Name: Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Desthiobiotin-Streptavidin-Affinitätsmethode zur Reinigung RNA-bindender Proteine in Mesotheliomzellen. Diese Technik erfasst zytosolische Proteine, die an ARE-Motive binden, und ergänzt funktionelle Charakterisierungsassays.

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Diese Arbeit wurde von der Swiss National Science Foundation Sinergia Grant CRSII3 147697, die Stiftung Für Angewandte Krebsforschung und Zürich Krebsliga unterstützt.

1. Vorbereitung der cytosolischen und nukleare Proteinfraktion
<ol><li>Platte 4 x 106 ACC-MESO-4 Zellen in einem T150 Zelle Kultur Kolben angebaut in RPMI - 1640 Medium mit 10 % FBS, 1 X Penicillin/Streptomycin (100 X) und 2 mM L-Glutamin (200 mM) ergänzt. Wenn Zellen einen Zusammenfluss von 80-90 % (~5-5.5 X 106 Zellen) erreicht haben, fahren Sie mit Proteingewinnung von Kernenergie und cytosolische Fraktion. Hinweis: ACC-MESO-4-Zell-Linie wurde aus dem RIKEN BioResource Zentrum11erhalten.</li>
	<li>Aspirieren Medium, Waschen der Zellen durch Zugabe von 15 mL 1 X PBS, kippen Sie die Platte vorsichtig ein paar Mal und 1 X PBS Aspirieren. Geben Sie 3 mL von 0,25 % Trypsin-EDTA und den Kultur-Kolben bei 37 ° C für 3 min inkubieren. Hinweis: Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop für Ablösung; Wenn noch Wasserhahn angebracht Mal der Kolben gegen die Handfläche einer Hand 3.</li>
	<li>7 mL RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10 % FBS, 1 X Penicillin/Streptomycin (100 X) und 2 mM L-Glutamin (200 mM) hinzufügen, sammeln die Zellen in einer 15 mL Tube und spin-down bei 200 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Aspirieren Sie Medium und Aufschwemmen Sie Zelle Pellet mit 1,5 mL 1 X PBS, dann übertragen Sie die Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Spin-down bei 500 X g und 4 ° C für 5 min. überstand verwerfen. Hinweis: Von diesem Schritt ab, führen Sie alle Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C und halten Sie alle Reagenzien auf Eis.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet mit eiskalten 1,5 mL 1 X PBS und Spin-down der Zellen bei 500 X g und 4 ° C für 3 min. Überstands verwerfen. Hinweis: Die benötigten Mengen an CER sind I, CER II und NER Reagenzien 10, 0,55 und 5 Bände geschätzten Zelle Pellet-Volumen, bzw. verpackt; Das folgende Protokoll nimmt ein Volumen von 20 µL. Wir empfehlen nur die erforderliche Menge an Reagenz CER Vorbereitung ich.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL des eiskalten zytoplasmatischen Extraktion Reagenz (CER ich) ergänzt mit 2 µL 1 x Proteinase Inhibitor, z.B., verdünnen Sie 1 Tablette der Protease-Inhibitor (EDTA-frei) in 500 µL Wasser, 100 X Lager zu erhalten. Diese Menge Reagens CER ich reicht, 20 µL eines Pellet-Zelle Volumen verpackt zu lösen.<ol>
