter. Saugen Sie dann das Medium an und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1,5 Millilitern 1X PBS.

Übertragen Sie dann die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Schleudern Sie die Zellen erneut bei 500 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten herunter. Nach dem Schleudern entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren das Zellpellet mit 1,5 Millilitern eiskaltem 1X PBS und schleudern die Zellen bei 500 mal g und vier Grad Celsius für drei Minuten herunter.

Verwerfen Sie den Überstand und schätzen Sie das Packungsvolumen des Zellpellets, indem Sie das Röhrchen mit dem Zellpellet mit einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 10, 20, 50 und 100 Mikrolitern 1X PBS vergleichen. Fügen Sie 200 Mikroliter eiskaltes zytoplasmatisches Extraktionsreagenz oder CER I hinzu, ergänzt mit zwei Mikrolitern 1X-Proteinase-Inhibitor. Drehen Sie das Pellet 15 Sekunden lang kräftig und inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis.

Geben Sie 11 Mikroliter eiskaltes zytoplasmatisches Extraktionsreagenz II oder CER II hinzu, wirbeln Sie es fünf Sekunden lang kräftig vor und inkubieren Sie das Röhrchen eine Minute lang auf Eis. Wirbeln Sie die Probe fünf Sekunden lang kräftig vor und zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 16.000 g Getränk. Den Überstand in das saubere, vorgekühlte Rohr auf Eis geben.

Das verbleibende Pellet wird in 100 Mikrolitern eiskaltem nuklearen Extraktionsreagenz (NER) resuspendiert, ergänzt mit einem Mikroliter Proteinase-Inhibitor, und 15 Sekunden lang kräftig vortexen. Inkubieren Sie die Probe 40 Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie sie alle 10 Minuten für 15 Sekunden durch. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei 16.000 mal g.

Übertragen Sie den Überstand, bei dem es sich um die Kernproteinfraktion handelt, in ein sauberes, vorgekühltes Rohr. Messen Sie sofort die Proteinkonzentration mit der Bicinchoninic-Methode. Bereiten Sie dann 25 Mikroliter Aliquots von zytosolischen und nuklearen Extrakten vor.

Frieren Sie diese Aliquote ein, indem Sie sie fünf Sekunden lang in flüssigen Stickstoff legen, und lagern Sie sie direkt bei minus 80 Grad Celsius. Übertragen Sie fünf Mikroliter 10-mikromolare RNA-Sonden in dünnwandige 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang in einer PCR-Maschine bei 85 Grad Celsius. Legen Sie die Röhren sofort auf Eis.

Für eine einzelne 30-Mikroliter-Reaktion geben Sie 10 Mikroliter der zuvor vorbereiteten Mischung in das RNA-haltige Röhrchen. Geben Sie vorsichtig 15 Mikroliter PEG 30% in die Reaktion und verwenden Sie eine frische Spitze, um die Reaktion zu mischen. Inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei 16 Grad Celsius.

Bereiten Sie am nächsten Tag die Reagenzien vor. Geben Sie 70 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die RNA-Markierungsreaktionsröhrchen. 100 Mikroliter Chloroform-Isoamylalkohol hinzufügen, kurz vortexen und die Probe drei Minuten lang bei 13.000 g drehen.

Entfernen Sie vorsichtig nur die obere Phase. Vermeiden Sie es, die untere Phase zu berühren. Übertragen Sie es in ein neues nukleasefreies 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie 10 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid, einen Mikroliter Glykogen und 300 Mikroliter eiskaltes 100%iges Ethanol hinzu. Stellen Sie das Röhrchen zwei Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius auf. Nach zwei Stunden zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 300 Mikroliter eiskaltes 70%iges Ethanol hinzu und zentrifugieren Sie erneut fünf Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vollständig und trocknen Sie das Pellet 15 Minuten lang an der Luft.

Resuspendieren Sie das Pellet in 20 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Inkubieren Sie die RNA zwei Minuten lang bei 90 Grad Celsius und legen Sie sie auf Eis. Legen Sie die markierte RNA während des folgenden Schritts der Vorwäsche der Streptavidin-Magnetkügelchen auf Eis.

Waschen Sie 50 Mikroliter magnetische Streptavidin-Kügelchen pro 50 Picomole RNA vor. Wirbeln Sie das Röhrchen 15 Sekunden lang mit Streptavidin-Magnetkügelchen ein. Nach dem schnellen Vortexen 200 Mikroliter mit abgeschnittenen Pipettenspitzen in ein sauberes 1,5-Milliliter-Safe-Lock-Röhrchen geben.

