Name: Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Lernen Sie die virale Lieferung von CRISPR/Cas9 in die murine Prostata für Gentherapie. Diese Methode ermöglicht präzise Genexpression und bietet ein neues Mausmodell für Prostatakrebsforschung.

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Herr wurde durch ein Stipendium von der dänischen Krebsgesellschaft (R146-A9394-16-S2) finanziert. MFB und MKT wurden durch AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8) finanziert. Herr und MFB wurden von Graduate School, Gesundheit, AU mitfinanziert. Das E.F.W. Labor wird unterstützt durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wirtschaft (SAF2015-70857, mitfinanziert von der EFRE-EU) und eine ERC advanced Grant (741888 - CSI-Fun).
Wir wollen danken Liliana Fajardo Mellor (Gene, Entwicklung und Krankheit; National Cancer Research Center) für kritische Lektüre des Manuskripts.

Dieses Protokoll beinhaltet einen chirurgischen Eingriff bei Labormäusen. Alle Tierversuche müssen einzeln überprüft und genehmigt durch eine institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC). Gewährleisten Sie der Ansatz basiert auf tierische Erholung und überleben, geeignete Anästhesie, Schmerztherapie und eine aseptische op-Umgebung jederzeit. Verwenden Sie ein Heizkissen, um Unterkühlung während der Operation und bis zur Genesung aus der Narkose zu verhindern.
1. ausgehend von Überlegungen
<ol><li>Abhängig von dem Virus verwendet gelten andere Titer Anforderungen; Das Virus entsprechend zu verdünnen. Hinweis: In diesem Beispiel wird eine Adeno-assoziierten Virus in PBS verdünnt auf einen Titer von 1 x 1012 IU/mL injiziert. Das Virus hat Serotyp 9 und enthält Anleitung RNA Pten und Expression von Cre-Protein unter eine Ubiquitin-Promotor (Abbildung 1). Verlust von Pten pAKT und Verbreitung der prostatischen Epithel13erhöht.</li>
	<li>Verwenden Sie männliche Mäuse im Alter von 8 Wochen zum Zeitpunkt der Operation, um angemessene Prostata Entwicklung sicherzustellen. Hinweis: In diesem Experiment gezeigt-Mäuse sind Rosa26-LSL-Cas9-EGFP Profi Mäuse C57BL/6J Hintergrund12 (Abbildung 1).</li>
	<li>Einen Vollnarkose-Mix frisch zubereiten und möglichst steril halten. Hinweis: Für bessere Tier Erholung nach der Operation, ist Gegengift Narkose empfohlen.<ol>
<li>Um ein Gesamtvolumen von 5 mL Narkose vorzubereiten, mischen Sie 0,15 mL Medetomidine Hydrochlorid (1 mg/mL), 0,4 mL Midazolam (5 mg/mL) und 0,25 mL Butorphanol (10 mg/mL) mit 4,2 mL steriles salzhaltigem Wasser. Hinweis: Alternative Anästhesie Methoden, z. B. Inhalierbare Isofluran können nach den institutionellen Tierpflege-Richtlinien verwendet werden.</li>
		<li>Um die Wirkung der Medetomidine Hydrochlorid postoperative stornieren, mischen Sie 0,1 mL Atipamezol (5 mg/mL) mit 4,9 mL steriles Kochsalzlösung Wasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine aseptische op-Umgebung durch ordnungsgemäße Desinfektion und Sterilisation. Autoklaven chirurgische Instrumente vor Gebrauch.</li>
</ol>(2) Virus-Lieferung an der murinen Prostata
<ol><li>Betäuben Sie das Tier durch intraperitoneale Injektion mit einer sterilen 1 mL Spritze und Nadel 27 x ½". Verwenden Sie eine Narkose-Dosis von 0,01 mL/g Körpergewicht. Dauert das Verfahren länger als 30 min, pflegen Betäubung durch Einspritzen von 1/3 der ersten Dosis alle 30 Minuten.</li>
	<li>Prüfen Sie die Narkose Tiefe durch die Bewertung, Muskelentspannung, Pedal Rückzug und palpebrale Reflexe. Wenn Verlust der Reflexe beobachtet wird, rasieren des unteren Bauches des Tieres.</li>