<li>Um das Zellvolumen Pellets verpackt abschätzen zu können, vergleichen Sie die Röhrchen mit der Zelle-Pellet mit einem 1,5 mL Schlauch gefüllt mit 10, 20, 50 oder 100 µL 1 X PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet durch kräftig aufschütteln der Röhre für 15 s und inkubieren Sie das Rohr auf dem Eis für 10 min. hinzufügen 11 µL eiskalte zytoplasmatischen Extraktion Reagenz II (CER II) am Rohr energisch Wirbel für 5 s, und inkubieren Sie 1 min auf Eis.</li>
	<li>Vortex energisch für 5 s und Zentrifuge das Rohr auf 16.000 x g und 4 ° C für 5 min. übertragen überstand auf sauberes vorgekühlt Röhrchen auf dem Eis. Der Überstand wird der zytoplasmatischen Bruch, die weiter in der RNA-Pulldown-Experiment verwendet.</li>
	<li>Aufschwemmen der restlichen Pellets in 100 µL der eiskalte nuklearen Extraktion Reagenz (NER) ergänzt mit 1 µL Proteinase Inhibitor (100 X) und kräftig Vortexen 15 s. Es wird empfohlen, nur die erforderliche Menge an NER Reagenz ergänzt mit Protease-Inhibitoren vorbereiten.</li>
	<li>Inkubation die Probe auf dem Eis für 40 min mit gelegentlichen Vortexen für 15 s (alle 10 min).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 16.000 x g für 10 min. Transfer des Überstands (Dies ist die nukleare Proteinfraktion) in ein sauberes Röhrchen vorgekühlt.</li>
	<li>Unverzüglich durch die Messung der Konzentration des Proteins mit der Methode Bicinchoninic (BCA) (siehe Tabelle der Materialien). Um Protein Reinheit der einzelnen Fraktionen zu kontrollieren, führen Sie Immunoblotting (Abbildung 1) gegen α-Tubulin (positive Erkennung nur in die cytosolische Fraktion) und Poly-ADP-Ribose-Polymerase - PARP (positive Erkennung nur im nuklearen Bruch). Protein-Visualisierung finden Sie in Abschnitt 4.</li>
	<li>Um die proteinaktivität und ihrem nativen Zustand zu halten, bereiten Sie 25 µL Aliquots der cytosolischen und nukleare Extrakte. Snap-Freeze dieser Aliquote indem man sie in flüssigem Stickstoff für 5 s und Store direkt bei-80 ° C.</li>
</ol>2. Kennzeichnung der RNA mit Desthiobiotin
<ol><li>RNA-Sonden kommerziell synthetisiert und HPLC gereinigt. Aufschwemmen Sie mit Nuklease-freies Wasser bei 10 µM. Hinweis: Sonde Sequenzen sind in Tabelle 1aufgeführt.</li>
	<li>Verwenden Sie 50 Pmol RNA pro RNA-Pulldown Reaktion. Tauen Sie auf und halten Sie alle Reagenzien auf Eis, außer für 30 %, zum Label 3' Endstation der RNA Oligo PEG.</li>
	<li>5 µL 10 µM RNA-Sonden, gekennzeichnet als CALB2 3' UTR (sind) zu übertragen, CALB2 3' UTR (MtARE) und unabhängige-RNA (IRE), in 0,5 mL dünnwandige Microcentrifuge Rohre und brüten in einer PCR-Maschine bei 85 ° C für 5 min. legen die Rohre sofort auf Eis. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, da sie die Entspannung und die Zugänglichkeit der RNA-Sonde für die Beschriftung fördert.</li>
