Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, genetisch veränderte kortikale GABAerge Interneurone während der tangentialen Migration in einer möglichst naturnahen Umgebung sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Entwicklungsneurowissenschaften zu beantworten, indem sie die Auswirkungen des Funktionsverlusts bestimmter Gene von Proteinen während der Gehirnentwicklung untersucht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Vergleich zu anderen ähnlichen Methoden, wie z. B. der In-utero-Elektroporation, kostengünstig und relativ einfach durchzuführen ist.

So kann diese Technik letztendlich die Diagnose von Patienten mit genetischen neurologischen Entwicklungsstörungen wie Autismus und Epilepsie verbessern, indem sie die Pathogenität spezifischer Mutationen, die bei Patienten identifiziert wurden, sowie die Rolle neuer Krankheitsgene während der Gehirnentwicklung klärt. Beginnen Sie mit der Einrichtung der Biosicherheitswerkbank mit allen Instrumenten, die für die Sektion und Kultur benötigt werden. Besprühen Sie alle Instrumente in der Biosicherheitswerkbank großzügig mit 70%igem Ethanol und sterilisieren Sie die Instrumente und den Schrankinnenraum 15 bis 20 Minuten lang mit UV-Licht.

Wenn Sie bereit sind, Embryonen zu entnehmen, besprühen Sie den Bauch des euthanasierten Muttertiers großzügig mit 70% Ethanol. Ziehen Sie die Bauchhaut mit einer sterilisierten Pinzette nach oben und schneiden Sie mit der anderen Hand mit einer sterilisierten chirurgischen Schere die Haut vom Bauch ab. Ziehen Sie mit einer zweiten sterilisierten Pinzette und Schere die Bauchfaszie nach oben und schneiden Sie sie, während Sie die Gebärmutter vorsichtig vermeiden.

Halten Sie mit einer dritten sterilisierten Pinzette und Schere die Gebärmutterhörner fest und schneiden Sie sie aus der Beckenhöhle heraus. Legen Sie die präparierten Gebärmutterhörner in eine sterile 60 Millimeter große Petrischale, die mit lebovitz-Kulturmedium auf neuronaler Basis gefüllt ist, das mit Aminosäuren, Vitaminen und anorganischen Salzen ergänzt ist. In der sterilen Biosicherheitswerkbank verwenden Sie zwei Paar feine Pinzetten, um die Embryonen aus der Plazenta zu sezieren und die Köpfe durch Enthauptung zu isolieren.

Schneiden Sie die Spitze einer sterilen Drei-Milliliter-Transferpipette aus Kunststoff ab und verwenden Sie diese, um die Köpfe abzusaugen und sie in eine neue sterile 60-Millimeter-Petrischale zu übertragen, die mit dem gleichen Nahrungsergänzungsmittel auf neuronaler Basis gefüllt ist, um das Blut auszuwaschen. Übertragen Sie sie erneut in eine dritte Petrischale, die mit erstarrtem schwarzem Wachs überzogen und mit neuronalem Nährmedium gefüllt ist. Legen Sie die 16 Millimeter große Petrischale, die mit schwarzem Wachs überzogen ist und die enthaupteten Köpfe in einem neuronalen Nährmedium enthält, unter das Präpariermikroskop in der Biosicherheitswerkbank.

Verwenden Sie eine feine Pinzette, die Sie in der linken Hand halten, um den Kopf mit dem rostralen Teil nach rechts zu stabilisieren. Verwenden Sie dann den Nanoinjektor in der rechten Hand, um ein bis zwei Mikroliter der mit Farbstoff dotierten Plasmidlösung in den rechten Seitenventrikel zu injizieren. Elektroporieren Sie das injizierte Gehirn, indem Sie den Kopf zwischen die Elektroden legen, wobei die negative Elektrode dorsal und parallel zum Kopf und die positive Elektrode zur ventralen Seite des Kopfes positioniert ist, um das MGE zu erreichen.

Sobald die Elektroden gut positioniert sind, geben Sie vier Quadratimpulse von 40 Volt für 50 Millisekunden in Intervallen von 500 Millisekunden ab. Während Sie noch in der sterilen Umgebung der Biosicherheitswerkbank arbeiten, beginnen Sie, das Gehirn aus dem Schädel zu präparieren. Stabilisieren Sie zuerst den Kopf auf der schwarzen Wachsschicht, indem Sie eine Nadel in jedes Auge einführen, während Sie das Gehirn vorsichtig vermeiden.

Verwende dann eine feine Pinzette, um die linke Seite des Halses zu halten, und eine zweite feine Pinzette, um die Haut vom Schädel von hinten nach vorne zu reißen. Während du den Kopf mit einer Pinzette in der einen Hand seitlich hältst, schneidest du mit einer anderen Pinzette in der anderen Hand vorsichtig den Schädel auf Höhe des Hirnstamms ab und ziehst den Schädel nach oben. Schneiden Sie mit jeder Pinzette den Schädel in der Sagittalebene nach vorne und schneiden Sie dann seitlich ein, um die Schädelfragmente zu befreien.

Heben Sie dann den Hirnstamm an und schneiden Sie vorsichtig die Hirnhäute und Hirnnerven durch, bis das Gehirn vollständig aus dem Schädel herausragt. Füllen Sie eine 35-Millimeter-Petrischale mit geschmolzener Agaroselösung, die bei 42 Grad Celsius flüssig gehalten wird. Übertragen Sie dann schnell ein elektroporiertes Gehirn mit der zuvor geschnittenen Transferpipette in die mit Agarose gefüllte Schale.

Rühren Sie die Agarose mit einem Metallstab um, um das Gehirn in der Mitte der Vertiefung zu halten, um ein Absinken zu verhindern, und positionieren Sie das Gehirn in einer rostralen Schwanzebene parallel zur Schale. Hören Sie auf zu rühren, wenn die Agarose anfängt, sich zu verfestigen, um Schäden am Gehirn zu vermeiden. Während Sie darauf warten, dass sich die Agarose-Einbettung verfestigt, übertragen Sie 750 Mikroliter N2-supplementiertes Kulturmedium in jede Vertiefung der Sechs-Well-Kulturplatte, entsprechend der Anzahl der zu verarbeitenden Gehirne.

Und platzieren Sie in jeder mit Medium gefüllten Vertiefung einen 30 Millimeter Membraneinsatz. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge die Agarose, die das Gehirn umgibt, zu einem rechteckigen Block auf, der einen Rand von ein bis zwei Millimetern um das Gehirn herum lässt. Stellen Sie sicher, dass der rostrale Teil des Gehirns senkrecht zur vorderen Grenze des Blocks steht, um die Orientierung für die nachfolgenden Schnittschritte zu erleichtern.

Kleben Sie den Agaroseblock mit der rostralen Kante nach unten und der ventralen Kante zum Benutzer hin auf die Vibratome-Plattform. Schneiden Sie das Gehirn in koronale Schnitte, um 250 Mikrometer dicke Schnitte bei vier Grad Celsius zu erhalten. Entnehmen Sie mit sterilisierten Spateln zwei bis drei Abschnitte, die das MGE enthalten, und platzieren Sie alle Gehirnschnitte eines Tieres auf einem einzigen 30-Millimeter-Membraneinsatz.

Dabei werden Überlappungen zwischen den Abschnitten sorgfältig vermieden. Stellen Sie die Kulturplatte für 48 oder 72 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 60 % Luftfeuchtigkeit und fünf Prozent CO2 in einen belüfteten sterilen Inkubator. Nach der gewünschten Inkubationszeit werden die interessierenden Abschnitte auf ein Deckglas mit acht Kammern übertragen, das mit drei bis fünf Mikrolitern Nährmedium gefüllt ist.

Legen Sie das Deckglas in eine Klimakammer und verbinden Sie es mit einer konfokalen invertierten rotierenden Scheibe, die mit einer computergestützten Erfassungssoftware ausgestattet ist, um die Zeitraffer-Bildgebung einzurichten. Interneurone, die an E 13.5 mit einem experimentellen Plasmid, das die TD-Tomatenkassette exprimiert, und SH-RNA, die auf ein Gen von Interesse abzielt, elektroporiert wurden, sind in tangentialer Migration in einem organotypischen Hirnschnitt zu sehen, der nach 48-stündiger Kultur aus einem DLX5 6Cre RCEE GFP-Mausembryo gewonnen wurde. Die Interneurone wurden acht Stunden lang mit Hilfe von Live-Bildgebung im Zeitraffer visualisiert.

In diesem Beispiel ist das gleiche elektroporierte Interneuron im Prozess der Nukleokinese zu sehen. Während sie tangential in der Rinde parallel zur Schäloberfläche wandern. Das Neuron zeigt im Zuge der Nukleokinese zunächst einen länglichen Zellkörper.

Sowie ein Trailing-Prozess und ein verzweigter Lead-Prozess. Nach drei Stunden Live-Bildgebung ist die Nukleokinese abgeschlossen. Der nachlaufende Prozess hat sich zurückgezogen und der führende Prozess streckt zwei lange Äste aus.

Nach fünf Stunden und 30 Minuten hat sich einer der führenden Prozesszweige zurückgezogen und der Körper der Neuronenzelle hat sich um etwa 10 Mikrometer nach vorne bewegt. Schließlich, nach acht Stunden Bildgebung, hat die Migration pausiert, das Neuron hat seinen Leitprozess wieder verlängert und es ist ein Nachlaufprozess aufgetreten. Aber der Kern hat sich noch nicht weiterentwickelt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, zu jeder möglichen Zeit eine sterile Umgebung zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie MG-Elektroporationen gefolgt von Explantaten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Aufklärung der dynamischen Zytoskelettprozesse zu beantworten, die während der neuronalen Migration auf ultrazellulärer Ebene ablaufen.