Name: Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Lernen Sie die Ex-Utero-Elektroporation und organotypische Schnittkulturen embryonaler Mäusegehirne zur Live-Aufnahme der Migration GABAerger Interneuronen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Einflüsse auf die neuronale Entwicklung und neurodevelopmentale Störungen.

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Diese Arbeit wurde von Betriebskostenzuschüssen von Savoy-Stiftung und der Heilung-Epilepsie-Stiftung unterstützt und durch Ausrüstung gewährt der kanadischen Stiftung für Innovation E.R (confocal Mikroskop) und G.H (Spinning Disk confocal Mikroskop). E.r. erhält einen Karriere-Award von der Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) sowie von der Canadian Institute for Health Research (CIHR; Young Investigator Award). G.h. ist ein senior Scholar des FRQ-S. L.E ist der Empfänger des Steriade-Savoy Postdoc Training Award der Savoy-Stiftung, Postdoc Training CHU Sainte-Justine Stiftungspreis und FRQ-S Postdoc Bildungspreis, in Partnerschaft mit der Stiftung der Sterne. Dieses Projekt wurde vom Gehirn Kanada durch Kanada Brain Research Fund, mit finanzieller Unterstützung von Health Canada, verliehen an l.e. ermöglicht

Alle Experimente mit Tieren vom Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques Avec Les Animaux de Recherche (CIBPAR) am Forschungszentrum CHU Sainte-Justine genehmigt und wurden im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Ed. 2).
Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert für Elektroporation von Embryonen im embryonalen Tag (e) 13,5, zu einem Zeitpunkt wann MGE abgeleitet INs aktiv erzeugt werden, bevor die Spitze der CGE abgeleitet INs Produktion45,46. Darüber hinaus nutzen wir um die Elektroporation in Richtung GABAergic INs-bias, Förderer selektiv in INs (zum Beispiel der Dlx5/6 -Veranstalter mit seiner minimalen Enhancer)47ausgedrückt.
1. Vorbereitung der Lösungen für Electroporation und organotypischen Slice Kulturen
<ol><li>125 mL sterilen Nährmedium vorzubereiten.<ol>
<li>125 mL regelmäßige Neuron-spezifische Kulturmedium zu messen (siehe Tabelle der Materialien für die Formulierung) in eine sterilisierte Flasche in einen zuvor UV-sterilisiert Biosafety Schrank mit 70 % Ethanol besprüht. Fügen Sie 2,25 mL 50 x serumfreien Neuron-spezifische Ergänzung, 1,75 mL 200mM Glutamin (Endkonzentration von 0,5 mM) und 6,25 mL Hitze-inaktivierten Pferd Serum zuvor regelmäñig unter sterilen Bedingungen. Gut durchmischen, Aliquote in 15 mL sterile konische Rohre und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Präparierten Nährmedium kann bis zu 3 Wochen bei 4 ° c aufbewahrt werden</li>
		<li>Teilen Sie eine 100 X Botteinstein n-2 Formulierung48 -Stammlösung in 150 µL-Aliquots unter sterilen Bedingungen und bei-20 ° C bis zum Gebrauch einfrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 1 L des sterilen künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS).<ol>
<li>800 mL destilliertem Wasser in einer 1 L Becher zu messen. Fügen Sie 25,67 g Saccharose, 5,08 g Natriumchlorid (NaCl) 2,18 g Natriumbicarbonat (Nahco33) 1,80 g Glukose, 0,19 g Kaliumchlorid (KCl), 0,15 g monobasic wasserfreies Natriumphosphat (NaH2PO4), 1 mL 1 M Lager CaCl2 .2H2O und 2 mL 1 M MgSO4.7H2O. unter Rühren auflösen bei Raumtemperatur lagern. Fügen Sie destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1 L.</li>
		<li>Mit einem 0,22 µm-Filter, Filtern Sie die Lösung in eine sterile Flasche in eine sterilisierte Biosafety Kabinett und bei 4 ° C für bis zu 1 Monat aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine frische Lösung von 4 % Agarose in ACFS vor jedem Experiment.<ol>
<li>Messen Sie 25 mL der vorbereiteten ACFS in einem 50 mL sterile konische Rohr zu und fügen Sie 1 g Niedrigschmelzende Punkt Agarose.</li>
		<li>Wärme für 45 s in der Mikrowelle. Um zu vermeiden, Verschütten, unterbrechen Sie Heizung Alle 3-4 s, beim Kochen beginnt, öffnen Sie das Rohr um den Druck aus, schließen Sie ihn wieder und agitieren manuell die Agarose mischen zu lassen. Wiederholen Sie, bis die Agarose-Lösung homogen ist. Halten Sie die Agarose-Lösung bei 42 ° C, während der Rest des Experiments, Erstarrung zu vermeiden. Hinweis: Höhere Temperaturen beschädigen Hirngewebe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung der Plasmide Injektionslösung
<ol><li>Ziehen Sie eine Glaspipette Mikroinjektion<ol>
<li>Mikropipette Abzieher mit den richtigen Parametern eingestellt, die Glas-Kapillare in den zur Verfügung gestellten Raum zu sichern und stellen Sie sicher, dass es mit dem Filament zentriert ist.</li>
		<li>Drücken Sie die Schaltfläche "ziehen".</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die neugebildeten Mikroinjektion Pipetten aus der Hitze Puller und in einer Box oder einem sauberen Petrischale bis zur weiteren Verwendung zur Vermeidung von Schäden die Spitze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufbau der Biosicherheit Schrank mit allen Instrumenten benötigt dafür experimentieren (siehe Abbildung 1A), Sprühen Sie großzügig alle Instrumente in der Biosicherheit Schrank mit 70 % Ethanol und Sterilisieren die Instrumente und die Umwelt mit UV-Licht für 15-20 min.</li>
	<li>Während der Sterilisation Schritt tauen Sie Plasmide auf Eis (4 ° C auf).</li>
	<li>Messen Sie 10 µL des Plasmids aus einer Stammlösung (4 µg/µL) in eine saubere 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. 0,01 % der schnell grün FCF hinzufügen. Vorsichtig mischen, kurz drehen und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung. Hinweis: Maxi-Prep DNA sollte nach der Hersteller-Protokoll mit einem Endotoxin-freie Maxi-Prep Kit vorbereitet werden. DNA kann in TE-Puffer oder Nuklease-freie solubilisiert werden H2O und die Vorbereitung des Plasmids mit Farbstoff Lösung kann jedoch nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Plasmide von Maxi-Prep sollte regelmäñig, mehrere Gefrier-tau-Zyklen zu vermeiden. Regelmäñig Plasmide sollte mit der Farbstoff nicht mehr, dass 2 h vor Gebrauch gemischt werden und sollten nicht für die weitere Verwendung eingefroren werden.</li>
	<li>Bereiten Sie nach der Sterilisation die Nano-Injektor wie folgt vor.<ol>
<li>Wählen Sie eines der zuvor vorbereiteten Mikroinjektion Glaspipette gespeichert in einem sauberen Box oder Petrischale und kleine Pinzette verwenden, schneiden Sie die PIPETTENSPITZE abgeschrägte gewissermaßen einen Außendurchmesser von ca. 15 µm zu erreichen. Hinweis: Der hier gegebenen Außendurchmesser ist eine ungefähre Maßnahme, um dem Benutzer eine Vorstellung davon, was wir in unseren Experimenten nutzen und wurde optimiert, um das piercing des Schädels Injektionslösung Plasmid ohne Beschädigung des Gehirns, wobei für das Fluid zu erleichtern Laden und Freigabe der DNA. Der äußere Durchmesser kann gemessen werden, durch die geschnittene Spitze der Mikroinjektion Glaspipette apposed um eine mikrometrische Maßstabsleiste unter dem Hellfeld-Mikroskop betrachten.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Spritze, um die Mikropipette mit Mineralöl aus seinem unpulled Ende (um die Luft zu vertreiben) zu füllen.</li>
		<li>Legen Sie die gefüllten Glas Mikropipette im Nano-Injektor durch Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Leere 2/3rds der das Glas Mikropipette (wobei genug Öl, um Lufteintritt zu verhindern).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sorgfältig einfügen Sie vorbereitete Mikropipette in das Röhrchen mit dem Plasmid/Farbstofflösung und füllen Sie das Glas Mikropipette mit Plasmid/Farbstofflösung.</li>
</ol>3. Sammlung von Mäuseembryonen von trächtigen Weibchen
<ol><li>Zuchthündinnen täglich um zu beurteilen für vaginale einstecken, vorzugsweise zur gleichen Zeit täglich (am frühen Nachmittag) zu überwachen. Tag e0.5 entspricht dem ersten Tag als ein vaginaler Stecker beobachtet wird. Hinweis: Die hier beschriebenen Experimente können in Wildtyp Mäusen durchgeführt werden. Jedoch, um die Identifizierung der MGE zu erleichtern und alle GABAergic INs (oder bestimmte Teilmengen wie MGE abgeleitet INs) zu kennzeichnen, Transgene Tiere können verwendet werden (z.B.: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre mit einem Cre-Reporter-Allel, etc.47,49). In diesem Fall sollte das experimentelle Plasmid injiziert zum Ausdruck bringen eine andere Fluorophore (zum Beispiel mCherry oder TdTomato) ermöglichen die Visualisierung der transfizierten INs (gelb), die mit nicht-transfizierten INs (grün) verglichen werden kann.</li>
	<li>Das Weibchen an embryonalen Tag e13.5 durch Hals Luxation zu opfern. Hinweis: Zum Zeitpunkt des Opfers Anästhetika können Auswirkungen auf Migration und Überleben50,51 und sollte vermieden werden.</li>
	<li>Embryonen wie folgt per Kaiserschnitt zu sammeln.<ol>
<li>Sprühen Sie den weiblichen Bauch großzügig mit 70 % Ethanol. Hochziehen Sie die Bauchhaut mit einer sterilen Pinzette und mit der anderen Hand verwenden Sie sterilisierte chirurgische Scheren, schneiden Sie die Haut aus dem Bauch.</li>
		<li>Hochziehen Sie mit einem zweiten paar sterilisierte Pinzette und Schere die Bauch-Faszie und schneiden Sie es vorsichtig die Gebärmutter zu vermeiden.</li>
		<li>Mit einer dritten sterilisierte Pinzette und Schere, ziehen Sie die uterine Hörner und schneiden Sie sie aus der Beckenhöhle. Legen Sie die seziert uterine Hörner in einer sterilen 60 mm Petrischale gefüllt mit neuronalen basierende Kulturmedium mit Aminosäuren, Vitaminen und anorganische Salze (siehe Tabelle der Materialien für handelsübliches Produkt) ergänzt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie in einem sterilen Biosafety Kabinett zwei Paare von feinen Pinzette (eins in jeder Hand) zu sezieren die Embryonen aus der Plazenta und isolieren die Köpfe durch Enthauptung.</li>
	<li>Schrägschnitt eine sterile 3 mL Kunststoff Transfer PIPETTENSPITZE Aspirieren Sie die Köpfe und Transfer in eine neue sterile Petrischale 60 mm mit erstarrten schwarzen Wachs geschichtet und gefüllt mit der gleichen neuronalen Basis ergänzt Kulturmedium wie oben beschrieben. Hinweis: Dieser Schritt minimiert die Übertragung von Kontaminanten (Maus Haare, Blut). Die schwarzen Wachs wird verwendet, um den Kopf während der Präparation zu stabilisieren. Nährmedien müssen nicht während dieser Verfahren Sauerstoff.</li>
</ol>4. intraventrikuläre Plasmid-Injektionen und Ex Vivo Elektroporation von der MGE
Hinweis: Die folgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen in die vorher vorbereiteten Biosicherheit Schrank durchgeführt werden.
<ol><li>Ort der 60-mm-Petrischale mit schwarzen Wachs geschichtet und enthält die abgeschlagenen Köpfe in neuronale Grundlage Kulturmedium unter das Fernglas in die Biosicherheit Kabinett ergänzt.</li>
	<li>Stabilisieren Sie den Kopf, die rostral Teil nach rechts, mit einer feinen Pinzette mit der linken Hand und mit der Nano-Injektor in der rechten Hand um 1-2 µL Plasmid/Farbstofflösung in den rechten seitlichen Ventrikel zu injizieren. Bemerkung: Co Experimente kann von co-Electroporating ein Rettungs-Plasmid und eine ShRNA exprimierenden Plasmid durch die Vermischung beider Plasmide bei äquimolaren Konzentrationen durchgeführt.</li>
	<li>Electroporate das Gehirn injiziert.<ol>
<li>Legen Sie den Kopf zwischen den Elektroden mit der negativen Elektrode positioniert dorsal und parallel zum Kopf und die positive Elektrode in Richtung der ventralen Seite des Kopfes, um gezielt die MGE.</li>
		<li>Sobald die Elektroden gut positioniert sind, liefern Sie 4 quadratische Impulse von 40 V für 50 ms bei 500 ms Inter Puls Intervalle.</li>
		<li>Entfernen Sie jede verbleibende Gewebe von den Elektroden mit einer Pinzette, die bereits in der Biosicherheit Schrank platziert. Hinweis: Diese Parameter wurden speziell für die Electroporator in unseren Experimenten verwendet optimiert. Es wird empfohlen, dass die Nutzer vorher Optimierung Tests durchführen, wenn eine andere Art von Electroporator zu verwenden.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.3 für alle übrigen Gehirne. Hinweis: Obwohl dieses Protokoll die Manipulationen für ein Gehirn benötigt beschreibt, ist es möglich, bis zu 4 Köpfe nacheinander vor Electroporating jedes Gehirn, wodurch sich des Ertrags injizieren. Diese Strategie ist besonders vorteilhaft, wenn 2 oder mehr verschiedene Plasmide sequenziell (z. B. Kontrolle oder experimentelle Plasmid) während das gleiche Experiment (so dass für den Vergleich zwischen wurfgeschwistern) injiziert werden. Darüber hinaus ist es möglich, Spritzen und Electroporate gleichzeitig beide Seiten des Gehirns, um den Ertrag zu steigern, durch die Positionierung der Elektroden vollständig parallel zu der Oberfläche des Gehirns.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Gehirn Sie sezieren und organotypischen Slice Kulturen
<ol><li>Während noch in der sterilen Umgebung der Biosicherheit Kabinett zu manipulieren, sezieren Sie das Gehirn aus dem Schädel.<ol>
<li>Stabilisieren Sie den Kopf auf die Schicht des schwarzen Wachs durch eine Nadel in jedes Auge während des Gehirns sorgfältig zu vermeiden.</li>