	<li>Für einen einzigen 30 µL Reaktion hinzufügen das RNA-haltigen Rohr den folgenden 10 µL-Mix: 3 µL Nuklease freies Wasser, 3 µL 10 x RNA Ligase Reaktion Puffer, 1 µL RNase-Inhibitor (40 U/µL) 1 µL Desthiobiotinylated Cytidin Bisphosphate (1 mM) , und 2 µL T4 RNA Ligase (20 U/µL). Hinweis: Um master-Mix A 3 Proben im Übermaß (3.2) vorzubereiten, 9,6 µL Nuklease kostenloses Wasser mischen, 9,6 µL 10 x RNA Ligase Reaktion Puffer, 3,2 µL RNase-Inhibitor (40 U/µL), 3,2 µL Desthiobiotinylated Cytidin Bisphosphate (1 mM) und 6,4 µL T4 RNA Ligase (20 U/µL).</li>
	<li>Fügen Sie sorgfältig 15 µL PEG 30 % auf die Reaktion. Verwenden Sie ein weiterer Tipp, um die Reaktion zu mischen. Die Reaktion über Nacht bei 16 ° c inkubieren</li>
	<li>Am nächsten Tag bereiten Sie Folgendes: 5 M NaCl (frisch/Nuklease-frei), Chloroform: Isoamyl Alkohol in 24:1-Verhältnis (z.B.pro Reaktion - 96 µL Chloroform und 4 µL Isoamyl Alkohol), eiskalte 100 % Ethanol und eiskalte 70 % Ethanol.</li>
	<li>Die RNA-Kennzeichnung Reaktionsgefäßen 70 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen. Hinzufügen von 100 µL Chloroform: Isoamyl Alkohol und Vortex kurz. Spin-Down bei 13.000 x g für 3 min. vorsichtig entfernen, nur die obere Phase und Übertragung auf eine neue Nuklease-freie 1,5 mL Tube; berühren Sie die untere Phase.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL 5 M NaCl, 1 µL von Glykogen und 300 µL eiskalte 100 % Ethanol. Platzieren Sie das Rohr bei-20 ° C für 2 h. Hinweis: Bei diesem Schritt kann das Experiment am nächsten Tag fortgesetzt werden.</li>
	<li>Zentrifuge auf 13.000 x g und 4 ° C für 15 min. sorgfältig entsorgen den überstand ohne zu stören das Pellet. 300 µL der eiskalte 70 % Ethanol und Zentrifuge wieder bei 13.000 x g und 4 ° C für 5 min hinzufügen.</li>
	<li>Verwerfen Sie den überstand vollständig zu und trocknen Sie das Pellet (15 min). Das Pellet in 20 µL Nuklease-freies Wasser aufschwemmen. Hinweis: Fahren Sie fort mit RNA-Pulldown am selben Tag.</li>
	<li>Inkubieren Sie die RNA bei 90 ° C für 2 min und auf Eis. Legen Sie die gekennzeichnet-RNA auf Eis im folgenden Schritt der Vorreinigung der Streptavidin magnetische Beads. Hinweis: Eine längere Inkubationszeit kann die RNA-Sonde beschädigen.</li>
</ol>(3) RNS-Protein-Pulldown
<ol><li>
Vorwäsche Streptavidin-magnetische Beads und Inkubation mit Desthiobiotin-RNA
	<ol>
<li>Verwenden Sie 50 µL Streptavidin magnetische Beads pro 50 Pmol RNA. Jedoch sollte dies je nach Experiment optimiert werden.</li>
		<li>Wirbel der Röhre mit Streptavidin-magnetische Beads für 15 s und schnell entfernen 200 µL (master-Mix; genug für 3 + 1 Reaktionen) in eine saubere 1,5 mL Safe-Lock-Rohr mit Schneiden Pipettenspitzen. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ, so dass die Perlen sammeln sich an der Seite des Rohres und 1 min. entfernen die Wiederfreisetzung Flüssigkeit warten.</li>