	<li>Decken Sie das Tier Augen sorgfältig mit tierärztliche Augenheilkunde Salbe mit einem sterilen Wattestäbchen gegen Blindheit aufgrund mangelnder Hornhaut Reflex ab.</li>
	<li>Wischen Sie den rasierten Bauch mit 70 % Ethanol und 10 % Povidon-Jod zu desinfizieren den OP-Bereich. Schrubben Sie den OP-Bereich von der Mitte des OP-Bereich in Richtung der Peripherie.</li>
	<li>Führen Sie einen vertikalen Hautschnitt an der niedrigen Bauch Mittellinie von ca. 1 cm mit einer sterilen chirurgischen Schere.</li>
	<li>Heben Sie das Bauchfell mit einer feinen Spitze Pinzette, damit die Organe, die unter Verlegung sind nicht beschädigt. Machen Sie vorsichtig einen < 8 mm Einschnitt mit einer chirurgischen Schere durch das Peritoneum. Hinweis: Im Gegensatz zu Menschen, ein Nagetier Prostata umfasst vier separate Lappen. Der vordere Lappen ist der Samenblase beigefügt.</li>
	<li>Sanft bewegen das Fettgewebe beiseite, fruchtbaren Vesicle aufzudecken. Heben Sie vorsichtig mit einer Pinzette Ring der Samenblase bis die vordere Prostata kann identifiziert (Abbildung 1).</li>
	<li>Injizieren Sie ein Gesamtvolumen von 30 µL Virus (3 x 1010 Viruspartikel) Lösung in der vorderen Prostata Epithel mit einer 0,5 mL Insulin Spritze mit einer Nadel 30 x 8 mm. Minimieren Sie Leckage zu und sicherzustellen Sie, dass die Flüssigkeit im Gewebe, bilden eine kleine Blase absorbiert wird. Legen Sie die Samenblase zurück in die Bauchhöhle.</li>
	<li>Das Bauchfell mit 2-3 einfache unterbrochenen Nähten mit 6-0 resorbierbaren Fäden mit einer 13 mm, 3/8 Kreis und einer konischen Punkt Nadel Naht.</li>
	<li>Heften Sie die Haut mit 3 sterile 4,8 x 6,5 mm-Clips Anheben der Haut mit einer Pinzette zu beschädigen das Bauchfell.</li>
	<li>Bessere Erholung beantragen Sie die Anästhesie Gegenmittel in einer Dosis von 0,01 mL/g Körpergewicht durch intraperitoneale Injektion mit einer sterilen 1 mL Spritze und Nadel 27 x ½". Legen Sie vorsichtig die Tiere zurück in seinen Käfig.</li>
</ol>3. postoperative Verfahren
<ol><li>Halten Sie den Käfig mit Mäusen, die operiert auf ein Heizkissen für 1 h nach dem Eingriff, um Unterkühlung bis vollständig erholt zu verhindern. Wenn das Gegenmittel angewendet wird, sollte das Tier werden wach wenige Minuten nach der Injektion.</li>
	<li>Beobachten Sie die Tiere täglich für entsprechende Wunde heilen und Schmerzen Indikationen. Bei Bedarf verwalten Sie zusätzliche Schmerzmittel nach institutionellen Tierbetreuung Richtlinien.</li>
	<li>Entfernen Sie Haut Clips nach 4-5 Tagen, sobald die Wunde geschlossen ist.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19937345">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li>
<li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+JUNB%2FAP-1+promotes+invasive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy%2C+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li>
<li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li>
<li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+prostate%3A+an+historical+survey+of+divergent+views%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode um die Genexpression in der vorderen Lappen der murinen Prostata durch Virus Injektion zu ändern, erstellen ein leistungsfähiges neues Mausmodell für Prostatakrebs (Abbildung 2). Die erfolgreiche Verwaltung eines Adenovirus wurde erstmals von Leow Et Al. 20058beschrieben. Wir haben bereits gezeigt, wie ein Adenovirus-Codierung für eine Cre-Rekombinase-Protein zeitraubende Kreuzung eine Cre-Allel für gewebespezi...

