Name: Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Toeprinting-Analyse zur Untersuchung von Translationsinitiationskomplexen auf Säugetier-mRNAs. Diese Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in kap-abhängige und IRES-vermittelte Translationsmechanismen.

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Diese Arbeit wurde durch eine Natur- und Engineering Research Council von Kanada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), der Kanada-Stiftung für Innovation-John R. Evans Leaders Fund (35017), am Campus Alberta innoviert Programm und das Ministerium für Alberta finanziert. Wirtschaftliche Entwicklung und Handel.

Hinweis: RNA ist sehr anfällig gegen Abbau durch Ribonuclease (RNases). Vorkehrungen Sie treffen, standard, die RNA intakt zu halten. Ändern Sie häufig Handschuhe. Verwenden Sie gefilterte Pipettenspitzen, Nuklease-freie Plastikware und Nuklease-freie Chemikalien in allen Schritten des Protokolls. Nuklease-freie Nutzung oder Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltes Wasser für alle Lösungen.
1. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Toeprinting Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5 % (w/V) Saccharose, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,5 mM Spermidine.<ol>
<li>Speichern Sie DVB-t und Spermidine in Einweg-Aliquote bei-20 ° C, wiederholte Frost-Tau-wechseln zu vermeiden. Hinweis: DVB-t und Spermidine sollte in den Puffer Toeprinting unmittelbar vor der Anwendung hinzugefügt werden. Eine Lösung ohne DVB-t und Spermidine kann bei-20 ° c gelagert werden</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Aliquote von 85 mM-5'-Guanylyl-Imidodiphosphate (GMP-PNP) und 91 mM Adenosintriphosphat (ATP). Speichern der Aliquote bei-20 ° C.</li>
	<li>450 mL 6 % Polyacrylamid - 7M Harnstoff Gel Mischung vorbereiten: 67,5 mL 40 % Acrylamide:bis-Acrylamid (19:1), 189 g Harnstoff, 112,5 mL 5 x TBE (Tris/Borat/Thylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)) und 120 mL Wasser. Lösen Sie den Harnstoff durch Erwärmung im Wasserbad 37 ° C oder auf einer Heizplatte unter Rühren auf. Filtern Sie die Lösung (zB., 0,2 μm Nitrozellulose Vakuumfilter). Hinweis: Die Lösung kann bei 4 ° C für mindestens einen Monat aufbewahrt werden. Achtung: Monomere Acrylamid ist ein Nervengift, das durch die Haut absorbiert werden kann. Achten sehr darauf, Kontakt mit der Haut zu vermeiden (zB., tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel und Augenschutz). Polyacrylamid sollte auch mit Sorgfalt, behandelt werden, wie Polymerisation nicht 100 % vollständig erfolgen kann.</li>
	<li>Formamid laden Farbstoff vorbereiten: 95 % Formamid, 18 mM EDTA, 0,025 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 0,025 % (w/V) Bromophenol Blue, Xylol Cyanol 0,025 % (w/V). Shop bei-20 ° C.</li>
	<li>1 Nmol Grundierung (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' Ende beschriftet mit IRDye 800) in 100 μl Wasser für eine arbeiten-Konzentration von 10 Pmol/μL auflösen. Bei-20 ° C in Einweg-Aliquote (ca. 10 µL), vor Licht geschützt aufbewahren.</li>
</ol>2. Vorbereitung der mRNA
<ol><li>DNA-Templates für die Synthese von mRNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus entsprechende Vorlagen zu verstärken (i.e., genomische DNA oder Plasmid DNA, je nach Bedarf). Verwenden Sie ein High-Fidelity-DNA-Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit den folgenden Reaktionsbedingungen (35 Zyklen): Schmelzen, 98 ° C, 10 s; Tempern, 53 ° C, 20 s; verlängern, 72 ° C, 30 s. Hinweis: Der forward Primer (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) beinhaltet die T7 promotorsequenz für RNA-Transkription ermöglichen; die rückwärts-Primer (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) umfasst 51 Thymin Rückstände um ein Poly-A-Rute für die transkribierten RNA zu bieten. Beachten Sie, dass RNA auch in Vitro von Plasmid DNA transkribiert werden kann.</li>
	<li>Einsatz eines entsprechenden Transkription-Kit zur in-vitro- Transkription IRES-haltigen RNA oder angeschnittene Ärmel RNA aus der DNA-Vorlage. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Die RNA-Probe in 20 μL Reaktion Standardvolumes vorbereiten. Behandeln Sie die neu synthetisierten RNA mit 2 Einheiten von RNase-freie DNase für 30 min bei 37 ° C.</li>
	<li>Verdünnen Sie die DNase-behandelten RNA auf 110 µL mit Nuklease-freies Wasser hinzufügen 110 µL Säure Phenol, Wirbel 5 s und Zentrifuge für 3 min bei 20.000 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie 100 µL der wässrigen Phase zu einem neuen 1,5 mL Microfuge Schlauch zu, fügen Sie 10 µL 3 M Natriumacetat und Vortex 2 s. hinzufügen, 3 Bände von 100 % Ethanol, Wirbel 5 s und überstürzen Sie sich die RNA bei-20 ° C über Nacht.</li>
	<li>Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C und der Überstand verwerfen. Waschen Sie die Tablette mit 500 µL eiskalte 70 % (V/V) Ethanol und wiederholen Sie die Zentrifugation. Aspirieren Sie so viel des Überstands wie möglich und trocknen Sie das Pellet für 5-10 min. vorsichtig nicht zu die Pellets zu verdrängen sein.</li>
	<li>Aufschwemmen der RNS in das entsprechende Volumen der Nuklease-freies Wasser um eine arbeiten-Konzentration von 0,5 μg/μL zu erzielen. Dies kann bei-80 ° C gelagert oder sofort verwendet werden.</li>