		<li>Um die Perlen zu waschen, entfernen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ, fügen Sie 400 µL 0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl-Lösung und sanft pipettieren nach oben und unten mehrmals hinzu. Setzen Sie den Schlauch wieder auf die Magnetstativ. Warten Sie 1 Minute und sammeln Sie den überstand zu. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen mit 200 µL 100 mm NaCl. Den überstand zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL 20 mm Tris (pH 7,5), Aufschwemmen Perlen durch pipettieren, setzen das Rohr auf die magnetische Halterung, 1 min warten und den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie den Schritt.</li>
		<li>Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ, fügen Sie 200 µL 1 x RNA Sammlungspuffer und Aufschwemmen Sie Streptavidin magnetische Beads von kurz aufschütteln. Entfernen Sie 50 µL Streptavidin magnetische Beads zu und fügen Sie jedes beschriftet-RNA-Rohr mit einem Schnitt PIPETTENSPITZE hinzu. Inkubieren Sie die Rohre für 30 min bei Raumtemperatur auf einer Walze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bindung von RNA-protein
	<ol>
<li>Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, warten Sie 1 min und entfernen Sie den überstand zu.</li>
		<li>Die Perlen 50 µL 20 mm Tris (pH 7,5) hinzu und erneut durch pipettieren. Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, warten Sie 1 min und entfernen Sie überstand zu. Wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
		<li>Die Perlen 100 µL 1 x Protein-RNA-bindende-Puffer hinzu und Aufschwemmen durch pipettieren.</li>
		<li>In der Zwischenzeit bereiten die folgende Mischung: 10 µL 10 x Protein-RNA-bindende-Puffer, 30 µL 50 % Glycerin, 50 µg von zytoplasmatischen Proteinen und Nuklease-freie Wasser bis zu 100 µL. Hinweis: Bereiten Sie master-Mix B für 3 Proben im Übermaß (3.3) wie folgt: 33 µL 10 x Protein-RNA-bindende-Puffer, 99 µL 50 % Glycerin, 165 µg von zytoplasmatischen Proteinen und Nuklease-freies Wasser bis zu 330 µL. halten Sie das Rohr des master-Mix B auf Eis.</li>
		<li>Legen Sie die Rohre in Magnetstativ, warten Sie 1 min und sammeln Sie den überstand zu. 100 µL der master-Mix B hinzufügen, Aufschwemmen von sanft auf und ab pipettieren und Luftblasen vermeiden. Inkubieren Sie Reaktionsgefäße für 60 min bei 4 ° C auf einer Walze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Waschen und elution
	<ol>
<li>Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, sammeln des Überstands (die Durchströmung - FT) und in einen neuen Schlauch übertragen. Hinweis: Bewahren Sie diese FT auf Eis für die spätere Analyse.</li>
		<li>Pipette 100 µL 1 x Waschpuffer auf die Perlen, Aufschwemmen sanft, setzen Sie wieder in die Magnetstativ, 1 min warten und den überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal.</li>