		<li>Verwenden Sie ein paar feine Pinzette auf um der linken Seite des Halses und ein zweites Paar feine Pinzette, um die Haut vor den Schädel, von hinten nach vorne reißen zu halten.</li>
		<li>Halten Sie den Kopf seitlich mit einer Pinzette in der Hand, verwenden Sie ein weiteres Paar Pinzette in der anderen Hand, schneiden Sie vorsichtig den Schädel auf der Ebene der Hirnstamm und ziehen vorsichtig den Schädel auf. Mit jeder Pinzette Schneiden des Schädels in der Sagittalebene (Mittellinie) nach vorne, und dann seitlich Einschneiden, um die Schädel-Fragmente zu befreien.</li>
		<li>Heben Sie den Hirnstamm und schneiden Sie vorsichtig die Hirnhäute und Hirnnerven, bis das Gehirn aus dem Schädel komplett ist. Hinweis: Alle in 5.1 beschriebenen Schritte sollte unter streng sterilen Bedingungen in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Betten Sie das Gehirn in 4 % niedrig schmelzende Punkt Agarose für schneiden.<ol>
<li>Füllen Sie eine 35-mm-Petrischale mit über vorbereitete Agarose-Lösung (bei 42 ° C flüssig gehalten).</li>
		<li>Schnelle Übertragung eine elektroporiert Gehirn in die Agarose-gefüllte Schale mit der zuvor ausgeschnittene transferpipette. Die Schüssel bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
		<li>Rühren Sie die Agarose mit einem Metallstab, das Gehirn in der Mitte der Brunnen (zum Untergang zu verhindern) zu halten und das Gehirn in einer Rostro-kaudalen Ebene parallel auf den Teller zu positionieren. Nicht mehr rühren, wenn die Agarose beginnt zu festigen, um eine Schädigung des Gehirns zu vermeiden.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Agarose umgibt das Gehirn um einen rechteckigen Block, eine Marge von 1 bis 2 Millimeter zu verlassen, um das Gehirn herum bilden geschnitten. Sicherstellen Sie, dass die rostral Teil des Gehirns senkrecht zu der vorderen Begrenzung des Blocks zur Erleichterung der Orientierung für die nachfolgenden speziellen Schritte ist.</li>
		<li>Wiederholen Sie für jedes Gehirn. Hinweis: Es ist möglich, mehr als ein Gehirn zu einem Zeitpunkt (maximal 3) zu schneiden, durch Gestaltung von separaten Agarose Blöcke während der Einstellung jedes Gehirn in unterschiedlichen Höhen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vibratome koronalen Abschnitte und Slice-Kultur.<ol>
<li>Tauwetter ein Aliquot von 100 X n-2 (150 µL) auf Eis zu ergänzen und 15 mL regelmäñig Kulturmedium unter sterilen Bedingungen hinzufügen.</li>
		<li>750 µL Kulturmedium (mit 1 X N2 Zuschlag) in jede Vertiefung einer Kultur 6-Well-Platte zu übertragen.</li>
		<li>Legen Sie mit gebogenen Pinzette eine Zelle Kultur Einsatz (Durchmesser 30 mm, 0,4 µm Porengröße, PTFE) in jedem Medium-gut gefüllt.</li>
		<li>Füllen Sie das Vibratome Bad mit ständig sauerstoffreiches ACFS. Mit Eis rund um das Bad auf 4 ° C kühlen Sie ab, oder verwenden Sie einen gekühlten Vibratome.</li>
		<li>Vibratome Geschwindigkeit 0,150 mm/s und Frequenz bis zu 80 Hertz einstellen.</li>
		<li>Kleben Sie die Agarose-Block auf der Vibratome Plattform, rostral Kante nach unten und ventralen Rand mit Blick auf den Benutzer.</li>
		<li>Schneiden Sie das Gehirn im koronalen Abschnitte 250 µm Dicke Abschnitte (bei 4 ° C) zu erhalten.</li>
		<li>Mit sterilisierten Spachteln sammeln Sie 2-3 Abschnitte mit MGE und Stelle alle Gehirn-Abschnitte von einem Tier auf einer einzelnen 30-mm-Membran einfügen sorgfältig vermeiden Überschneidungen zwischen Abschnitten. Legen Sie den Einsatz in einem gut einer Kultur 6-Well-Platte (mit 750 µL ergänzt Kulturmedium, wie oben beschrieben). Alternativ kann jeder Abschnitt auf einer separaten 13-mm-Durchmesser-Membran in einem 12-Well Kultur Teller gefüllt mit 500 µl ergänzt Kulturmedium platziert werden. Die Höhe der Nährmedium empfohlen für jedes gut ermöglicht die Gehirn-Abschnitte von den Medien genährt werden, ohne als untergetaucht. Hinweis: In 5.3.6 und 5.3.7 beschriebenen Schritte sind nicht unter komplette sterilen Bedingungen durchgeführt, es sei denn der Vibratome sterilisiert und in einen Schrank Biosafety verwendet werden kann. Daher ist es wichtig, diese Schritte sorgfältig, um eine Kontamination zu vermeiden führen. Geeigneter Schutzausrüstung (saubere Maske, OP-Handschuhe und Kittel) sollte zu allen Zeiten und Körperteile, getragen werden sogar bedeckt, wie Haare, Gesicht und Hände, sollten nie über Kultur-Platten (mit oder ohne Kulturmedium) übergeben. Es wird auch empfohlen, Sprühen Sie 70 % Ethanol häufig auf die Handschuhe und Spachtel verwendet, um das Gehirn Abschnitte zu sammeln.</li>
		<li>Platzieren Sie die Kultur-Platte in einem belüfteten sterile Inkubator bei 37 ° C mit 60 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 48 oder 72 h. Hinweis: Diese Inkubationszeiten waren für Zeitraffer-Bildgebung von MGE abgeleitet INs und konfokale Abbildung von festen Scheiben bzw. optimiert. Optimale Inkubationszeiten sollte im Voraus für jede Versuchsanordnung getestet werden. Darüber hinaus, wenn die gewählte Inkubation 72 h und unter, gibt es keine Notwendigkeit, das Kulturmedium ändern. Für längere Inkubationszeiten sollte das Kulturmedium alle 2-3 Tage geändert werden.</li>
		<li>Übertragen Sie nach der gewünschten Inkubationszeit die Abschnitte von Interesse, eine 8-gekammert deckgläschen geben Sie und 3-5 µL Kulturmedium. Ort das Deckglas in einer Klimakammer (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 60 %, 5 % CO2) mit einer invertierten verbunden spinning Disk konfokale ausgestattet mit eine EDV-gestützte Datenerfassungs-Software zum Aufbau der Zeitraffer bildgebenden Sitzung. Hinweis: Alternativ können Abschnitte mit 4 % Paraformaldehyd (über Nacht bei 4 ° C oder 2 h bei Raumtemperatur) und anschließend Immunostained mit verschiedenen Antikörpern zur Visualisierung der morphologischen Merkmale der elektroporiert INs unter einem konfokalen fixiert werden Mikroskop. Obwohl eGFP und mCherry durch konfokale Mikroskopie ohne Counter befleckenden Verfahren sichtbar gemacht werden können, empfehlen wir Immunohistochemistry gegen GFP und mCherry, um das Signal zu verbessern, da die Fixierung Prozess Fluoreszenz, reduzieren kann reduzieren die Erkennung der feineren Bestandteile des embryonalen Nervenzellen, wie kleinere Äste in die führende oder nachfolgende Prozesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben. Die hierin geäußerten Ansichten repräsentieren nicht unbedingt die Meinung der Gesundheitsminister oder der Regierung von Kanada.

In diesem Artikel bieten wir eine zuverlässige Methode für die Durchführung von ex Utero Elektroporation der Maus MGE in e13.5 und zur Erzeugung von organotypischen Kulturen der embryonalen Gehirnscheiben. Obwohl in-vitro- Methoden, z. B. Boyden Kammer Assay, relativ einfach sind durchzuführen und verwendet werden, können um die spezifischen Rollen von verschiedenen Genen und Proteinen ohne die Einmischung von anderen Faktoren zu beurteilen, schließen sie die Untersuchung IN Migration-Dynamik im Hinblic...

Kortikale Gabaergen Interneuronen (INs) sind vielfältig in Bezug auf ihre biochemische Eigenschaften, physiologische Eigenschaften und Konnektivität, und sie vermitteln verschiedene Funktionen im Reifen Netzwerke1,2,3 ,4,5. Die Spezifikation der verschiedenen Subtypen der kortikalen INs ist streng reguliert durch genetische Kaskaden, die ausgiebig studiert1,2. Die Mehrheit (70 %) der kortikalen GABAergic INs stammen von Vorfahren in der medialen ganglionic Eminenz (MGE), eine ventral befindet sich embryonale Struktur und muss migrieren über relativ große Entfernungen auf die kortikale Platte1, zu erreichen 2 , 6. während kortikale Pyramidenzellen Radial auf die kortikale Platte entlang der radialen Glia-Gerüst aus der ventrikulären Zone (VZ) migrieren, die tangentiale Migration ins, die nicht zu solch einem Gerüst befestigt sind, erfordert eine Vielzahl von inneren und extrinsische Signale zu Migration von Neuronen in Richtung der kortikalen Platte zu gewinnen, und führen sie weg von nicht-kortikale Strukturen2,7,8. Nach Verlassen des Zellzyklus, INs sind abgestoßen von der MGE von Chemo-abstoßende Signale innerhalb der VZ MGE, tangentialer Übergang zu den kortikalen Platte9,10auslöst. Migration INs vermeiden das Striatum mit Hilfe von verschiedenen abstoßende Signale11 und, nach Erreichen der kortikalen Platte, sie wechseln Sie von einen tangential zu radial Migrationsmodus und erreichen ihre laminar Endlage, teils in Erwiderung auf Signale von Pyramiden Zellen12 und anderen zellularen Bevölkerungen13. Die Migration von INs, wie bei anderen neuronalen Populationen beinhaltet verschiedene dynamische morphologische Veränderungen um die tatsächliche Bewegung des Neurons zu ermöglichen. Diese so genannte neuronale Fortbewegung zeichnet sich durch sich wiederholende Zyklen von drei aufeinander folgenden Schritten: die Dehnung von einem führenden Prozess, eine aktive Anterograde Bewegung des Kerns (Nucleokinesis) und das Einfahren der nachfolgende Prozess14. BEI der Migration wird durch zahlreiche intrinsische und extrinsische Signale reguliert, die Verzweigungen und aktive Umgestaltung des führenden Prozesses INs führen in die richtige Richtung, Bestimmung, Ausrichtung und Geschwindigkeit der Migration14,15 fahren ,16.
Die Determinanten, die Regulierung der kortikalen Migration haben in den letzten Jahren1,2,7,17,18,19,20ausführlich untersucht, und Störungen in einigen dieser molekularen Akteure hat postuliert, führen zu Entwicklungsstörungen des, wie pädiatrische refraktäre Epilepsie oder Autismus Spektrum Störungen1,2,21, 22 , 23 , 24. daher die Entwicklung von in Vitro und in Vivo Ansätzen verfolgt wurden, um unsere Fähigkeit, dieser dynamischen Prozess, wie zuvor bewertete25erheblich voranbringen. In-vitro- Methoden, einschließlich der Boyden Kammer Assay und der Streifen-Wahl-Test bieten die schnellste und die meisten reproduzierbare Mittel zur Bewertung der Anforderung und Zelle-autonome Auswirkungen von bestimmten Genen oder Proteinen während der neuronalen Migration, ohne der Einfluss anderer Faktoren25. Diese Tests sind besonders nützlich in Kombination mit live-Imaging8,26,27. Mit diesen Techniken INs leicht aus e13.5 MGE abgerufen und durch enzymatische und mechanische Dissoziation, wonach verschiedene Signalwege und Anleitung Hinweise untersucht werden können, isoliert, wie zuvor dargestellt,8,28 . Doch statt diese Assays in eine künstliche extrazelluläre Matrix in Ermangelung von dreidimensionalen Gewebearchitektur, die neuronale Verhalten und Zelle Eigenschaften potenziell beeinflussen Zelle Migration und/oder überleben25verändern kann. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden als alternative Instrument zur Quantifizierung der dynamischen morphologische Veränderungen während der Migration zusammen mit Parametern wie Geschwindigkeit und Orientierung14 Ex Vivo MGE Explantaten entwickelt, 29. Generierung von MGE Explantaten ist relativ einfach und wurde ausgiebig30an anderer Stelle beschrieben. Es umfasst die Beschichtung ein kleiner Auszug der MGE auf einem monomolekularen Film gemischte kortikale Zellen oder in einem Gemisch von Matrigel und Kollagen in Anwesenheit von anziehend oder abstoßend Cues25, obwohl letztere optional31 sind. MGE Explantaten ermöglichen hochauflösende Bildgebung des spärlich markierten Zellen, Vereinfachung der Studie von intrazellulären Prozessen, wie Zellskelett Umbau bei führenden Verzweigungen, wie zuvor gezeigt,32,33 ,34 und in der vorliegenden Studie. MGE Explantate sind erfolgreich benutzt worden, um dynamische Zellskelett Veränderungen während der Migration in einer 2D Umgebung, zum Beispiel nach bestimmten pharmakologischen oder chemotaktische Manipulationen zu beurteilen (siehe z. B. Tielens Et Al. 201633) . Aber mit diesem Ansatz INs Wandern innerhalb einer künstlichen Matrix, und dies könnte IN Verhalten und die Reproduzierbarkeit und die Bedeutung der experimentellen Ergebnisse verändern.
Im Gegensatz dazu in Utero Elektroporation ermöglicht die genetische Manipulation von INs in ihrer natürlichen Umgebung und ist eine weit verbreitete Methode, um schnell und effizient die Auswirkungen von Gewinn und Verlust der Genfunktion beurteilen unter Umgehung der Beschränkungen des Kosten- und zeitintensive Knockout und Knock-in Strategien25,35. In Utero Elektroporation kann auf IN Stammväter indem Zelle Art spezifische Promotoren und Positionierung der Elektroden in Richtung ventromedialen Strukturen, einschließlich die MGE36voreingenommen sein. Darüber hinaus Elektroporation ermöglicht die rechtzeitige Ausdruck der experimentellen Konstrukte innerhalb von 1-2 Tagen, Vektoren in der Gebärmutter im Vergleich zu den 7-10 Tage benötigt, Konstrukt Ausdruck virale25. Jedoch tendenziell in Utero Elektroporation von IN Stammväter geringer Sprengkraft. In der Tat, obwohl pyramidale Zelle Vorfahren liegt in der dorsalen ventrikuläre Zone effizient transfiziert werden können ist in der Gebärmutter mit Elektroporation, targeting mehr ventral befindet sich Strukturen, z. B. die MGE mehr technisch anspruchsvoll, vor allem in kleinen e13.5 reduziert Embryonen und die hohe Rate der embryonalen Tödlichkeit weiter die experimentelle Ertrag25.
Zur Umgehung der technischen Einschränkungen verbunden mit in-vitro- MGE explant Experimente und in Vivo im Mutterleib Elektroporation, ex Vivo organotypischen Slice Kulturen wurden entwickelten8,37, 38,39. Gehirn organotypischen Slice Kulturen bieten der Vorteil der Nachahmung in Vivo Bedingungen während weniger teuer und zeitaufwendig als Erzeugung von25 Tiermodelle. In der Tat, diese Präparate ermöglichen einen einfachen Zugang zu den MGE, zusammen mit der spezifischen Visualisierung von INs, und ist kombinierbar mit fokalen Elektroporation, spezifische Molekulare Signalwege im INs Migration in einem mehr physiologische Umgebung8 zu untersuchen , 39 , 40 , 41. Wir haben deshalb einen Ansatz für organotypischen Kulturen38, die wir mit Ex Utero Electroporation und Time-Lapse confocal Imaging kombiniert optimiert, zur weiteren Beurteilung die morphologischen und dynamischer Prozess auftretenden bei der tangentialen Migration von MGE-INs. Dieses Protokoll wurde angepasst und optimiert von anderen, die Ex Utero oder in Utero Gehirn Electroporation und organotypischen Slice Kulturen verwendet, um die Migration von Pyramidenzellen42,43 zu studieren und kortikale INs36,39,44. Insbesondere mausembryonen enthauptet und die MGE ist elektroporiert Ex Vivo nach der intraventrikulären Injektion von den experimentellen Plasmiden ermöglicht effizientes und präzises targeting von MGE Stammväter als erreichten mit in Utero Elektroporation. Die Köpfe werden dann extrahiert und geschnitten in Gesamt-Hirn koronalen Scheiben, die für ein paar Tage kultiviert werden können, wodurch die kontinuierliche tracking und imaging-transfizierten ins. Dieser Ansatz kennzeichnet in der Regel 5-20 tangential Migration INs pro Gehirn-Scheibe, die Minimierung von experimentellen Iterationen erforderlich, um die statistischen Signifikanz zu erreichen, während die Kennzeichnung einer ausreichend spärlichen neuronalen Bevölkerung dafür einfache Trennung von einzelner Neuronen für Wiederaufbau und feine morphologische Beurteilung. Darüber hinaus im Vergleich zu MGE Explantaten organotypischen Kulturen zu gewährleisten, dass Migration INs ausgesetzt sind ein natürlicher Umgebung, einschließlich lokal sezernierten Chemokine und Inputs thalamische afferenzen. Dieser Ansatz eignet sich daher gut zur Direktionalität und wandernden Weg angenommenen transfizierten INs, bietet ausreichend anatomische Details ermöglicht die Charakterisierung der feineren dynamische Prozesse wie führende Prozess Verzweigung zu quantifizieren, Nucleokinesis und nachgestellten Prozess zurückziehen.