</ol>3. Toeprinting Reaktion
<ol><li>Mix 15 μl der Kaninchen Retikulozytenzahl Lysate (RRL, nicht Nuklease behandelt), 1 μl RNase-Inhibitor, 1 µL 91 mM ATP (1,82 mM final) und 1 μL von 85 mM GMP-PNP-(1,7 mM final) in einer 1,5 mL Microfuge Röhre (40 Einheiten). Bei 30 ° C für 5 min inkubieren. Hinweis: Die RRL regelmäñig für den einmaligen Gebrauch, sich wiederholende Einfrieren Auftauen zu vermeiden sollte. Eine kritische Kontrolle ist eine Reaktion fehlt RRL, um die natürlichen Pausen der reversen Transkription durch die sekundäre Struktur der RNA aufzuklären. Fügen Sie Toeprinting Puffer um RRL für dieses Steuerelement zu ersetzen.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 µg RNA (1 µL) und bei 30 ° C für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 22 µL Toeprinting-Puffer und bei 30 ° C für 3 min inkubieren.</li>
	<li>Hinzufügen von 0,5 µL (5 Pmol) mit der Bezeichnung von IRDye Grundierung und inkubieren Sie für 10 min auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL 25 mM dNTPs (Endkonzentration: 1 mM), 2 µL 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL des Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transkriptase (AMV-RT) und 3,5 µL Toeprinting-Puffer. Der letzte Band ist 50 μL.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Reaktion bei 30 ° C für 45 min.</li>
	<li>200 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen und sofort mit 250 µL 25:24:1 Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (pH-Wert ca. 8.0) zu extrahieren. Vortex 5 s und Zentrifuge bei 20.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Entfernen der wässrigen Phase zu einem neuen 1,5 mL Microfuge Schlauch, 3 Bände von 100 % Ethanol, Wirbel 5 s hinzufügen und über Nacht bei-20 ° C Niederschlag.</li>
	<li>Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C und der Überstand verwerfen. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 500 µL eiskaltes Ethanol 70 % (V/V). Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Aspirat soviel überstand als möglich und mit Luft trocknen das Pellet für 5-10 min. nicht zu verdrängen das Pellet vorsichtig sein.</li>
	<li>Das Pellet in 6 μL der Nuklease-freies Wasser auflösen und 3 μl Formamid laden Farbstoff hinzufügen.</li>
</ol>4. Sequenzierung Reaktionen
<ol><li>Verwenden Sie der DNA-Vorlage von 2.1 und die IRDye beschriftet Grundierung aus Schritt 3.4 für standard-Sequenzierung Reaktionen, mit Dideoxynucleotides (DdNTPs) als Kette Terminatoren. Verwenden Sie eine entsprechende DNA-Sequenzierung Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Mix 6 μL jeder Sequenzierung Reaktion mit 3 μl Formamid Farbstoff beladen.</li>
</ol>5. Vorbereitung der Sequenzierung Gel und Elektrophorese
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine Fluoreszenz-Gel-basierten-Imager und eine 21 cm x 23 cm x 0,2 mm Gel, sondern kann bei Bedarf für andere Sequenzer oder Gel-Größen angepasst werden.
<ol><li>Reinigen Sie 0,2 mm spacer sowie die kurzen (23 × 25 cm) und lange (30 × 25 cm) Glasplatten mit 100 % igem Ethanol gründlich. An der Luft trocknen.</li>
	<li>Mischung 30 mL 6 % Polyacrylamid - 7M Harnstoff Gel zu mischen, mit 200 μl 10 % (w/V) Ammonium Bleichen (APS) und 20 μL der Tetramethylethylenediamine (TEMED). Gießen Sie Gel, kümmert sich um die Vermeidung von Luftblasen, und fügen Sie den "Hai-Zahn" Gel Kamm. Lassen Sie das Gel für 1 h bei Raumtemperatur zu polymerisieren.</li>
	<li>Die Sequenzierung Apparat zusammenbauen und füllen Sie den Behälter mit 1 X TBE.</li>
	<li>Bereits für 15 min bei 1500 V laufen Sie, bis die optimale Temperatur von 55 ° C erreicht wird.</li>
	<li>Erhitzen Sie den Probenaufnahme/Farbstoff-Mix (aus Schritte 3,9 oder 4.2) auf 85 ° C für 5 min. Last 1 μL auf die Sequenzierung Gel.</li>
	<li>Führen Sie das Gel bei 1500 V für 8 h. Das Gerät liest die Bands in Echtzeit.</li>
	<li>Zerlegen Sie das Gerät zu, und entsorgen Sie die Acrylamid-Gel und laufenden Puffer.</li>
</ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15803138">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+just+scanning%3A+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li>
<li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li>
<li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li>
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<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Thakor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mRNA+recruits+the+ribosome+via+eIF3-PABP+bridge+to+initiate+internal+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation.</a> RNA Biol. , 1-15 (2016).</li>
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<li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li>
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<li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li>
<li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295(2014).</li>
<li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).</li>
<li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5%27-Terminal+AUG%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Konflikt-of-Interest, offen zu legen.