		<li>Magnetische Beads 40 µL Elution Buffer hinzu, mischen Sie, indem Sie pipettieren rauf und runter, und bei 37 ° C auf ein Rohr Shaker (950 u/min) für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Legen Sie die Rohre in einem Magnetstativ, warten Sie 1 min und sammeln Sie eluierten Probe (das Eluat - E). Auf Eis legen und für nachgelagerte Analyse verwenden. Hinweis: Bei diesem Schritt besteht jede getestete RNA-Sonde aus einem Durchflussverfahren (FT) und Eluat (E) Probe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Polyacrylamid-Elektrophorese und Western Blot Analyse
Hinweis: Siehe Tabelle 2 nach Rezepten für die in diesem Abschnitt verwendeten Puffer. Führen Sie einen Western Blot nach Laemmli Methode12.
<ol><li>Handcast 12 % SDS-PAGE Gelen (10-Brunnen, 1,5 mm Spacer, 66 µL). Bereiten Sie eine laufende Gel-Mischung: 4 mL 30 % Acrylamid-Bisacrylamide Stammlösung 2,4 mL niedriger Tris-Puffer, 3,2 mL dH2O, 9,6 µL TEMED, 96 µL 10 % Ammonium-bleichen-Lösung (APS). Bereiten Sie stapeln Gel Mischung: 3,25 mL dH2O, 0,5 mL 30 % Acrylamid - Stammlösung Bisacrylamide, 1,3 mL oberen Tris-Puffer, 10 µL TEMED, 20 µL 10 % APS.</li>
	<li>Hinzufügen von 16,6 µL 6 X Laemmli-Puffer (z.B. 14 mL Tris/HCl/SDS pH 6,8 (obere Tris-Puffer), 2 g SDS, 1,86 g von DVB-t, 6 mL Glycerin und 0,012 % Bromophenol blue; bei-20 ° C gelagert) in der FT-Probe und 6,6 µL 6 X Laemmli Puffer in E Probe. Inkubieren Sie Beispiele für 5 min bei 95 ° c</li>
	<li>Laden Sie die Proben (20 µL FT und ganze eluieren ~ 40 µL) und für 30 min bei 60 V, mit 20 V über Nacht weiter laufen.</li>
	<li>Mit einem semi-dry Elektroblotting-System übertragen Sie Proteine auf einer PVDF-Membran für 80 min bei 15 V. Anmerkung: Die PVDF-Membran muss aktiviert werden, bevor Sie Protein Transfer durchführen. Inkubieren Sie die Membran in 100 % Methanol für 1 min, gefolgt von einer 2 min Inkubation in Reinstwasser.</li>
	<li>Nach dem Transfer Protein inkubieren der SDS-PAGE-Gel mit Coomassie-Lösung für 3 h, gefolgt von drei Stufen der Reinigung mit Reinstwasser, jeweils 30 Minuten.</li>
	<li>Am Ende des Protein-Transfer lassen Sie die PVDF-Membran trocknen für 1 h. reaktivieren die Membran wie in Schritt 4.5 angegeben. Blockieren Sie die Membran 1 h mit 5 % BSA in 1 X TTBS.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit dem ersten Antikörper: HuR oder Mesothelin, beides verdünnt 1: 1000 in 5 % BSA in 1 X TTBS für 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran dreimal für 7 min in 1 X TTBS und inkubieren Sie mit Kaninchen-Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper verdünnt 1: 10.000 in 5 % BSA, 1 X TTBS.</li>
	<li>Proteine mit verstärkte Chemilumineszenz und digital Imager zu visualisieren.</li>
</ol>

<ol><li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

3' wo gehören die nicht-kodierenden Genom3, und alle nicht-kodierende RNAs können mit Proteinen interagieren, um ihre Funktion7ausüben. Wenn das Säugetier-Genom wurde festgestellt, dass durchdringend transkribiert werden und einen Großteil der lange Forensisches RNAs16 produziert, neue Beweise gezeigt, dass diese lange Forensisches RNAs in der Genexpression regulieren, wie sie interagieren funktionieren Chromatin-Umbau komplexe17</s...

Genexpression und die letzte Stufe des genprodukts können streng reguliert werden, durch Einwirkung auf die Stabilität der mRNA und mRNA Übersetzung Satz1. Diese Posttranskriptionale Regulationsmechanismen sind durch die Wechselwirkungen von nicht-kodierende RNA und/oder RNA-bindende Proteine (RBPs) mit gezielten mRNA ausgeübt. Es ist in der Regel 3' untranslatierten Region der mRNA (3' UTR - gehören zu den nicht-kodierenden Teil des Genoms2), die spezifische Cisenthält-regulatorischen Elementen (CRE), die von Transerkannt werden-wirkenden Faktoren wie MiRNA oder RBPs 3. der am besten untersuchten Cis-Element innerhalb der 3' UTR, ist die Adenin-HTML-Elements (sind)-Motiv, das durch spezifische AU-bindende Proteine (AUBP), und dies wiederum erkannt wird, induziert entweder mRNA Abbau/Deadenylation (sind vermittelte Zerfall) oder mRNA-Stabilisierung-4.
Die Größe der 3' UTR von Calretinin ist mRNA (CALB2) 573 bp lang und enthält eine vermeintliche AUUUA-pentamère wie von AREsite2, einem Bioinformatic Hilfsmittel5vorhergesagt. In Übereinstimmung mit der Anwesenheit eines vermeintlichen sind Motivs, Rolle unter Beweis gestellt PmirGLO Vektor-Reporter Assay eine Stabilisierung dieses Elements innerhalb CALB2 mRNA-6. Zu guter Letzt die in Vitro RNA-Pulldown wurde verwendet, um die AUBP zu identifizieren, die Calretinin stabilisiert mRNA durch das Motiv sind.
Da alle nicht-kodierende RNAs mit Proteinen7interagieren, ist der in-vitro- RNA-Pulldown ein guter Weg und erste Wahl-Test zur Identifizierung von RNA-Interaktoren zur Unterstützung bei der Entschlüsselung der molekularer Mechanismen. Bei diesem RNA-Pulldown-Verfahren wurden kommerziell synthetisierte RNA-Sonden, die mit einer veränderten Form von Biotin (Desthiobiotin) an das 3' Ende der RNA-Strang gekennzeichnet wurden, verwendet. RNA-Desthiobiotin wird durch die Interaktion mit Streptavidin auf magnetische Beads immobilisiert die pull-down-Proteine, die spezifisch mit der gebundenen RNA von Interesse interagieren dienen. Nicht denaturiert und aktive Proteine aus der cytosolische Fraktion von mesotheliomzellen dienen als Quelle von Proteinen. Diese RNA-gebundene Proteine sind von der magnetischen Beads, durchlaufen eine 12 % SDS-PAGE Gel auf eine Membran übertragen und sondiert mit verschiedenen Antikörpern eluiert.
In der standard Streptavidin-Biotin-Affinität Reinigungsprozedur, rauen Denaturierung, die Voraussetzungen erforderlich sind, um die starke irreversible Biotin-Streptavidin-Anleihe um die gebundenen Proteine8eluieren stören die zur Dissoziation von führen könnten Proteinkomplexe. Im Gegensatz zu Biotin Desthiobiotin reversibel bindet an Streptavidin und wird mit einer gepufferten Lösung von Biotin, zulassend die sanfte Elution von Proteinen und die Vermeidung von der Isolation natürlich biotinylierte Moleküle9kompetitiv verdrängt, was darauf hindeutet, dass die Technik ideal für systemeigene Proteinkomplexen unter heimischen Bedingungen zu isolieren.
In-vitro- verbindliche Auflagen und Stringenz, die Salzkonzentration, Reduktionsmittel und Waschmittel Prozentsatz ermittelt werden, sollte in der Nähe von den anwesenden im Zusammenhang mit zellulären, um wahre in Vivo Interaktionen zu identifizieren. Die verbindlichen Bedingungen hierin umgesetzt wurden zuvor als angemessen für die Identifizierung der HuR als eine AU-bindende Protein10nachgewiesen. Dieser Ansatz könnte Zeit zu sparen, da die Optimierung der richtige Bindung Bedingungen zeitaufwändig und anspruchsvoll sein kann. Darüber hinaus ist diese Methode könnte als Ausgangspunkt Protokoll für jedes Experiment RNA-Pulldown verwendet werden und kann durch Veränderung der Konzentration von Salzen und Reinigungsmittel, Ändern des Glycerin-Anteils und andere Salze schrittweise optimiert werden. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass sogar eine kurze 25-Nukleotid RNA-Sonde beherbergen ein pentamère sind-Motiv verwendet werden, um Interaktion mit einer spezifischen AUBP zu demonstrieren.

<table><tbody><tr><td>NE-PER Extraktionskit für Kerne und Zytoplasma</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Proteasehemmer Tabletten, EDTA-frei</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Magnetisches RNA-Protein-Pulldown-Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>Enthält magnetische Beads und daher muss das Kit bei 4 & Grad gelagert werden. C</td></tr><tr><td>Pierce RNA 3' End-Desthiobiotinylierungs-Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>Das Kit ist Teil des "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" und muss bei -20 & Grad gelagert werden. C im Gegensatz zum Pull-Down-Kit (4 > C).</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&nbsp; magnetisches Stativ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Anti - HuR (MOUSE) monoklonaler Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific-Der</td><td></td> <td>Antikörper ist im Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit enthalten&nbsp; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - Kaninchen Anti-Maus Sekundärantikörper 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - &alpha; - Tubulin (MOUSE) monoklonaler Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - Kaninchen Anti-Maus Sekundärantikörper 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - PARP (RABBIT) Polyklonaler Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>9542</td><td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - Kaninchen Anti-Kaninchen Sekundärantikörper 1:10.000 in 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoklonaler Antikörper&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>Sekundärer Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Sekundärer Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640</td><td>medium Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - filtrierter Rinderserum-Pan</td><td>Biotech&nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin - Streptomycin (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin-Lösung (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Zellen</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean System Glasplatten&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Spacer Platten mit 1,5 mm integriertem Spacer</td><td>Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1,5 mm, 66 & micro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Dekontaminationslösung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese Gel 30 - wässrige 30%ige Acrylamid und Bisacrylamid Stammlösung im Verhältnis 37,5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Transfermembran&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>müssen aktiviert werden, indem 1 Minute lang in reinem Methanol inkubiert und anschließend 2 Minuten lang in Wasser gewaschen wird.</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD halbtrockene Transferzelle&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrat</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&nbsp; Digital Imager</td><td></td> <td>Vilber-RNA-Oligosynthese</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Mycrosynth AG, Schweiz</td> <td>-</td> <td>die Syntheseskala - 0,04 &micro; mol - HPLC gereinigtes</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure 1 M Tris, pH 7,5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>50 % sterile Aliquote für die Lagerung bei -20°; C</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin magnetische Kügelchen&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>Bitte beachten Sie, dass diese magnetischen Kügelchen einen durchschnittlichen Durchmesser von 1 & Mikro haben; m (Bereich von 0,5 - 1,5 &Mikro; m). Darüber hinaus werden Dynabeads-M280 Streptavidin, bei denen es sich um Kügelchen mit einer homogenen Größe von 2,8 und Mikro handelt. m, werden auch beim RNA-Pulldown verwendet, aber beachten Sie, dass dies den Reinigungsprozess beeinträchtigen kann.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumsulfat-(14-18)-hydrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>ortho-Phosphorsäure&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin-streptavidin-affinität vermittelt reinigung von rna-wechselwirkenden proteinen in mesotheliomzellen

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Die in-vitro- RNA-Pulldown wird noch weitgehend verwendet in den ersten Schritten der Protokolle, die auf die Identifizierung von RNA-bindende Proteine, die spezifisch RNA-Strukturen und Motive zu erkennen. In diesem Protokoll RNA-Pulldown kommerziell synthetisierte RNA-Sonden sind beschriftet mit einer modifizierten Form von Biotin, Desthiobiotin, an das 3' Ende der RNA-Strang, die reversibel bindet an Streptavidin und ermöglicht somit Elution von Proteinen unter mehr physiologische Bedingungen. RNA-Desthiobiotin wird durch die Interaktion mit Streptavidin auf magnetische Beads immobilisiert die pull-down-Proteine, die spezifisch mit der RNA des Interesses interagieren dienen. Nicht denaturiert und aktive Proteine aus der cytosolische Fraktion von mesotheliomzellen dienen als Quelle von Proteinen. Die hier beschriebene Methode kann angewendet werden, um die Interaktion zwischen bekannten RNA-bindende Proteine und eine 25-Nukleotid (nt) lange RNA-Sonde mit einer Sequenz von Interesse zu erkennen. Dies ist nützlich, um die funktionelle Charakterisierung der stabilisieren oder destabilisieren Elementen in RNA-Moleküle mit einem Reporter-Vektor-Assay erreicht abzuschließen.

In diesem Experiment wurde ein 25-nt lange Fragment des Calretinin 3' UTR beherbergen sind Motiv (CALB2 3' UTR (sind) 25-nt) verwendet, zu testen, ob es speziell für das Human-Antigen R (HuR) Protein, einem bekannten mRNA-Stabilisator bindet. Um zu testen, die Spezifität des Elements sind, eine 25-nt-RNA wurde Sonde CALB2 3' UTR (MtARE), enthält eine sind-Motiv-Mutation, die bisher gezeigt wurde, um den Stabilisierungseffekt des Motivs sind abzuschaffen, gebrauchte6</sup...