Erkennung und Behandlung von Prostatakrebs haben in den letzten zehn Jahren deutlich verbessert. Dennoch steigt die Inzidenz von Prostatakrebs nach Lebenserwartung. Mit schätzungsweise 1,1 Millionen neue Fälle weltweit gehört er zu den häufigsten Ursachen für krebsbedingte Todesursache bei Männern 1. Prostatakrebs ist in seiner Entwicklung langsam, aber wenn der Krebs in einem fortgeschrittenen metastasierten Stadium fortgeschritten ist, die Prognose ist schlecht aufgrund der begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Bisher nur wenige Gene wurden als gemeinsame Treiber in diesem Krebs identifiziert und ihre Heterogenität und Multifocality behindert Nachweis von Biomarkern und Aktionsleisten Krankheit Treiber2,3.
Klassische Techniken der Erzeugung von GEMMs werden durch ihre Komplexität, rechtzeitige Aufwendungen und Kosten oft beeinträchtigt. Bedingte ko-Modelle wurden weithin zur Prostatakrebs Kandidatengene, studieren, die embryonale Tödlichkeit, wenn in der Keimbahn4inaktiviert führen. Alle gängigen Modelle beinhalten eine Prostata-spezifisches-Cre-Rekombinase angetrieben entweder durch eine modifizierte Probasin5 oder integriert in die GEMM durch zusätzliche Kreuzungszüchtung PSA6 Förderer. In diesen Modellen wird das Gen des Interesses gezielt in der Mehrzahl der epithelialen Zellen der Prostata, Erzeugung von Hyperplasie in das ganze Organ, das das Tier Harnwege Funktion7beeinträchtigen kann.
Virale Lieferung des Cre-Proteins durch Injektion in den vorderen Lappen der murinen Prostata kann dieses Problem beheben, indem Sie nur auf ein paar Zellen8. Unter Berücksichtigung Labors technische Voraussetzungen, Know-how und Ziele der Methode profitiert eine Vielzahl von Variationsmöglichkeiten. Erfolgreiche Ansätze nutzen Adenovirus Ausrichtung auf JunB und Pten9 oder Lentivirus targeting Pten und Trp5310 wurden unter anderem gezeigt. Transgene wie Luciferase, das virale Konstrukt oder die GEMM hinzugefügt ermöglicht außerdem nicht-invasive Überwachung des Fortschreitens der Krankheit über Biolumineszenz imaging11.
Genom-Bearbeitung auf der CRISPR/Cas9-Technologie basiert, zeigt eine neue und schnelle Möglichkeit, Krebs durch schnelle Generierung von somatischen Knockouts12zu studieren. Virale Lieferung von einzelnen Guide RNAs (SgRNAs) an der vorderen Lappen der murinen Prostata gerichtet schafft ein physiologisch relevanter Modell von Prostata-Krebs. Auf diese Weise können Einzelzellen mit ausgewählten Mutationen Klone bilden, die in der Lage sind der Ausbau und die Invasion. Darüber hinaus generiert Verwendung des Guide RNAs für mehrere Zielgene zellklonen mit Veränderungen in verschiedenen Genen. Tumor Heterogenität und einer natürlichen Selektionsdruck wird auf Tumorprogression, dadurch die Bedeutung der einzelnen Gen Veränderung oder epistatic Mechanismen aufdecken können.
Hier präsentieren wir eine Methode um Viruspartikel an der murinen Prostata für Änderung der Genexpression zu liefern. Durch einen kleinen Bauchschnitt der murine anteriore Prostate Lappen ist ausgesetzt und virale Partikel in der Lappen eingespritzt werden. Fünf Tage nach der Operation, chirurgische Clips aus der Haut entfernt werden können und der Prostata Krebs ab 8 Wochen nach analysiert werden kann. Insgesamt ist dies eine schnelle und kostengünstige Verfahren, das hat wenig Einfluss auf die Maus und ermöglicht größere Tumor zu entwickeln, ohne Kompromisse bei der Maus.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml U-100 Insulinspritze</td><td>BD</td><td>324825</td><td>zur Virusinjektion</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>BD</td><td>300013</td><td>zur Anästhesieinjektion</td></tr><tr><td>30 G 1/2" ' Nadel</td><td>BD</td><td>304000</td><td>für die Anästhesieinjektion</td></tr><tr><td>6-0 Polysorb Naht</td><td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>zum Verschließen des Bauchfells</td></tr><tr><td>Sterilisiertes Einweg-OP-Tuch mehrere</td><td>Lieferanten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>mehrere Lieferanten</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod Prep Pad</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>Trimmen Maschine</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>zum Rasieren des Bauches</td></tr><tr><td>Dumont Pinzette</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey Micro Nadelhalter</td><td>F.S.T</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Irisschere</td><td>F.S.T</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Schmalmusterzange</td><td>F.S.T</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Ringzange</td><td>F.S.T</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Wound Clip System Griff inkl. Clips</td><td>F.S.T</td><td>12030-01</td><td>zum Verschließen der Haut</td></tr><tr><td>Wound Clip System Remover</td><td>F.S.T</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td> verschiedene <td>Modelle wurden verwendet</td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>gewonnen aus der tierischen Einrichtung</td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td></td><td></td><td>gewonnen aus der tierischen Einrichtung</td></tr><tr><td>Medetomidinhydrochlorid</td><td></td><td></td><td>gewonnen aus der tierischen Einrichtung</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td></td><td></td><td>gewonnen aus der tierischen</td></tr><tr><td>Einrichtung 100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>Virus (AAV, AV)</td><td>mehrere Lieferanten</td><td></td> Virus, das <td>in diesem Protokoll verwendet wird, ist ein in eigener Produktion</td></tr><tr><td>hergestellter pAKT-Antikörper</td><td>CST</td><td>4060</td><td>verwendet 1:200 Dillution</td></tr><tr><td>GFP Anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>verwendet 1:100 Dillution</td></tr></tbody></table>

virus-lieferung von crispr führt zu der murinen prostata für gen-Änderung

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Mit einer steigenden Inzidenz von Prostatakrebs ist die Identifizierung der Tumor Fahranfänger oder Modulatoren entscheidend. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMM) für Prostatakrebs sind durch Tumor Heterogenität und seine komplexe Mikroevolution Dynamik erschwert. Traditionelle Prostatakrebs-Maus-Modellen gehören unter anderem Keimbahn und bedingte Knockouts, transgene Ausdruck der Onkogene und Xenograft-Modelle. Generation von de Novo Mutationen in diesen Modellen ist komplex, zeitaufwändig und kostspielig. Darüber hinaus zielen die meisten traditionellen Modelle den Großteil der Prostata Epithel, während menschlichen Prostata-Krebs ist bekannt als ein isoliertes Ereignis in nur eine kleine Teilmenge von Zellen zu entwickeln. Wertvolle Modelle müssen jedoch nicht nur Prostatakrebs Einleitung auch Progression zu fortgeschrittener Erkrankung zu simulieren.
Hier beschreiben wir eine Methode, um ein paar Zellen in der Prostata Epithel durch 3D-Steuerung Zellen nach Viruspartikel zu adressieren. Die Lieferung eines veränderter Virus an der murinen Prostata ermöglicht Änderung der Genexpression in der Prostata Epithelien. Virus-Typ und die Menge werden hiermit die Anzahl der Zellen zielgerichtet für gen-Änderung definieren, indem transducing ein paar für Krebs Einleitung und viele Zellen für die Gentherapie. Durch Chirurgie-basierte Injektion in die vorderen Lappen, distale aus dem Harn Track kann der Tumor in diesem Modell erweitern, ohne Beeinträchtigung der harnfunktion des Tieres. Darüber hinaus durch die Ausrichtung auf nur eine Teilmenge der epithelialen Zellen der Prostata die Technik ermöglicht klonalen Expansion des Tumors und daher imitiert menschliche Tumorentstehung sowie Verlauf und Invasion durch die Basalmembran.
Diese neuartige Technik bietet eine leistungsstarke Prostatakrebs Modell verbesserte physiologische Relevanz. Leiden der Tiere ist begrenzt, und da keine zusätzliche Zucht erforderlich ist, insgesamt tierischen Graf wird reduziert. Zur gleichen Zeit wird Analyse neue Kandidatengene und Wege beschleunigt, die wiederum ist kostengünstiger.