Toeprinting ist eine leistungsstarke Technik, die Möglichkeit einer RNA von Interesse, die Bildung von Übersetzung Einleitung komplexen unter sehr kontrollierten Bedingungen unterstützen direkt zu messen. Dieses Protokoll beschreibt eine vereinfachte Technik für Toeprinting Säugetieren RNAs. Kaninchen Retikulozytenzahl lysate (RRL) dient als bequeme Quelle von Ribosomen, WDVS, Initiator tRNA und IRES Trans-wirkenden Faktoren (ITAFs). Der Experimentator bietet ihre RNA der Wahl und kann auch die Toeprinting Reakt...

Wie die Übersetzung die zelluläre Energie verbraucht, ist es sinnvoll, dass Übersetzung streng regulierte1ist. Umgekehrt, Dysregulation der Übersetzung- und den daraus resultierenden Änderungen in Protein-Ausgabe-oft in Stress-Reaktion und Krankheit Staaten, z. B. Krebs1,2eingehalten wird. Ein großer Vorteil der translational Control ist die Geschwindigkeit, mit der Zellen ihre Protein-Produktion verändern können, um auf verschiedene Reize3reagieren. Übersetzung-Verordnung stellt somit einen wichtigen Mechanismus, der Zelle überleben und Tod1,2,3beeinflussen können. Von den Stufen des Übersetzung ist Initiation die meisten hoch regulierten und komplexen3. Kurz, enthalten die meisten eukaryontischen mRNAs eine 5' m7G Mütze, die fast immer für ihre Übersetzung unerlässlich. GAP-abhängige Initiation erfordert eukaryotic Initiation Faktoren eIF4E, eIF4A und eIF4G (GAP-Anerkennung Komplex), mit 5'-Ende der mRNA zu interagieren. 43 preinitiation Ribosomen Komplex, enthält eIF2 gebundene Initiator tRNA und eIF3, wird eingestellt, um die 5'-Ende der mRNA durch eine Wechselwirkung von eIF4G mit eIF3. Die komplexen Preinitiation wird gedacht, um mRNA, unterstützt von eIF4A Scannen (ein RNA-Helikase) bis der Start-Codon (AUG) befindet. Die 48er Einleitung komplexer entsteht anschließend und tRNA wird in der P-Seite von dem Ribosom geliefert. Schließlich sind die 60er und 40er Ribosomen-Untereinheiten vereint bilden die 80er Jahre Einleitung Komplex, gefolgt von Übersetzung Dehnung1,3,4. Im Gegensatz dazu umgehen interne Ribosom Eintrag Websites (IRESes) die Voraussetzung für eine 5' Kappe durch die Rekrutierung der 40er Jahre ribosomalen Untereinheit direkt an die Einleitung Codon3. Physiologischen Spannungszustände dämpfen globale mRNA Übersetzung aufgrund von Änderungen der wichtigsten allgemeinen eukaryotischen Einleitung Faktoren (WDVS). Jedoch nicht-kanonischen Übersetzung Einleitung Mechanismen erlauben selektive Übersetzung bestimmter mRNAs, die oft Stressantwort Proteine codieren und Dysregulation der nicht-kanonischen Übersetzung Initiation ist bei Krankheitszuständen wie Krebs verwickelt 1 , 2. diskret RNA regulatorische Elemente, wie z. B. zelluläre IRESes zu ermöglichen, für die Übersetzung von solchen mRNAs2,3.