<table><tbody><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Kommerziell erhältliches neuronenspezifisches Kulturmedium. Vollständige Formulierung auf dieser Website erhältlich: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td></tr><tr><td>B-27 serumfreies Supplement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td>50X serumfreies neuronenspezifisches Supplement</td></tr><tr><td>15 mL sterile Zentrifugenröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamin)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415064</td><td>Handelsübliches Nährmedium auf neuronaler Basis, ergänzt mit Aminosäuren, Vitaminen und anorganischen Salzen. Vollständige Formulierung auf der Website des Händlers verfügbar&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum, hitzeinaktiviert</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H1138-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurocell Supplement N-2 100X</td><td>Wisent</td><td>305-016</td><td>Botteinstein's N-2 Formulierung</td></tr><tr><td>VWR Square PETG Media Flaschen 125 mL</td><td>VWR</td><td>89132-062</td><td></td></tr><tr><td>Klasse II Typ A Biosicherheitswerkbank</td><td>Nuaire</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>BioShop</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>BioShop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific S233-500</td><td></td></tr><tr><td>D+ Glukose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat einbasisch </td><td>wasserfrei BioShop</td><td>SPM400.500</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>BiosShop</td><td>MAG522</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL sterile Zentrifugenröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrumente Co.</td><td>Modell P-97</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm I.D. x 75 mm Kapillarrohr</td><td>Drummond scientific</td><td>1-000-800/12</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>E193</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Spritze</td><td>Becton Dickinson & Co</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl (schwer)</td><td>Rougier Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WPI Swiss Pinzette #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>504511</td><td>11 cm, gerade, 0,06x0,07mm Spitzen, antimagnetisch. Sie benötigen 2 davon.</td></tr><tr><td>WPI Swiss Pinzette #7</td><td>World Precision Instruments</td><td>504504</td><td>11,5 cm, 0,18x0,2mm, gebogene Spitzen</td></tr><tr><td>HTC Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>504617</td><td>11 cm, Gerade, flach</td></tr><tr><td>Operationsschere</td><td>World Precision Instruments</td><td>501225</td><td>16 cm, Scharf/scharf, gerade. Sie benötigen 3 davon.</td></tr><tr><td>Abrichtzange</td><td>World Precision Instruments</td><td>501217</td><td>12,5 cm, gerade, gezahnt</td></tr><tr><td>Iriszange</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>504478 10,2 cm, volle Kurve, gezahnt</td></tr><tr><td>DeBakey Gewebezange</td><td>World Precision Instruments</td><td>501996</td><td>15 cm, 45° Winkel, zarter Kiefer, 1,5 mm</td></tr><tr><td>breiter Fisherbran Mikrospatel mit abgerundeten Enden FisherScientific</td><td></td><td>21-401-5</td><td>Sie benötigen 2 davon.</td></tr><tr><td>Nanoject II Auto-Nanoliter-Injektor</td><td>Drummond scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>TC Schale 60, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td>60-mm-Schale</td></tr><tr><td>Gewebekulturschale</td><td>Sarstedt</td><td>83.1800</td><td>35-mm-Schale</td></tr><tr><td>Schwarzes Wachs</td><td>FisherScientific</td><td>S17432</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten&nbsp;</td><td>Ultident</td><td>170-CTB700-212</td><td>3 mL, kleine Glühbirne</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica M80</td><td>Als Ersatz für unser vom Hersteller abgekündigtes Stereomikroskop (StereoMaster von FisherScientific)</td></tr><tr><td>Electro Square Porator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetten, Plattinum Plated, 3mm</td><td>BTX Harvard Apparatur</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 1/2</td><td>Becton Dickinson & Co</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1000S Mikrotom mit vibrierender Klinge</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>GEM, Einschneidige Rasierklinge</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71952-10</td><td>Entfernen Sie das stumpfe Ende, bevor Sie es in die dafür vorgesehene Stelle der Klinge des Vibratoms einführen</td></tr> <tr><td>& Mikro-Objektträger 8 Well</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>Packung mit 15</td></tr><tr><td>Millicell Zellkultureinsatz</td><td>Millipore-Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td>30 mm, hydrophiles PTFE, 0,4 & Mikro; M Pore, Packung à 50.&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica DMi6000 Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Konfokaler Spinning-Disk-Kopf Ultraview Vox</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.0 Erfassungssoftware</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LiveCell Stage Top Inkubationssystem</td><td>Pathologiegeräte</td><td>LC30030</td><td>Bietet Temperatur-, CO2- und Feuchtigkeitskontrolle.</td></tr><tr><td>SP8 Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherry-Lifeact-7</td><td>Addgene</td><td>54491</td><td>Geschenk von Michael Davidson</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>25G Flasche, zertifiziert von der Biological Stain Commission</td></tr></tbody></table>

ex utero elektroporation und organotypischen slice kulturen der embryonalen mäusegehirnen für live-aufnahmen von migration gabaergen interneuronen

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Gabaergen Interneuronen (INs) sind wichtige Komponenten der neuronalen Netzwerke, die Kognition und Verhalten zu steuern. Dazu bestimmt, den Kortex bevölkern INs migrieren tangential aus ihren Herkunftsort in der ventralen Telencephalon (u. a. aus der medialen und kaudalen ganglionic Eminenzen (MGE, CGE)), um die dorsale kortikale Platte in Reaktion auf eine Vielzahl von inneren und äußeren Hinweise. Verschiedene Methoden wurden im Laufe der Jahre zu genetisch bestimmte Wege zu manipulieren und zu untersuchen, wie sie die dynamische Zellskelett Änderungen erforderlich, für eine ordnungsgemäße regulieren IN der Migration. In Utero Elektroporation wurde ausgiebig genutzt, um die Wirkung des Gens Repression zu untersuchen oder Überexpression in spezifischen IN Subtypen bei der Bewertung der Auswirkungen auf Morphologie und Endposition. Jedoch während dieser Ansatz leicht Radial wandernde Pyramidenzellen ändern verwendet wird, ist es technisch schwierig wenn targeting VG In Utero Elektroporation eine geringe Ausbeute angesichts der verringerten Überlebensraten von Welpen erzeugt bei Elektroporation ist vor e14.5, wie üblich bei MGE-abgeleitete INs Studium durchgeführt. In einem alternativen Ansatz MGE Explantaten bieten einen einfachen Zugang zu den MGE und erleichtern die Darstellung der gentechnisch veränderten INs. Jedoch in diesen Explantaten INs Wandern in eine künstliche Matrix, frei von endogenen Anleitung Cues und thalamische Eingänge. Dies veranlasste uns, eine Methode zu optimieren, wo INs in einer Umgebung mit naturalistischer migrieren können, unter Umgehung der technischen Herausforderungen in Utero Ansätze. In diesem Artikel beschreiben wir die Kombination von Ex Utero Elektroporation von embryonalen mäusegehirnen gefolgt von organotypischen Slice Kulturen leicht nachverfolgen, Bild und gentechnisch veränderten INs entlang ihrer natürlichen Wege als Reaktion auf die Migration zu rekonstruieren körpereigene Signale. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung die dynamischen Aspekte der Migration mit Time-Lapse confocal Imaging sowie die detaillierte Analyse der verschiedenen morphologischen Parameter mithilfe neuronale Rekonstruktionen auf festen Immunolabeled Gewebe.

In diesem Abschnitt bieten wir repräsentative Ergebnisse nach der Ex Utero Elektroporation ein Steuerelement Plasmid oder eine experimentelle Plasmid Ausrichtung auf ein Gen des Interesses an der MGE e13.5 mausembryonen gefolgt von organotypischen Slice Kulturen bei 37 ° C für 48 h (für Zeitraffer-Tomographie) oder 72 h (für Fixierung und immunhistochemische Kennzeichnung) inkubiert (siehe Abbildung 1 b schematische Protokoll). Repräsentative Beispie...