Virus-Lieferung an der murinen Prostata zu bewerten, wurden Proben analysiert, drei Monate nach der Operation. Die Rosa26-LSL-Cas9-EGFP-Mäusen12 express GFP in Zellen, die Cre Protein ausgedrückt durch das Virus ausgesetzt gewesen. Die Prostata Proben untersucht mit einem Fluoreszenz-Mikroskopie, Bereiche mit GFP Signal (Abb. 2A) zu identifizieren. Die GFP-Signal zeigt Kre-Aktivität in der Prostata Epithel aber nicht ob gen Bearbeitung...

Dieses Protokoll beschreibt eine neu gegründete Methode für Virus-Lieferung an der murinen Prostata. Mit CRISPR/Cas9 Technologie, Überexpression des Gens oder Cre-Rekombinase-Lieferung, die Technik erlaubt orthotopen Veränderung der Genexpression und implementiert eine neue Maus-Modell für Prostatakrebs.

Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Das übergeordnete Ziel dieses chirurgischen Eingriffs ist es, die Genexpression in der murinen Prostata durch virale Verabreichung von CRISPR-Cas9-Guides zur Induktion von Prostatakrebs zu verändern. Diese Methode kann dazu beitragen, neue Fragen in der Prostatakrebsbiologie in Bezug auf die Analyse und Validierung neuer Gene in einem in vivo-Setting zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle Geneditierung mehrerer Gene ermöglicht, indem nur eine Teilmenge der Prostatazellen angesprochen wird, wie es im menschlichen Szenario zu sehen ist.Jemand, der neu in dem Verfahren ist, kann anfangs Schwierigkeiten haben, wegen der Organgröße und der Präzision, die für einen erfolgreichen chirurgischen Abschluss erforderlich ist. Um ein Gesamtvolumen von 5 Millilitern Anästhetikum frisch zuzubereiten, mischen Sie 0,15 Milliliter eines mg pro Milliliter Medetomidinhydrochlorid, 0,4 Milliliter von 5 mg pro Milliliter Midazolam und 0,25 Milliliter von 10 mg pro Milliliter Butorphenol. Fügen Sie dann 4,2 Milliliter steriles Salzwasser hinzu.Um die Wirkung von Medetomidinhydrochlorid nach der Operation umzukehren, mischen Sie 0,1 Milliliter 5 mg pro Milliliter Atipamezol mit 4,9 Millilitern sterilem Kochsalzwasser als Anästhesie-Gegenmittel. Bereiten Sie eine aseptische chirurgische Umgebung durch ordnungsgemäße Desinfektion und Sterilisation vor und autoklavieren Sie die chirurgischen Instrumente. Um das Virus in die Prostata zu bringen, nachdem eine acht Wochen alte männliche Maus gemäß dem Textprotokoll betäubt wurde; Untersuchen Sie die Anästhesietiefe, indem Sie die Muskelentspannung, den Pedalrückzug und die tastbaren Reflexe beurteilen.Wenn ein Verlust der Reflexe beobachtet wird, rasieren Sie den Unterbauch des Tieres. Bedecken Sie die Augen des Tieres mit einem sterilen Wattestäbchen vorsichtig mit tierärztlicher Augensalbe, um eine durch Xerophthalmie verursachte Erblindung zu verhindern. Verwenden Sie dann 70 % Ethanol und 10 % Providon-Jod, um den rasierten Bauch abzuwischen und den Operationsbereich zu desinfizieren.Führen Sie anschließend mit einer sterilen chirurgischen Schere einen etwa einen Zentimeter langen vertikalen Hautschnitt an der unteren Bauchmittellinie durch. Heben Sie dann mit einer feinen Pinzette das Bauchfell an, um eine Beschädigung der darunter liegenden Organe zu verhindern. und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um vorsichtig einen Schnitt von acht Millimetern oder kürzer durch das Bauchfell zu machen. Schieben Sie das Fettgewebe vorsichtig zur Seite, um die Samenblase freizulegen.Anschließend wird die Samenblase mit einer