Ein besonders interessanter Aspekt von translational Control ist es, Mechanismen der kanonischen versus nicht-kanonischen Übersetzung von einem bestimmten mRNA zu verstehen. Toeprinting ist eine Technik, die der mechanistischen Detailstudie über Übersetzung Einleitung der spezifischen RNAs in Vitroermöglicht. Das Ziel des Toeprinting ist die Fähigkeit einer RNA von Interesse, die Bildung von einer Übersetzung Initiation Komplex mit dem Ribosom unter verschiedensten Bedingungen, um festzustellen, welche Sequenzen, Strukturelemente oder Accessoire Keimbildung zu bewerten Faktoren sind für effiziente Übersetzung Einleitung erforderlich. Beispielsweise könnte Ribosom Rekrutierung in Ermangelung eines 5'-Cap behindert aber angeregt durch die Anwesenheit von einer IRES.
Das Prinzip der Technik ist, in-vitro- transkribieren eine RNA von Interesse, es in Anwesenheit von Zellextrakten mit Übersetzung (oder die gereinigten Komponenten) ermöglichen Einleitung komplexe zu bilden, und umgekehrt zu transkribieren inkubieren die RNA mit einem speziellen Primer. Stabile RNA-Ribosom komplexe verursacht reversen Transkription zum Strömungsabriss am 3' Rand der Ribosom-die so genannte 'Toeprint'5,6,7.
In diesem Protokoll der ribosomalen Untereinheiten, WDVS, tRNAs und IRES Trans-wirkenden Faktoren (ITAFs) werden bequem durch Kaninchen Retikulozytenzahl lysate (RRL) beigetragen. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Primer eindringmittel beschriftet und Fluoreszenz Gel-basierte Imager, anstatt einer radioaktiven Grundierung. Dadurch entfallen zusätzliche Schritte, einschließlich enzymatische die Grundierung sowie das Gel Trocknen und setzen Sie sie auf eine Intensivierung Bildschirm. Die fluoreszierende Bänder werden in Echtzeit, als die Gel läuft, ermöglicht größere Auflösung aufgezeichnet. Entdeckelte X-chromosomal-Inhibitor von Apoptosis Protein (XIAP) IRES RNA wird hier, als Beispiel verwendet, obwohl angeschnittene Ärmel mRNAs auch mit dieser Technik8analysiert werden kann.
Im Gegensatz zu westlichen Analyse, die die endgültige Ausgabe des Übersetzungsprozesses in Zelle Lysates misst, ist Toeprinting ein in-vitro- Ansatz zur Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf einer RNA zu messen. Diese reduktionistische Ansatz ermöglicht es, für die sehr detaillierte Untersuchung von Substraten oder Faktoren, die Übersetzung Einleitung zu regulieren (zB., angeschnittene Ärmel oder UN-angeschnittene Ärmel mRNA, IRES-Struktur, Vorhandensein oder Fehlen von Poly-A Tail, Bestimmung von spezifischen Proteins Faktoren, ( usw.). Daher kann Toeprinting verwendet werden, verschiedene Modi der Übersetzung8 oder die Auswirkungen der mRNA Strukturen, z. B. IRESes, am Protein Synthese9,10zu studieren.