Desthiobiotin Kennzeichnung von einer synthetischen 25-Nukleotid RNA Oligo, enthält ein Motiv Adenin-HTML-Elements (sind), kann spezifische Bindung der cytosolischen sind-bindendes Protein.

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zytosolisches Protein zu erfassen, das an eine spezifische Sequenz bindet, die sich im RNA-Molekül in Mesotheliomzellen befindet. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der RNA-Biologie zu beantworten, z. B. ob ein vorhergesagtes RNA-bindendes Protein Adenosin oder eine uridinreiche Sequenz in einem Transkript binden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die funktionelle Charakterisierung stabilisierender oder destabilisierender Elemente ergänzt, die durch Reporterassays beurteilt werden.Diese Technik wird von Dr. Jelena Kresoja-Rakic, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Um das Protokoll zu beginnen, erhalten Sie zuvor präparierte ACC-MESO-4-Zellen mit einer Konfluenz von 80 bis 90 %. Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit 15 Millilitern 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und aspirieren Sie das PBS.Fügen Sie dann drei Milliliter 0,25 %iges Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie den Kulturkolben drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie sieben Milliliter des supplementierten RPMI-1640-Mediums hinzu, sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhr

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Ein wesentliches Hindernis für biochemische Analysen von Ribosomen, die im Entstehen begriffenen Peptidyl-tRNAs hat das Vorhandensein von anderen Ribosomen in der gleichen Proben, Ribosomen nicht in der Übersetzung der spezifischen mRNA-Sequenz, die analysiert werden beteiligt. Wir entwickelten eine einfache Methode, um zu reinigen, ausschließlich, den Ribosomen, welche die entstehenden Peptidyl-tRNA von Interesse.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Dieses Video zeigt einen in vitro RNA-Pulldown-Assay zur Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die mit den Adenylat-Uridylat-Rich Element (ARE)-Sequenzen in mRNA interagieren. Die Ziel-RBPs aus einem Zelllysat werden mit einer RNA-Sonde gemischt, um RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die Komplexe werden mittels Affinitätsreinigung isoliert, wobei die Affinität der Desthiobiotin-Markierung der RNA-Sonde zu einem Streptavidin-markierten magnetischen Kügelchen genutzt wird.

RNA-Protein-Pull-Down-Assay zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen mittels Affinitätsextraktion

RNA-Protein-Wechselwirkungen sind das Herzstück vieler zellulärer Prozesse. Hier beschreiben wir eine in vivo Methode, um spezifische RNA zu isolieren und neue Proteine zu identifizieren, die mit ihr assoziiert sind. Dies könnte ein neues Licht darauf werfen, wie RNAs in der Zelle reguliert werden.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Eine modifizierte Dichte-Zentrifugations-Gradienten-basierte Methodik wurde verwendet, um Epithelzellen aus Rhipicephalus microplus- Darmgewebe zu isolieren. Oberflächengebundene Proteine ​​wurden biotinyliert und durch Streptavidin-Magnetperlen zur Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen gereinigt.

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epithel-Darmzellen

Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

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Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

RNA/Proteinkomplexe gereinigt mit Botin Streptavidin-Strategie sind Lösung unter denaturierenden Bedingungen in einer Form ungeeignet für die weitere Reinigung und Funktionsanalyse eluiert. Hier beschreiben wir eine Änderung dieser Strategie, die einen Foto-spaltbaren Linker in RNA und einem sanften UV-Elution Schritt nachgeben native und voll funktionsfähige RNA/Proteinkomplexe nutzt.

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

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Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

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Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

Erfahren Sie die Desthiobiotin-Streptavidin-Affinitätsmethode zur Reinigung RNA-bindender Proteine in Mesotheliomzellen. Diese Technik erfasst zytosolische Proteine, die an ARE-Motive binden, und ergänzt funktionelle Charakterisierungsassays.

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

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