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, genetisch veränderte kortikale GABAerge Interneurone während der tangentialen Migration in einer möglichst naturnahen Umgebung sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Entwicklungsneurowissenschaften zu beantworten, indem sie die Auswirkungen des Funktionsverlusts bestimmter Gene von Proteinen während der Gehirnentwicklung untersucht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Vergleich zu anderen ähnlichen Methoden, wie z. B. der In-utero-Elektroporation, kostengünstig und relativ einfach durchzuführen ist.So kann diese Technik letztendlich die Diagnose von Patienten mit genetischen neurologischen Entwicklungsstörungen wie Autismus und Epilepsie verbessern, indem sie die Pathogenität spezifischer Mutationen, die bei Patienten identifiziert wurden, sowie die Rolle neuer Krankheitsgene während der Gehirnentwicklung klärt. Beginnen Sie mit der Einrichtung der Biosicherheitswerkbank mit allen Instrumenten, die für die Sektion und Kultur benötigt werden. Besprühen Sie alle Instrumente in der Biosicherheitswerkbank großzügig mit 70%igem Ethanol und sterilisieren Sie die Instrumente und den Schrankinnenraum 15 bis 20 Minuten lang mit UV-Licht.Wenn Sie bereit sind, Embryonen zu entnehmen, besprühen Sie den Bauch des euthanasierten Muttertiers großzügig mit 70% Ethanol. Ziehen Sie die Bauchhaut mit einer sterilisierten Pinzette nach oben und schneiden Sie mit der anderen Hand mit einer sterilisierten chirurgischen Schere die Haut vom Bauch ab. Ziehen Sie mit einer zweiten sterilisierten Pinzette und Schere die Bauchfaszie nach oben und schneiden Sie sie, während Sie die Gebärmutter vorsichtig vermeiden.Halten Sie mit einer dritten sterilisierten Pinzette und Schere die Gebärmutterhörner fest und schneiden Sie sie aus der Beckenhöhle heraus. Legen Sie die präparierten Gebärmutterhörner in eine sterile 60 Millimeter große Petrischale, die mit lebovitz-Kulturmedium auf neuronaler Basis gefüllt ist, das mit Aminosäuren, Vitaminen und anorganischen Salzen ergänzt ist. In der sterilen Biosicherheitswerkbank verwenden Sie zwei Paar feine Pinzetten, um die Embryonen aus der Plazenta zu sezieren und die Köpfe durch Enthauptung zu isolieren.Schneiden Sie die Spitze einer sterilen Drei-Milliliter-Transferpipette aus Kunststoff ab und verwenden Sie diese, um die Köpfe abzusaugen und sie in eine neue sterile 60-Millimeter-Petrischale zu übertragen, die mit dem gleichen Nahrungsergänzungsmittel auf neuronaler Basis gefüllt ist, um das Blut auszuwaschen. Übertragen Sie sie erneut in eine dritte Petrischale, die mit erstarrtem schwarzem Wachs überzogen und mit neuronalem Nährmedium gefüllt ist. Legen Sie die 16 Millimeter große Petrischale, die mit schwarzem Wachs überzogen ist und die enthaupteten Köpfe in einem neuronalen Nährmedium enthält, unter das Präpariermikroskop in der Biosicherheitswerkbank.Verwenden Sie eine feine Pinzette, die Sie in der linken Hand halten, um den Kopf mit dem rostralen Teil nach rechts zu stabilisieren. Verwenden Sie dann den Nanoinjektor in der rechten Hand, um ein bis zwei Mikroliter der mit Farbstoff dotierten Plasmidlösung in den rechten Seitenventrikel zu injizieren. Elektroporieren Sie das injizierte Gehirn, indem Sie den Kopf zwischen die Elektroden legen, wobei die negative Elektrode dorsal und parallel zum Kopf und die positive Elektrode zur ventralen Seite des Kopfes positioniert ist, um das MGE zu erreichen.Sobald die Elektroden gut positioniert sind, geben Sie vier Quadratimpulse von 40 Volt für 50 Millisekunden in Intervallen von 500 Millisekunden ab. Während Sie noch in der sterilen Umgebung der Biosicherheitswerkbank arbeiten, beginnen Sie, das Gehirn aus dem Schädel zu präparieren. Stabilisieren Sie zuerst den Kopf auf der schwarzen Wachsschicht, indem Sie eine Nadel in jedes Auge einführen, während Sie das Gehirn vorsichtig vermeiden.Verwende dann eine feine Pinzette, um die linke Seite des Halses zu halten, und eine zweite feine Pinzette, um die Haut vom Schädel von hinten nach vorne zu reißen. Während du den Kopf mit einer Pinzette in der einen Hand seitlich hältst, schneidest du mit einer anderen Pinzette in der anderen Hand vorsichtig den Schädel auf Höhe des Hirnstamms ab und ziehst den Schädel nach oben. Schneiden Sie mit jeder Pinzette den Schädel in der Sagittalebene nach vorne und schneiden Sie dann seitlich ein, um die Schädelfragmente zu befreien.Heben Sie dann den Hirnstamm an und schneiden Sie vorsichtig die Hirnhäute und Hirnnerven durch, bis das Gehirn vollständig aus dem Schädel herausragt. Füllen Sie eine 35-Millimeter-Petrischale mit geschmolzener Agaroselösung, die bei 42 Grad Celsius flüssig gehalten wird. Übertragen Sie dann schnell ein elektroporiertes Gehirn mit der zuvor geschnittenen Transferpipette in die mit Agarose gefüllte Schale.Rühren Sie die Agarose mit einem Metallstab um, um das Gehirn in der Mitte der Vertiefung zu halten, um ein Absinken zu verhindern, und positionieren Sie das Gehirn in einer rostralen Schwanzebene parallel zur Schale. Hören Sie auf zu rühren, wenn die Agarose anfängt, sich zu verfestigen, um Schäden am Gehirn zu vermeiden. Während Sie darauf warten, dass sich die Agarose-Einbettung verfestigt, übertragen Sie 750 Mikroliter N2-supplementiertes Kulturmedium in jede Vertiefung der Sechs-Well-Kulturplatte, entsprechend der Anzahl der zu verarbeitenden Gehirne.Und platzieren Sie in jeder mit Medium gefüllten Vertiefung einen 30 Millimeter Membraneinsatz. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge die Agarose, die das Gehirn umgibt, zu einem rechteckigen Block auf, der einen Rand von ein bis zwei Millimetern um das Gehirn herum lässt. Stellen Sie sicher, dass der rostrale Teil des Gehirns senkrecht zur vorderen Grenze des Blocks steht, um die Orientierung für die nachfolgenden Schnittschritte zu erleichtern.Kleben Sie den Agaroseblock mit der rostralen Kante nach unten und der ventralen Kante zum Benutzer hin auf die Vibratome-Plattform. Schneiden Sie das Gehirn in koronale Schnitte, um 250 Mikrometer dicke Schnitte bei vier Grad Celsius zu erhalten. Entnehmen Sie mit sterilisierten Spateln zwei bis drei Abschnitte, die das MGE enthalten, und platzieren Sie alle Gehirnschnitte eines Tieres auf einem einzigen 30-Millimeter-Membraneinsatz.Dabei werden Überlappungen zwischen den Abschnitten sorgfältig vermieden. Stellen Sie die Kulturplatte für 48 oder 72 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 60 % Luftfeuchtigkeit und fünf Prozent CO2 in einen belüfteten sterilen Inkubator. Nach der gewünschten Inkubationszeit werden die interessierenden Abschnitte auf ein Deckglas mit acht Kammern übertragen, das mit drei bis fünf Mikrolitern Nährmedium gefüllt ist.Legen Sie das Deckglas in eine Klimakammer und verbinden Sie es mit einer konfokalen invertierten rotierenden Scheibe, die mit einer computergestützten Erfassungssoftware ausgestattet ist, um die Zeitraffer-Bildgebung einzurichten. Interneurone, die an E 13.5 mit einem experimentellen Plasmid, das die TD-Tomatenkassette exprimiert, und SH-RNA, die auf ein Gen von Interesse abzielt, elektroporiert wurden, sind in tangentialer Migration in einem organotypischen Hirnschnitt zu sehen, der nach 48-stündiger Kultur aus einem DLX5 6Cre RCEE GFP-Mausembryo gewonnen wurde. Die Interneurone wurden acht Stunden lang mit Hilfe von Live-Bildgebung im Zeitraffer visualisiert.In diesem Beispiel ist das gleiche elektroporierte Interneuron im Prozess der Nukleokinese zu sehen. Während sie tangential in der Rinde parallel zur Schäloberfläche wandern. Das Neuron zeigt im Zuge der Nukleokinese zunächst einen länglichen Zellkörper.Sowie ein Trailing-Prozess und ein verzweigter Lead-Prozess. Nach drei Stunden Live-Bildgebung ist die Nukleokinese abgeschlossen. Der nachlaufende Prozess hat sich zurückgezogen und der führende Prozess streckt zwei lange Äste aus.Nach fünf Stunden und 30 Minuten hat sich einer der führenden Prozesszweige zurückgezogen und der Körper der Neuronenzelle hat sich um etwa 10 Mikrometer nach vorne bewegt. Schließlich, nach acht Stunden Bildgebung, hat die Migration pausiert, das Neuron hat seinen Leitprozess wieder verlängert und es ist ein Nachlaufprozess aufgetreten. Aber der Kern hat sich noch nicht weiterentwickelt.Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, zu jeder möglichen Zeit eine sterile Umgebung zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie MG-Elektroporationen gefolgt von Explantaten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Aufklärung der dynamischen Zytoskelettprozesse zu beantworten, die während der neuronalen Migration auf ultrazellulärer Ebene ablaufen.

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Wir präsentieren eine Methode zur organotypischen Schnitten der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für die Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung von peripheren Nerven Auswuchs vorzubereiten.

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Eine Methode zur organotypischen Slices aus dem E12.5 murinen embryonalen Mittelhirns zu erzeugen, ist beschrieben. Die organotypischen Kulturen verwendet, um das Verhalten von dopaminergen Neuronen oder anderen ventralen Mittelhirn Nervenzellen zu beobachten.

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Um eine rasche Beurteilung der Funktion von Genen in der Entwicklung der Hirnrinde führen, beschreiben wir Verfahren, die...

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Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das ein Werkzeug zur Untersuchung der Regulationsmechanismen bestimmter Gene während der Hippocampus-Entwicklung bietet. Der Einsatz von Ex-utero-Elektroporation und organotypischer Schnittkultur ermöglicht die Hoch- und Herunterregulierung der Expression von Genen von Interesse in einzelnen Zellen und die Verfolgung ihres Schicksals während der Entwicklung.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Lernen Sie die Ex-Utero-Elektroporation und organotypische Schnittkulturen embryonaler Mäusegehirne zur Live-Aufnahme der Migration GABAerger Interneuronen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Untersuchung genetischer Einflüsse auf die neuronale Entwicklung und neurodevelopmentale Störungen.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen (Video) | JoVE Journal

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

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