<table><tbody><tr><td>DEPC (Diethylpyrocarbonat)</td><td>Sigma</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-Base, hochreines</td><td>JT Baker</td><td>4109-01</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (Kaliumacetat)</td><td>Bio Basic</td><td>PB0438</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2 (Magnesiumacetat-Tetrahydrat)</td><td>Bio Basic</td><td>MB0326</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose, molekularbiologische Qualität</td><td>Calbiochem</td><td>573113-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PNP (Guanosin 5&prime;-[&beta;,&gamma;-imido]triphosphat trinatriumsalz hydrat) 0,1 M Lösung</td><td>Sigma</td><td>G0635</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosin 5&prime;-triphosphat) Dinatriumsalz, 100 mM Lösung</td><td>Sigma</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>19:1 Acrylamid:bis-acrylamid, 40%</td><td>Bio Basic</td><td>A0006</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Bio Basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Flaschenverschluss-Filtrationseinheiten, 0,2 & Mikro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.101</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Dinatriumsalz, Dihydrat)</td><td>Bio Basic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>SB0485</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Bio Basic</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>Xylolcyanol FF</td><td>Bio Basic</td><td>XB0005</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transkriptionskit</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transkriptionskit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Säure Phenol:Chloroform (5:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen-Retikulozytenlysat (RRL). Sollte NICHT mit Nuklease behandelt werden.</td><td>Green Hectares, USA</td><td></td><td>Kontaktieren Sie Green Hectares, fragen Sie nach 1:1 RRL:Wasser</td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor (40 U/&micro; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>E00382</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>56172, 56173, 56174, 56175</td><td>Mischen Sie gleiche Teile für einen Vorrat von je 25 mM.</td></tr><tr><td>AMV-RT, 10 U/&micro; L</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Sequenase Version 2.0 DNA-Sequenzierungskit</td><td>Thermo</td><td>Fisher 707701KT</td><td></td></tr><tr><td>Modell 4200 IR2 DNA-Analysator</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Produkt wurde eingestellt</td></tr><tr><td>APS (Ammoniumpersulfat)</td><td>Bio Basic</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Basic</td><td>TB0508</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>Neu England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Turbo Dnase</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

toeprinting analyse der Übersetzung einleitung komplexbildung auf säugetier-mrnas

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Übersetzung Einleitung ist der Rate-limiting Schritt der Proteinsynthese und ist einen wesentlichen Punkt, bei dem Zellen ihre Protein-Produktion regulieren. Verordnung der Proteinsynthese ist der Schlüssel zur zellulären Stressantwort und Dysregulation ist zentral zu vielen Krankheitszuständen, wie z. B. Krebs. Obwohl zellulären Stress zu die Hemmung der globalen Übersetzung durch mildernde GAP-abhängige Initiation führt, sind bestimmte Stressantwort Proteine beispielsweise selektiv auf GAP-unabhängige Weise übersetzt. Diskrete RNA regulatorische Elemente, wie z. B. zelluläre interne Ribosom Eintrag Websites (IRESes), ermöglichen die Übersetzung dieser spezifischen mRNAs. Identifizierung von solchen mRNAs und die Charakterisierung ihrer regulatorischen Mechanismen wurden ein wichtiger Bereich in der molekularen Biologie. Toeprinting ist eine Methode für die Untersuchung von RNA-Struktur und Funktion betrifft Übersetzung Einleitung. Das Ziel des Toeprinting ist zur Beurteilung der Fähigkeit von in-vitro- transkribierte RNA bilden stabile komplexe mit Ribosomen unter verschiedensten Bedingungen, um festzustellen, welche Sequenzen, Strukturelemente oder Zubehör Faktoren im Ribosom beteiligt sind verbindlich – ein Vorläufer für effiziente Übersetzung Einleitung. Neben anderen Techniken, wie westliche Analyse und Polysome profiling ermöglicht Toeprinting eine robuste Charakterisierung der Mechanismen zur Regulierung der Übersetzung Einleitung.

Zuvor haben wir die Möglichkeit der XIAP IRES zur Unterstützung von GAP-unabhängige Übersetzung Einleitung in-vitro-8,10beschrieben. Toeprinting war der Key-Technik, die mechanistischen Details der komplexen XIAP IRES Einleitung zu befragen. Ein DNA-Konstrukt Codierung eine mRNA mit XIAP IRES (Abb. 1A) wurde in Vitro transkribiert und Toeprinting Analyse unterzogen. ...

Toeprinting zielt darauf ab, die Möglichkeit der in-vitro- Messung transkribierte RNA zu Form Übersetzung Einleitung komplexe mit Ribosomen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Toeprinting Säugetieren RNA und kann zur GAP-abhängige und IRES-driven Übersetzung zu studieren.

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Das übergeordnete Ziel dieser Toeprinting-Analyse ist es, die Bildung von Translationsinitiationskomplexen auf Säugetier-mRNAs zu beobachten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der mRNA-Translation zu beantworten, wie z.B. die IRES-vermittelte Translationsinitiierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine detaillierte Analyse der Komplexbildung der Translationsinitiierung auf einer bestimmten mRNA durchgeführt werden kann.Assemblieren Sie die Transkriptionsreaktionen, um RNA aus den PCR-amplifizierten DNA-Templates zu transkribieren, die für die XIAP IRES RNA oder ihre Mutanten kodieren. Fügen Sie als Nächstes zwei Einheiten RNase-freie DNase hinzu, um das DNA-Template zu jeder 20-Mikroliter-Reaktion der RNA zu entfernen. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Verdünnen Sie dann die DNase-behandelte RNA mit nukleasefreiem Wasser auf ein Endvolumen von 110 Mikrolitern. Fügen Sie als Nächstes 110 Mikroliter saures Phenol hinzu, um die RNA-Reinigung zu starten. Die Proben fünf Sekunden lang vorkalibrieren und bei 20.000 x g drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren.Es ist wichtig, die RNA oder CDNA vor der Phenolextraktio

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ein wesentliches Hindernis für biochemische Analysen von Ribosomen, die im Entstehen begriffenen Peptidyl-tRNAs hat das Vorhandensein von anderen Ribosomen in der gleichen Proben, Ribosomen nicht in der Übersetzung der spezifischen mRNA-Sequenz, die analysiert werden beteiligt. Wir entwickelten eine einfache Methode, um zu reinigen, ausschließlich, den Ribosomen, welche die entstehenden Peptidyl-tRNA von Interesse.

Isolierung von Ribosomen übersetzen enthaltend Peptidyl-tRNAs für funktionelle und strukturelle Analysen

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Dieses Protokoll stellt wesentliche Änderungen Polyribosom Fraktionierung, um die translatome von in vivo ZNS-Proben zu untersuchen. Es ermöglicht umfassende Beurteilung der Übersetzung und der Transkriptionsregulation durch die Isolierung und der Vergleich der Gesamt-RNA gebunden Ribosomen-RNA-Fraktionen.

In-vivo-Abfrage des Zentralen Nervensystems durch Translatome Polyribosom Fraktionierung

Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Hier beschreiben wir die Montage von RNA-Polymerase II (Pol II) Dehnungskomplexen, die nur kurze synthetische DNA- und RNA-Oligonukleotide und gereinigte Pol II erfordern. Diese Komplexe sind nützlich für die Untersuchung von Mechanismen, die der kotranskriptiellen Verarbeitung von Transkripten im Zusammenhang mit dem Pol-II-Dehnungskomplex zugrunde liegen.

Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Das Nachverfolgen einzelner Übersetzungsereignisse ermöglicht hochauflösende kinetische Studien von kappenabhängigen Translationsmechanismen. Hier zeigen wir einen in vitro Einzelmolekül-Assay basierend auf bildgebenden Wechselwirkungen zwischen fluoreszierend markierten Antikörpern und epitopmarkierten aufkommenden Peptiden. Diese Methode ermöglicht die Einzelmolekülcharakterisierung der Initiations- und Peptiddehnungskinetik während der aktiven in vitro capabhängigen Translation.

Ein In Vitro Single-Molecule Imaging Assay zur Analyse von cap-dependent Translation Kinetics

Dieses Protokoll beschreibt einen Reporter-Assay zur Untersuchung der Regulation der mRNA-Translation in einzelnen Eizellen während der In-vitro-Reifung.

Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Hier beschreiben wir Protokolle Säugerzellen durch Solid-State-Fräsen bei einer kryogenen Temperatur zu stören, um einen Zellextrakt aus der resultierenden Zelle Pulver produzieren, und Proteinkomplexe von Interesse durch Affinitätseinfangen auf Antikörper-gekoppelten Mikrometer-Maßstab paramagnetischen Perlen zu isolieren.

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Erfahren Sie die Toeprinting-Analyse zur Untersuchung von Translationsinitiationskomplexen auf Säugetier-mRNAs. Diese Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in kap-abhängige und IRES-vermittelte Translationsmechanismen.

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

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