Ringzange vorsichtig angehoben, bis die vordere Prostata zu erkennen ist. Jetzt, mit einer 0,5-Milliliter-Insulinspritze und einer 30-Gauge-8-Millimeter-Nadel; Injizieren Sie ein Gesamtvolumen von 30 Mikrolitern Viruslösung in das vordere Prostataepithel. Minimieren Sie Leckagen und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit im Gewebe absorbiert wird und eine kleine Blase bildet.Platzieren Sie dann die Samenblase wieder in der Bauchhöhle. Um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit in einer kleinen Blase und ohne Leckage im Gewebe aufgenommen wird, stellen Sie sicher, dass die Injektion parallel zum Samenbläschen und der Form des vorderen Prostatalappens folgt. Nähen Sie den Damm mit einer spitz zulaufenden Nadel und einem 13 Millimeter 3/8-Kreis mit zwei bis drei einfachen unterbrochenen Stichen aus resorbierbarem 6-0-Nahtmaterial.Dann heben Sie die Haut mit einer Pinzette an, um eine Beschädigung des Peritoneums zu vermeiden. Heften Sie die Haut mit drei sterilen 4,8 x 6,5 Millimeter Clips ab. Für eine bessere Genesung nach der Operation verwenden Sie eine sterile 1-Milliliter-Spritze und eine 27 Gauge x 1/2 Zoll Nadel, um das Anästhesie-Gegenmittel in einer Dosis von 0,1 Millilitern pro Gramm Körpergewicht durch intraperitoneale Injektion zu verabreichen. Setzen Sie das Tier dann vorsichtig wieder in seinen Käfig ein.Bewahren Sie den Käfig nach dem Eingriff eine Stunde lang auf einem Heizkissen auf, um eine Unterkühlung zu vermeiden, bis er sich vollständig erholt hat. Das Tier sollte einige Minuten nach der Injektion aufwachen. Überwachen und behandeln Sie das Tier weiterhin täglich gemäß dem Textprotokoll.Und wenn sich die Wunde geschlossen hat, entfernen Sie die Hautklammern. Um die Virusabgabe an die murine Prostata zu beurteilen, wurden die Proben drei Monate nach der Operation analysiert. Wie hier gezeigt, exprimierten die in dieser Studie verwendeten Mäuse GFP in Zellen, die dem vom Virus exprimierten Cree-Protein ausgesetzt waren.Das GFP-Signal zeigt die Cree-Aktivität im Prostataepithel, aber nicht, ob die Gen-Editierung durch den CRISPR-Guide induziert wurde. Diese immunhistochemischen Schnitte identifizieren Brennpunkte von Zellen mit hoher Expression von pAKT, was auf einen Verlust von P10 hinweist. In diesen Panels wurden durch die Kofärbung von pAKT und GFP doppelt positive Zellen identifiziert, was die Transformation der Prostatazellen durch das Adeno-assoziierte Virus bestätigte.Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass in vivo die CRISPR-Cas9-Geneditierung im Prostataepithel unter Verwendung der Rosa26-LSL-Cas9-EGFP-Maus und des Adeno-assoziierten Virus durchgeführt werden kann. Einmal gemeistert, kann der Eingriff in 15 Minuten durchgeführt werden. Diese Technik ebnete den Weg für die Forschung auf dem Gebiet des Prostatakrebses, um mehrere Gene gleichzeitig in vivo zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie der murinen Prostata Substrat zuführen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einigen Viren äußerst gefährlich sein kann und bei diesen Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Bearbeitung spezifischer Gene in Prostatazellen mit Hilfe eines Adenovirus-basierten Verabreichungssystems. Der Ansatz ermöglicht eine orthotope und lokalisierte Veränderung der Genexpression unter Verwendung der CRISPR-Technologie, um neuartige Mausmodelle für Prostatakrebs zu entwickeln.

