Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Das übergeordnete Ziel dieser Toeprinting-Analyse ist es, die Bildung von Translationsinitiationskomplexen auf Säugetier-mRNAs zu beobachten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der mRNA-Translation zu beantworten, wie z.B. die IRES-vermittelte Translationsinitiierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine detaillierte Analyse der Komplexbildung der Translationsinitiierung auf einer bestimmten mRNA durchgeführt werden kann.

Assemblieren Sie die Transkriptionsreaktionen, um RNA aus den PCR-amplifizierten DNA-Templates zu transkribieren, die für die XIAP IRES RNA oder ihre Mutanten kodieren. Fügen Sie als Nächstes zwei Einheiten RNase-freie DNase hinzu, um das DNA-Template zu jeder 20-Mikroliter-Reaktion der RNA zu entfernen. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Verdünnen Sie dann die DNase-behandelte RNA mit nukleasefreiem Wasser auf ein Endvolumen von 110 Mikrolitern. Fügen Sie als Nächstes 110 Mikroliter saures Phenol hinzu, um die RNA-Reinigung zu starten. Die Proben fünf Sekunden lang vorkalibrieren und bei 20.000 x g drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Es ist wichtig, die RNA oder CDNA vor der Phenolextraktion zu verdünnen. Wenn das Volumen zu gering ist, wird es schwierig sein, die wässrige Phase physisch zurückzugewinnen, und die endgültige Ausbeute ist gering. Übertragen Sie dann vorsichtig 100 Mikroliter der RNA-haltigen wässrigen Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.

Fügen Sie 10 Mikroliter 3 M Natriumacetat mit einem pH-Wert von 5,5 hinzu und mischen Sie die Proben. Fügen Sie dann drei Volumina 100%iges Ethanol hinzu, um die RNA auszufällen, und wirbeln Sie die Proben fünf Sekunden lang vortexen. Über Nacht bei 20 Grad Celsius inkubieren.

Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen den Überstand. Waschen Sie dann das Pellet mit 500 Mikrolitern eiskaltem 70%igem Ethanol und wiederholen Sie die Zentrifugation. Saugen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich an, ohne das Pellet zu verdrängen.

Trocknen Sie das Pellet dann fünf bis 10 Minuten lang an der Luft. Resuspendieren Sie das Pellet in nukleasefreiem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter. Um den Toeprinting-Assay zu beginnen, geben Sie 15 Mikroliter nicht mit Nukleasen behandeltes Kaninchen-Retikulozyten-Lysat in jedes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das die Wildtyp-XIAP IRES RNA und ihre Mutanten darstellt.

Geben Sie RNase-Hemmer, ATP und GMP-PNP in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Danach gibst du jeweils einen Mikroliter der jeweiligen RNA in die Röhrchen und inkubierst weitere fünf Minuten bei 30 Grad Celsius.

Während der Inkubationszeit geben Sie DTT und Spermidin zum Zehenabdruckpuffer. Geben Sie dann 22 Mikroliter Zehenabdruckpuffer in jedes der Röhrchen und inkubieren Sie drei Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Fügen Sie anschließend 0,5 Mikroliter IR-Farbstoff hinzu, der mit Zehenabdruck markiert ist, und inkubieren Sie die Reaktion 10 Minuten lang auf Eis.

Sie anschließend zwei Mikroliter dNTPs, zwei Mikroliter Magnesiumacetat und einen Mikroliter reverse Transkriptase des Vogelmyeoloblastosevirus hinzu. Bringen Sie das endgültige Volumen mit Toeprinting-Puffer auf 50 Mikroliter. Lassen Sie dann die Primerverlängerung 45 Minuten lang bei 30 Grad Celsius erfolgen.

Es ist auch wichtig, der Zehenabdruckreaktion Magnesiumacetat hinzuzufügen, ohne das die reverse Transkriptase nicht optimal funktioniert. Fügen Sie danach 200 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu. Fügen Sie 250 Mikroliter 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol, pH 8,0, hinzu, um die Reinigung der cDNA zu beginnen.

Nachdem die Proben fünf Sekunden lang vortexiert wurden, zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g bei Raumtemperatur für drei Minuten. Übertragen Sie anschließend die wässrige Phase, die die DNA enthält, vorsichtig in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann drei Volumen 100%iges Ethanol hinzu, um die DNA auszufällen und fünf Sekunden lang zu wirbeln.