Stellen Sie dann die Röhre auf einen magnetischen Ständer, so dass sich die Kügelchen an der Seite der Röhre sammeln, und warten Sie eine Minute. Entfernen Sie die Resuspensionsflüssigkeit. Um die Kügelchen zu waschen, nehmen Sie das Röhrchen vom Magnetständer, fügen Sie 400 Mikroliter 0,1-molare Natriumhydroxid und 0,05 molare Natriumchloridlösung hinzu und pipettieren Sie mehrmals vorsichtig auf und ab.

Setzen Sie die Röhre wieder auf den Magnetständer und warten Sie eine Minute. Sammelt dann den Überstand ein. Waschen Sie die Kügelchen mit 200 Mikrolitern 100-Millimolar-Natriumchlorid und entfernen Sie den Überstand.

Fügen Sie 200 Mikroliter 20-millimolare Tris hinzu, resuspendieren Sie die Kügelchen durch Pipettieren und stellen Sie das Röhrchen auf den Magnetständer. Entfernen Sie nach einer Minute den Überstand. Nehmen Sie dann das Röhrchen vom Magnetständer, fügen Sie 200 Mikroliter 1X RNA-Capture-Puffer hinzu und resuspendieren Sie die Streptavidin-Magnetkügelchen durch kurzes Vortexen.

Entfernen Sie 50 Mikroliter magnetische Streptavidin-Kügelchen und geben Sie sie mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze in jedes markierte RNA-Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer Walze. Nachdem sich das Röhrchen eine Minute lang auf dem Magnetstativ befunden hat, entfernen Sie den Überstand.

Fügen Sie den Kügelchen 50 Mikroliter 20-millimolare Tris hinzu und resuspendieren Sie sie. Legen Sie dann die Röhren in den Magnetständer. Entfernen Sie nach einer Minute den Überstand.

Geben Sie 100 Mikroliter 1X Protein-RNA-Bindungspuffer zu den Kügelchen und resuspendieren Sie sie. Setzen Sie dann die Röhren wieder in den Magnetständer ein. Sobald die Röhrchen eine Minute lang im Ständer waren, sammeln Sie den Überstand.

Fügen Sie 100 Mikroliter Mastermix B hinzu, resuspendieren Sie durch sanftes Auf- und Abpipettieren und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Reaktionsgefäße werden 60 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einer Walze inkubiert. Fahren Sie mit den Wasch- und Elutionsschritten fort.

Legen Sie die Schläuche in einen Magnetständer, sammeln Sie den Durchfluss und übertragen Sie ihn in einen neuen Schlauch. Pipettieren Sie 100 Mikroliter 1X Waschpuffer auf die Kügelchen, resuspendieren Sie sie vorsichtig, setzen Sie sie wieder in den Ständer ein, warten Sie eine Minute und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.

Geben Sie 40 Mikroliter Elutionspuffer zu den magnetischen Kügelchen, mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren und inkubieren Sie auf einem Röhrchenschüttler. Legen Sie die Röhrchen in einen Magnetständer, warten Sie eine Minute und entnehmen Sie eine Eluatprobe. Auf Eis legen und für die nachgelagerte Analyse verwenden.

Um die Reinheit der nukleären/zytosolischen Fraktionen zu demonstrieren, wurden die Proteine mittels Western Blot analysiert, wobei sich zeigte, dass Alpha-Tubulin nur in der zytosolischen Fraktion und PARP-Protein nur in der Kernfraktion nachgewiesen wurde. Das Eluat aus der CALB2-Drei-Prime-UTR-ARE-Sonde zeigte eine Bindung von humanem R und fehlte im Eluat der mutierten Sonde und der nicht verwandten RNA-Sonde, die das eisenresponsive Protein bindet. Um die Spezifität zwischen der CALB-Three-Prime-UTR und der humanen R weiter zu demonstrieren, wurde die Membran mit Anti-Mesothelin-Antikörpern untersucht, und alle drei Eluatproben zeigten kein Vorhandensein von Mesothelin, was darauf hindeutet, dass das stabilisierende ARE-Motiv in der CALB2-Three-Prime-UTR spezifisch an das humane R-Protein binden kann.

Die Coomassie-Färbung des Gels zeigt, dass gleiche Mengen an Proteinen verwendet wurden, um mit den drei verschiedenen RNA-Sonden zu inkubieren. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine zusätzliche proteinzentrierte Methode, wie z.B. die Immunpräzipitation eines gegebenen Proteins, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welche Sequenz daran bindet. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der RNA-Biologie, mögliche Interaktionspartner einer bestimmten RNA zu erforschen.