Modellierung von Prostatakrebs in gentechnisch veränderten Mausmodellen: Eine CRISPR/Cas9-vermittelte lokalisierte Gen-Editing-Technik in vorderen Prostatalappenzellen der Maus

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Das Ziel dieses Protokolls ist die Intra-Prostata Injektion von Prostata-Krebszellen, mit anschließenden Kastration zu demonstrieren. Orthotopen präklinische Modellen von Androgen-abhängigen und Kastration-resistenten Prostatakrebs sind entscheidend für die Krankheit im Zusammenhang mit einer klinisch relevanten Tumor Mikroumgebung und einem immunkompetenten Wirt zu studieren.

Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung kardiale gen bearbeiten in Vivo in Mäusen mit rekombinanten Adeno-Associated Virus (rAAV)-Lieferung von CRISPR vermittelt. Dieses Protokoll bietet eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Dystrophischen Kardiomyopathie in Duchenne-Muskeldystrophie und kann verwendet werden, um Herz-Kreislauf-spezifische ko in postnatale Mäuse zu erzeugen.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

Wir beschreiben eine neue Methode für die Lieferung von Plasmid DNA in die important-Zellen der Maus Blase in Vivo durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation. Freuen Sie sich auf eine schnelle und bequeme Möglichkeit zur Erzeugung von autochthonen Mausmodelle der Blase Krankheiten.

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte in vivo CRISPR/Cas9 Screening-Methodik mit Ultraschall-geführten in utero embryonalen lentiviralen Injektionen, um gleichzeitig die Funktionen mehrerer Gene in der Haut und Mundhöhle von immunkompetenten Mäusen zu bewerten.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzelne M213L-Mutation in Gja1, die die Connexin43-Generation in voller Länge beibehält, aber die Translation der kleineren GJA1-20k-intern übersetzten Isoform verhindert.

Entfernung einer internen translationalen Startstelle aus der mRNA unter Beibehaltung der Expression des Protein in voller Länge

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Cluster-Clustered-Regular-Interspaced-Short-Palindromic-Repeats-Gen-Editing-Workflow für die microRNA-Cluster-Netzwerkanalyse, der die schnelle Generierung eines Panels genetisch veränderter Zelllinien mit einzigartigen miRNA-Cluster-Deletionskombinationen von bis zu 35 kb innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.

CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Wir stellen ein Protokoll für die retrovirale Transduktion von Guide-RNA in primäre T-Zellen von Cas9-transgenen Mäusen vor, das eine effiziente Alternative für die Geneditierung bei der Untersuchung der Th17-Differenzierung darstellt.

Retrovirales CRISPR/Cas9-vermitteltes Gen-Targeting zur Untersuchung der Th17-Differenzierung in vitro

Lernen Sie die virale Lieferung von CRISPR/Cas9 in die murine Prostata für Gentherapie. Diese Methode ermöglicht präzise Genexpression und bietet ein neues Mausmodell für Prostatakrebsforschung.

Virus-Lieferung von CRISPR führt zu der murinen Prostata für gen-Änderung

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