Nacht bei 20 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 x g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen den Überstand. Waschen Sie dann das DNA-Pellet mit 500 Mikrolitern eiskaltem 70%igem Ethanol und zentrifugieren Sie es bei 20.000 x g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Saugen Sie so viel Überstand wie möglich ab und achten Sie darauf, dass sich das Pellet nicht löst. Trocknen Sie das Pellet dann fünf bis 10 Minuten lang an der Luft. Lösen Sie das DNA-Pellet in sechs Mikrolitern nukleasefreiem Wasser auf.

Fügen Sie dann drei Mikroliter Formamid-Ladefarbstoff hinzu. Verwenden Sie ein Sequenzierungskit, um eine Dideoxynukleotid-Sequenzierungsleiter mit dem Toeprinting-Primer und dem DNA-Konstrukt vorzubereiten, das für die XIAP IRES RNA kodiert. Mischen Sie dann sechs Mikroliter jeder Sequenzierungsreaktion mit drei Mikrolitern des Formamid-Ladefarbstoffs.

Nachdem Sie die Platten gereinigt und zusammengebaut haben, gießen Sie das Gel ein und setzen Sie den Kamm ein. Nach der Polymerisation des Gels wird die Sequenzierapparatur zusammengebaut und die Reservoire mit 1x FSME befüllt. Dann 15 Minuten lang bei 1500 Volt vorlaufen, bis eine Temperatur von 55 Grad Celsius erreicht ist.

Erhitzen Sie alle Proben mit Formamid-Farbstoff fünf Minuten lang auf 85 Grad Celsius. Laden Sie dann einen Mikroliter jeder Probe auf ein 6%iges Polyacrylamid-Sequenziergel und lassen Sie das Gel acht Stunden lang bei 1500 Volt laufen. Zum Schluss lesen Sie die Banden in Echtzeit mit einem fluoreszierenden Imager.

Diese Methode zeigt, dass die Bestätigung der RNA für die Bildung von Translationsinitiierungskomplexen entscheidend ist. Die reverse Transkription des xiap-mRNA-Ribosomenkomplexes ergibt typische Zehenabdrücke von 17 bis 19 Nukleotiden stromabwärts von AUG. Die 5'PPT-Mutante zeigt eine gestörte Zehenabdruckbildung.

Bei der Transkription mit der 5'-Kappe kommt es jedoch zur Bildung eines Initiationskomplexes. In ähnlicher Weise zeigt auch die 3'PPT-Mutante eine gestörte Zehenabdruckbildung. Die Transkription mit der 5'-Kappe führt jedoch zur Bildung eines Initiationskomplexes.

Die Doppel-PPT-Mutante, die sowohl die 5'PPT- als auch die 3'PPT-Mutation beherbergt, ist in der Lage, den Initiationskomplex ohne die 5'-Kappe zu bilden. Die Zehenabdruckbildung ist für die Startcodon-Mutante in Abwesenheit von RRL und GMP-PNP und einem Poly-A-Schwanz stark beeinträchtigt. Die CDNA-Produkte werden mit einer Dideoxy-Nukleotid-Sequenzierungsleiter verglichen.

Humanes Beta-Globin oder HBB-mRNA zeigt ohne die 5'-Kappe keinen Zehenabdruck. Der Initiationskomplex wird jedoch auf der gedeckelten 5'UTR von HBB gebildet, was Zehenabdrücke von 16 bis 18 Nukleotiden stromabwärts von AUG ergibt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in drei Tagen durchgeführt werden, einschließlich der Vorbereitung von In-vitro-Transkriptionsvorlagen und RNA, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie das Structural Probing durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Sekundärstruktur des Wildtyps oder mutierte Varianten des IRES zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der mRNA-Translation geebnet, um die IRES-vermittelte Translation in vitro zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Toeprinting von Säugetier-mRNA durchführt und die Bildung von Translationsinitiationskomplexen analysiert.

Vergessen Sie nicht, dass Säure-Phenol, Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol und Acrylamid extrem gefährlich sein können. Bei der Verwendung dieser Reagenzien sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden.