Name: Dreidimensionale organotypischen Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Lernen Sie die Herstellung dreidimensionaler organotypischer Kulturen des murinen Gleichgewichts- und Hörorgans. Diese Methode ermöglicht mechanische Stimulation und virale Gentransfer zur Untersuchung der Innenohrentwicklung.

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Wir danken Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi und A. Petelski für ihre Beiträge an die ursprüngliche Forschung, auf der dieses Protokoll basiert. Wir danken auch Lamas J. und W. Makmura für technische Hilfe und Tierhaltung. Wir erkennen NIDCD Ausbildung Grant T32 DC009975 NIDCD gewähren R01DC015530, therapeutische Entwicklungsfonds Robertson und Caruso Family Foundation für die Finanzierung. Schließlich erkennen wir Unterstützung vom Howard Hughes Medical Institute, von denen Dr. Hudspeth ein Ermittler ist.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Animal Care und Nutzung Ausschüsse der Rockefeller University und der University of Southern California zugelassen.
1. (optional) Vorbereitung des Kollagens ich Lösung von Mouse-tail sehnen
Hinweis: Kollagen ich Lösungen sind im Handel erhältlich. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für Gel-Vorbereitung.
<ol><li>Einschläfern Sie 5-10 junger Erwachsener (3-5 Wochen alt) Mäusen Wildtyp-Stamm mit Kohlendioxid gemäß dem Protokoll genehmigt von den relevanten institutionellen Animal Care und Use Committee16. Sammeln Sie die Schwänzen und Desinfizieren sie durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol bei einem Mindestaufenthalt von 4 h bei Raumtemperatur. Hinweis: Für mehr als 48 h Inkubation sollte vermieden werden, da zu übermäßigem Gewebe Dehydrierung führt und die Sehne-Extraktion behindert.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haut jeden Schwanz durch die Einführung eines längs-Schnitt mit einem Skalpellklinge und zurückziehen die ganze Haut mit einer Pinzette. Übertragen Sie die dunkelhäutigen Schwänzen auf einer 100-mm-Petrischale gefüllt mit sauberen 70 % Ethanol und in 10-mm-Segmente schneiden. Hinweis: Entsorgen Sie die dünnsten Teile des Tails, die schwierig zu handhaben sind.</li>
	<li>Mit Pinzette, sichern Sie jedes Segment der Rute auf den Boden der Petrischale zu und verwenden Sie ein zweites Paar feine Pinzette, um die Sehnen vom Heck eine zu einem Zeitpunkt zu extrahieren. Einzelne Sehne Fasern sollten mit minimalem Widerstand entstehen. Hinweis: Alte, Matte #5 Pinzetten eignen sich gut für diesen Schritt.</li>
	<li>100 mL einer 0,1 % Lösung (nach Volumen) von Essigsäure in sterilen, Molekulare-Grade Wasser bereiten und eine sterile Petrischale 100 mm 10 mL der Lösung hinzufügen. Übertragen Sie die Sehnen in der Petrischale und verlassen Sie ich für 1 h bei Raumtemperatur zu denaturieren die Kollagen zu.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile Schere Skalpell oder Iridektomie mit stumpfen, gebogene Spitzen, um die Sehne in 1 – 2 mm Fragmente Blatt vor den Mund. Übertragen Sie die Hackfleisch / sehnen, ein steriles 50-mL-Röhrchen und fügen Sie 0,1 % Essigsäure um die Lautstärke auf 50 mL zu bringen. Hinweis: Verwenden Sie vier oder fünf Schwänzen für je 50 mL Säure, ein Kollagen zu erreichen ich Konzentration von 2,0-2,5 mg/mL.</li>
	<li>Kühlen Sie das Kollagen ich Lösung bei 4 ° C für mindestens 48 h, komplettes Protein-Denaturierung zu erleichtern. Wirbel mit einer Tischplatte Vortex soll die maximale Geschwindigkeit für 1 min zweimal am Tag.</li>
	<li>Die Proteinkonzentration der Lösung mit der Bicinchoninic Säure-Test zu messen, stellen Sie das Kollagen ich Konzentration auf 2,0-2,5 mg/mL durch Zugabe von 0,1 % ige Lösung von Essigsäure und Store bei 4 ° C. Hinweis: Kollagen ich Lösung kann ein bis zwei Jahre lang aufbewahrt werden.</li>
	<li>(Optional) Das Kollagen Zentrifuge ich Lösung bei 2.000 x g für 1 h bei 4 ° C und die Nutzung der transluzente Top Bruchteil (ca. die Hälfte des Volumens), optisch klare Kollagen zu erreichen in Abschnitt 4 Gele.</li>
</ol>2. Präparation des auditorischen und vestibulären Organe
<ol><li>Einschläfern Sie Schwangere Mäusen Belastung mit Kohlendioxid gemäß dem Protokoll von den relevanten institutionellen Animal Care und Use Committee16genehmigt. Extrahieren und die Embryonen zu enthaupten. Hinweis: Lfng-CreERT2/tdTomato Mäuse können verwendet werden, ermöglichen dauerhafte Kennzeichnung von Stützzellen nach Exposition gegenüber 4-Hydroxytamoxifen17.</li>
	<li>Sterilisieren Sie alle Arbeitsflächen und Dissektion Instrumente, darunter zwei Paare von #5 Zangen und ein Haar Messer18, mit 70 % igem Ethanol reinigt.</li>
	<li>Jeder Kopf in zwei Hälften durch die Einführung eines längs-Schnitt mit einem sterilen Skalpellklinge oder mithilfe von zwei Paaren von #5 Pinzetten aufgeteilt. Extrahieren Sie die Temporal Knochen, die die inneren Ohren19enthalten, und legen Sie sie in 15 mL eiskaltes Hank ausgeglichene Salzlösung (HBSS) in einer Petrischale 60 mm. Halten Sie die Schüssel auf dem Eis. Hinweis: Embryonen bei einer Reihe von Phasen von E13.5 bis E18.5 sind erfolgreich benutzt worden.</li>
	<li>(Optional) Waschen Sie die inneren Ohren durch Schütteln sie vorsichtig in ein 50 mL konische Röhrchen mit 30 mL eiskaltes HBSS und ersetzen die HBSS drei-oder viermal. Halten Sie das Rohr auf dem Eis. Hinweis: Dieser Schritt begrenzt mögliche Kontamination der Gewebekultur und bringt schnell die Temperatur um 4 ° C, die Erniedrigung und Zelle Absterben von Gewebe verhindert.</li>
	<li>Mit zwei Paaren von feinen #5 Pinzetten, trennen Sie die inneren Ohren aus dem Felsenbein und übertragen Sie die Ohren, drei oder vier in einer Zeit, in eine 60 mm Petrischale gefüllt mit eiskalten HBSS.</li>
	<li>Die vestibulären Sinnesorgane zu sezieren.<ol>
<li>Orientieren Sie die Ohren medialen Seite oben zu und suchen Sie die Utricle. Entfernen Sie mit zwei Paaren von #5 Pinzetten den Knorpel umgibt die vestibulären Organe. Trennen Sie vorsichtig Nervus Vestibular, die Verbindung zwischen der Utricle und Gleichgewichtsorgan und Bogengängen, wie in Abbildung 1dargestellt. Ziehen Sie vorsichtig die Utricle und die beigefügten Glasphiolen von superior und horizontale Bogengängen aus dem Ohr. Hinweis: Diese Methode kann auf inneren Ohren Stufen E16.5 - E18.5 verwendet werden. Bewahren Sie die Knorpel-Fragmente für Abschnitt 3 unten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Cochlea zu sezieren.<ol>
<li>Die knorpelige Gewebe um das Hörorgan mit zwei Paaren von #5 Zange zu entfernen. Trennen Sie vorsichtig die Verbindung zwischen der Cochlea-Basis und das Gleichgewichtsorgan, wie in Abbildung 1dargestellt. Hinweis: Für Stufen E13.5 - E14.5, den Knorpel vor Dissektion erweichen durch die Behandlung der Inneres Ohren ich mit 0,25 % Kollagenase Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Bewahren Sie die Knorpel-Fragmente für Abschnitt 3 unten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit einem 200-µL-Pipettieren mit einer breiten beschichteten Spitze ausgestattet, der Utricles und Cochleae auf einer 30-mm-Petrischale gefüllt mit Wachstumsmedium bestehend aus DMEM/F12 ergänzt mit 33 mM Dglucose, Natriumbicarbonat 19 mM, 15 mM 4(2hydroxyethyl) - übertragen 1piperazineethanesulfonic Säure (HEPES), 1 mM Glutamin 1 mM Nicotinamid, 20 mg/L epidermalen Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 20 mg/L, 10 mg/L Insulin, 5,5 mg/L Transferrin und 5 µg/L Natriumselenit.</li>
	<li>Pflegen Sie die Utricle Vorbereitungen für bis zu 3 h bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % Kohlendioxid vergast erlauben Heilung der Schnitte in das Epithel, die während der Präparation eingeführt. Cochlea-Vorbereitungen sollten auf das Kollagen Gel 10 min nach der Dissektion übertragen werden. Hinweis: Weil die Zerlegung in eiskalten HBSS durchgeführt wird, gibt es keine Notwendigkeit, das Wachstumsmedium auf 37 ° c Vorwärmen</li>
</ol>3. (optional) passen Sie Kollagen Gel ich Steifigkeit durch Zugabe von unterschiedlichen Konzentrationen von Chondrozyten
Hinweis: Die Methode für die Knorpelzelltransplantation Isolierung wurde von Gosset Et Al. modifiziert. 20
<ol><li>Bereiten Sie eine 1 % ige Lösung von Kollagenase ich in sterilen 1 x PBS und Speicher 100-200 µL Aliquots bei-80 ° C. Auf dem Eis bei Bedarf Auftauen, mehrere Gefrier-tau-Zyklen zu vermeiden.</li>
	<li>Die Zerlegung der auditorischen und vestibulären Organe von 10-12 Ohren übrig Nutzung feine Pinzette, die Stücke des Knorpels zu sammeln. Separate Bindegewebe und Innenohr Gewebe aus dem Knorpel. Übertragen des Knorpels zu einer 30-mm-Petrischale und fügen Sie 300 µL der sterilen Nährmedium.</li>
	<li>Verwenden Sie ein steriles Skalpell Klinge oder Iridektomie Schere mit stumpfen gebogenen Spitzen um zu hacken das Gewebe um Knorpel Stücke ca. 0,5 mm in der Länge zu erreichen.</li>
	<li>Hinzufügen von Kollagenase ich auf das Medium mit Knorpel, eine abschließende Enzym-Konzentration von 0,25 % zu erreichen. Übertragen Sie die Schale in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid vergast. Pipettieren kräftig mit einem 1.000 µL pipettieren alle 20 min bis Stücke des Knorpels distanzieren und unterscheiden sich nicht mehr in der Lösung dann inkubieren eine zusätzliche 20 min. Hinweis: Im Falle der Utricle Vorbereitungen kann Knorpelzelltransplantation Isolierung während Schritt 2,9 durchgeführt werden; Es dauert ca. 2 h (3-4 pipettieren Runden).</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 mL konische Röhrchen zu und stellen Sie die Lautstärke auf 10 mL mit sterilen 1 X PBS. Zentrifuge bei 800 X g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL sterile 1 X PBS. Bei 800 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den überstand zu entfernen. Hinweis: Es ist entscheidend für die Zellen zweimal waschen; Alle übrigen Kollagenase wird ich das Kollagen, die, das ich Gel, verdauen.</li>
	<li>Mit einem 200-µL-pipettieren, hinzu kommen 100 µL Kulturmedium der Zelle Pellet und pipettieren sanft zu Aufschwemmen. Zählen der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer und auf Eis vor dem Gebrauch zu halten.</li>
	<li>Chondrozyten hinzufügen um Gel Steifigkeit zu erhöhen, die neutralisierte Kollagen ich gel-Lösung (Abschnitt 1) und schnell mischen, die Zellen im ganzen das Gel vor Erstarrung zu verteilen. Hinweis: Der Elastizitätsmodul des Kollagen gel ich (ein Maß für die Steifigkeit), steigt linear mit der Anzahl der Chondrozyten hinzugefügt11. Das Verhältnis wird beschrieben durch die experimentell ermittelten lineare Funktion E = 206· NC + 15, in denen E der Elastizitätsmodul in Pascals und Nc ist, ist die Zahl der Chondrozyten in Millionenhöhe. Ein detailliertes Protokoll für Gel entnehmen Steifigkeit Maße Sie bitte den ursprünglichen Artikel11.</li>
</ol>4. Legen Sie die vestibuläre oder auditive Sinnesorgan in einem Kollagen, die ich Gel
<ol><li>In ein steriles Röhrchen 1,5 mL, bereiten Sie Kollagen ich Polymerisation Lösung durch Mischen von 160 µL 10 X PBS mit Phenol rot pH-Indikator, 133 µL 0,34 M Natronlauge, 70 µL von 0,9 M Natriumbicarbonat und 40 µL 1 M HEPES. Halten Sie das Rohr auf dem Eis. Hinweis: Dieses Rezept ist die Polymerisation Lösung 2 mL des Kollagens vorbereiten ich gel, aber kann je nach Bedarf skaliert werden musste.</li>
	<li>Mix 100 µL der Polymerisation Lösung und 400 µL des Kollagens ich Lösung auf Eis durch sanft nach oben und unten in einem gekühlten 1,5 mL Röhrchen pipettieren. Um Gel Steifigkeit zu erhöhen, fügen Sie 50 µL der Chondrozyten-haltigem Wachstumsmedium hinzu und mischen Sie, wie in Abschnitt 3 beschrieben.</li>
	<li>500 µL des neutralisierten Kollagen zu übertragen ich Lösung auf einer gekühlten 30-mm-Petrischale mit einem 10-mm-Glasboden-Einsatz oder einem Brunnen der vier-Well-Platte. Hinweis: Es ist wichtig, alle Reagenzien auf Eis, um zu verhindern, dass schnelle und ungleichmäßige Polymerisation des Kollagens zu halten ich.</li>
	<li>Schnelle Übertragung von Cochleae oder Utricles auf die neutralisierte Kollagen ich Lösung und stellen Sie die Organe auf ihre gewünschte Position mit einer sterilen Haar Messer18 oder ein paar feine Pinzette. Hinweis: Kollagen ich Polymerisation wird nach 1-2 min spürbar, da die Lösung trüb wird.</li>
	<li>Nachdem die Lösung, um das Gewebe polymerisiert ist, platzieren Sie die Petrischale oder vier-Well-Platte für 20 min bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator vergast mit 5 % Kohlendioxid um vollständige Polymerisation zu gewährleisten.</li>
	<li>Fügen Sie 3 mL Wachstumsmedium ergänzt mit 0,5 % fetalen bovine Serum (FBS) pro Petrischale oder 500 µL des gleichen Mediums pro Bohrloch eine vier-Well-Platte. Pflegen Sie die Kultur bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % Kohlendioxid vergast. Auf Wunsch ergänzen Sie das Wachstumsmedium mit 10 µM 5-Ethynyl-winkel2-Deoxyuridine (EdU), wuchernde Zellen zu kennzeichnen. Hinweis: Höhere Konzentrationen der FBS können bei Bedarf verwendet werden.</li>
</ol>(5) virale Injektionen in dreidimensionale Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane
<ol><li>Tauen Sie das gewünschte Virus auf Eis und mischen mit Trypan blau-Lösung in einem 0,5 mL konische Rohr, eine endgültige Farbstoff-Konzentration von 0,05 % zu erreichen. Verwenden Sie 10-20 X Farbstoff um zu erheblichen Verdünnung des Virus zu vermeiden. Halten Sie auf dem Eis. Hinweis: Adenovirus Serotyp 5 funktioniert am besten für Stützzellen im Utricle19, zu infizieren, während Adeno-assoziierten Virus Anc80 beide Haarzellen infizieren kann und Stützzellen in der Utricle und Cochlea-21.</li>
	<li>Brechen Sie ein Glas Nadelspitze vorbereitet auf einer Mikropipette Abzieher mit sauberen feinen Pinzette während Sie mit der höchsten Vergrößerung ein Fernglas Mikroskop sezieren beobachten. Hinweis: Es ist wichtig, um die Einstellungen auf der Nadel Abzieher zu optimieren. Nadeln mit 9 - 12 mm Schäfte und 20 - 30 µm Öffnungen am besten funktionieren.</li>
	<li>Entfernen Sie eine Sinnesorgan Kultur aus dem Inkubator. Legen Sie die Nadel auf die Microinjector und füllen Sie ihn mit 2-3 µL Farbstoff und Virus-Gemisch. Vorantreiben Sie die Nadel in das Sinnesorgan, während Sie unter dem Binokular Mikroskop sezieren beobachten.</li>
	<li>Fahren Sie vorsichtig die Nadelspitze durch mesenchymale und epithelialen Schichten des Daches einer dreidimensionalen utricular Kultur. Die virale Mischung zu injizieren, bis die Hohlräume der Utricle und Glasphiolen mit blauen Farbstoff füllen. Hinweis: Weil sie leichten Zugang zu Sinnesorgane ermöglicht, ist ein 10-mm-Glasboden-Petrischale optimal für die Injektionen.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % Kohlendioxid vergast. Hinweis: Wenn grünes oder rotes fluoreszierendes Protein in der viralen Konstrukt verwendet wird, ist die Fluoreszenz sichtbar 24 h nach virale Transduktion.</li>
</ol>

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<li>Tada, M., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%3A+using+collective+cell+migration+and+cell+intercalation+to+shape+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Camb+Engl%22%5BJournal%5D)">Convergent extension: using collective cell migration and cell intercalation to shape embryos.</a> Dev Camb Engl. 139 (21), 3897-3904 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die molekularen Signale, die vermitteln Wachstum und Differenzierung im Innenohr während der Entwicklung wurden studiert ausgiebig5,6,7,8,9,10. Aus der utricular Modellsystem erlangte Beweismittel deuten jedoch darauf hin, dass mechanische Hinweise, spürte durch Zelle Kreuzungen und die Aktivierung von Hippo-Signalisierung, a...

Die Studie der meisten Aspekte der Säugetier-Organentwicklung wurde durch in-vitro- Systeme erleichtert. Zwei Hauptmethoden werden jetzt verwendet, für die Kultur der vestibulären Sinnesorgane: freischwebende1 und anhaftende2 Vorbereitungen. Beide Methoden erlauben die Untersuchung der Haarzelle Schwachstellen3 und Regeneration1,4 in Vitro. Darüber hinaus haben die entwicklungspolitischen Rollen der Kerbe5,6, Wnt7,8und epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)9,10 Signalisierung Kaskaden im Innenohr etabliert, unter anderem durch den Einsatz von in-vitro- Kulturen von sensorischen Epithelien. Jedoch sind Zellwachstum und Differenzierung, nicht nur durch die Signalisierung von Morphogens, sondern auch durch physikalische und mechanische Signale z. B. interzellulären Kontakte, der Steifigkeit der extrazellulären Matrix und mechanische Dehnung oder Verengung gesteuert. Die Rolle solcher mechanischer Reize ist eine Herausforderung, in den Entwicklungsländern Innenohr in Vivozu untersuchen. Bestehenden freischwebend und anhaftende Kulturmethoden eignen sich darüber hinaus nicht für solche Studien in Vitro. Hier beschreiben wir eine Methode für die dreidimensionale organotypischen Kultur in Kollagen ich Gele unterschiedlicher Steifigkeit. Diese Methode weitgehend bewahrt die in Vivo -Architektur der vestibulären und Cochlea-Sinnesorgane und ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der mechanischen Kraft auf Wachstum und Differenzierung11.
Da mechanische Reize bekannt sind, um nachgeschaltete molekularen Ereignisse, z. B. das Nilpferd Weg12,13,14,15, Signalisierung zu aktivieren ist es wichtig, mechanische Stimulation kombinieren zu können mit biochemischen und genetischen Manipulationen. Die hier beschriebene Methode Kultur gestattet Virus-vermittelten gen Lieferung und kann daher verwendet werden, um mechanische und molekularen Signalisierung im Innenohr Entwicklung11zu studieren.

<table><tbody><tr><td>#10 Chirurgische Klingen</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinzette</td><td>Dumont</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>Sigma</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>250 uL Pipettenspitzen mit großer Öffnung</td><td>USA Scientific</td><td>1011-8406</td><td></td></tr><tr><td>30 mm Petrischale mit Glasboden</td><td>Matsunami Glass USA Corporation</td><td>D35-14-1.5-U</td><td></td></tr><tr><td>4 Vertiefung Platte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxytamoxifen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm Petrischale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>123TS1</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP, Hühner-IgY-Fraktion</td><td>Invitrogen</td><td>A10262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myo7A</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antikörper (Y-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninsäure Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase I</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor</td><td>Sigma</td><td>F5392</td><td></td></tr><tr><td>Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer&nbsp;</td><td>Daigger</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>Iridektomie-Schere&nbsp;</td><td>Zepf Medizinische Instrumente</td><td>08-1201-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Narishige</td><td>IM-6</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrot pH-Indikator&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4633&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reines Ethanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs&nbsp;</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RFP Antikörper</td><td>ChromoTek</td><td>&nbsp; 5F8</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Tischwirbel&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blau</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

dreidimensionale organotypischen kulturen der vestibulären und akustische sinnesorgane

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Die Sinnesorgane des Innenohrs sind eine Herausforderung, um bei Säugetieren wegen ihrer Unzugänglichkeit experimentelle Manipulation und optischen Beobachtung zu studieren. Darüber hinaus obwohl bestehende Kulturtechniken biochemische Störungen können, bieten diese Methoden keine Mittel zur Untersuchung der Auswirkungen der mechanischen Kraft und Gewebe Steifigkeit während der Entwicklung der Sinnesorgane Innenohr. Hier beschreiben wir eine Methode zur dreidimensionalen organotypischen Kultur der intakten murinen Utricle und Cochlea, die diese Grenzen überwindet. Die Technik für die Anpassung der eine dreidimensionale Matrix Steifigkeit, die hier beschriebenen ermöglicht Manipulation die elastische Kraft gegen Gewebewachstum. Diese Methode kann daher zur Untersuchung der Rolle von mechanischen Kräfte während der Innenohr-Entwicklung. Darüber hinaus erlauben die Kulturen Virus-vermittelten gen Lieferung, die für Gewinn und Verlust-of-Function-Experimente genutzt werden kann. Diese Kultur-Methode bewahrt angeborene Haarzellen und Unterstützung von Zellen und dient als eine potentiell überlegene Alternative zu traditionellen zweidimensionalen Kultur der vestibulären und akustische Sinnesorgane.

Vestibuläre und akustische Sinnesorgane aus embryonalen Ohren kultiviert in 40-Pa Kollagen Gele imitiert geringe Steifigkeit embryonalen Bedingungen11, relativ normale dreidimensionale Strukturen (Abbildung 1) behalten und pflegen Haarzellen und Stützzellen (Abbildung 2 und Abbildung 3). Obwohl Zelldichte zu unterstützen um über 30 % verringert (Studenten t -Test: n =...

Dreidimensionale organotypischen Kulturen der murinen Utricle und Cochlea in optisch klar Kollagen ich bewahren angeborene Gewebe Morphologie Gele ermöglichen für mechanische Stimulation durch Anpassung der Matrix Steifigkeit und Virus-vermittelten gen Lieferung zu ermöglichen.

Dreidimensionale organotypischen Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dreidimensionale organotypische Kulturen der murinen, vestibulären und auditiven Sinnesorgane zu etablieren. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen im Bereich der Innenohrforschung zu beantworten, wie z.B. welche Rolle mechanische Kraft und Gewebesteifigkeit bei der Entwicklung der Sinnesorgane des Innenohrs spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die angeborene Architektur der vestibulären Cochlea weitgehend bewahrt und es uns ermöglicht, sowohl die molekulare als auch die mechanische Signalübertragung während der Entwicklung des Innenohrs zu untersuchen.Dr. Hudspeth und ich hatten die Idee zu dieser Methode, als wir erkannten, dass dreidimensionale Kulturen morphysiologische Bedingungen bieten können, um das Wachstum vestibulärer Organe in vitro zu untersuchen. Verwenden Sie zunächst 70%iges Ethanol, um den Arbeitsbereich und alle notwendigen Sezierinstrumente, einschließlich der fünften Pinzette und eines Haarmessers, zu reinigen und zu desinfizieren. Machen Sie dann mit einer sterilen Skalpellklinge einen Längsschnitt, teilen Sie den Kopf der Maus in zwei Hälften und extrahieren Sie die Schläfenknochen.15 Milliliter HBSS-Puffer in eine 60-Millimeter-Petrischale auf Eis geben. Verwenden Sie als Nächstes zwei Paar feine Zangen mit der Nummer fünf, um die Innenohren von den Schläfenknochen zu isolieren. Übertragen Sie dann drei bis vier Ohren gleichzeitig in eine 60-Millimeter-Petrischale, die eiskalten HBSS-Puffer enthält.Richten Sie anschließend die Ohren mit der medialen Seite nach oben aus, um den Utriculus zu lokalisieren. Verwende die beiden Paare der Zange Nummer fünf, um den Knorpel zu entfernen, der die vestibulären Organe umgibt. Als nächstes durchtrennen Sie den Nervus vestibularis, die Verbindung zwischen Utricula und Sacculus sowie die Bogengänge, um den Utriculus und die daran befestigten Ampullen von den Ohren zu befreien.Schneiden Sie bei Bedarf überschüssige halbkreisförmige Kanäle ab. Alternativ können Sie die beiden Paare der Zange Nummer fünf verwenden, um das Knorpelgewebe zu entfernen, das das Hörorgan umgibt. Isolieren Sie dann die Cochlea.Verwenden Sie anschließend eine 200-Mikroliter-Pipette mit einer breiten, antihaftbeschichteten Spitze, um die Cochlea und die Utrikel in eine 30-Millimeter-Petrischale zu übertragen, die mit dem DMEM/F12-basierten Wachstumsmedium gefüllt ist. Dann werden die Cochlea- und die Utrikelpräparate in einen Gewebekultur-Inkubator gegeben, der mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius begast wird. Damit sollen Organkulturen mit geschlossenen Lumen erreicht werden.Bereiten Sie 100 Mikroliter der Kollagen-Ein-Polymerisationslösung in einem sterilen 1,5-Milliliter-Röhrchen vor. Lassen Sie die Tube dann auf Eis. Entnehmen Sie anschließend die Cochlea- und Utrikelpräparate aus dem Gewebekultur-Inkubator.Bereiten Sie die neutralisierte Kollagen-Ein-Lösung vor. Geben Sie dazu 400 Mikroliter Kollagen eins in ein gekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 100 Mikrolitern Polymerisationslösung, indem Sie mehrmals auf Eis pipettieren. Übertragen Sie 500 Mikroliter der neutralisierten Kollagen-Ein-Lösung in eine gekühlte 30-Millimeter-Petrischale mit einem 10-Millimeter-Glasbodeneinsatz.Übertragen Sie sofort die Cochlea oder die Utrikel mit einer 200-Mikroliter-Pipette und einer breiten, antihaftbeschichteten Spitze in die neutralisierte Kollagen-Ein-Lösung. Verwenden Sie ein steriles Haarmesser oder eine feine Pinzette, um die Organe unter einem binokularen Präpariermikroskop in die gewünschte Position zu bringen. Um eine vollständige Polymerisation zu gewährleisten, inkubieren Sie die Petrischale 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Nach 20 Minuten drei Milliliter Wachstumsmedium hinzufügen, ergänzt mit 0,5 % fötalem Rinderserum in jede Petrischale. Nachdem Sie das Wachstumsmedium hinzugefügt haben, inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius. Tauen Sie zuerst das Virus auf Eis auf.Mischen Sie dann die Virussuspension mit Trypanblau-Lösung in einem konischen 0,5-Milliliter-Röhrchen, um die endgültige Farbstoffkonzentration von 0,05 % einzustellenNach dem Mischen der Trypanblau-Lösung lassen Sie die Viruspartikel auf Eis. Verwenden Sie dann ein binokulares Präpariermikroskop, um das Brechen der Spitze der Glasnadel zu beobachten, die auf einem Mikropipettenabzieher mit sauberer, feiner Pinzette vorbereitet wurde. Entnehmen Sie zunächst die Kultur der Sinnesorgane aus dem Inkubator.Befestigen Sie die Nadel am Mikroinjektor. Füllen Sie die Nadel mit zwei bis drei Mikrolitern Farbstoff und Virusgemisch. Schauen Sie durch das binokulare Präpariermikroskop, während Sie die Nadel in das Sinnesorgan einführen.Führen Sie die Nadelspitze weiter durch die mesenchymalen und epithelialen Schichten des Daches einer dreidimensionalen utrikulären Kultur. Injizieren Sie das Virusgemisch so lange, bis sich die Hohlräume des Utriculus und der Ampullen mit dem blauen Farbstoff füllen. Inkubieren Sie dann die Organkultur in einem 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator, der mit 5 % Kohlendioxid begast wird.Dies sind die lichtmikroskopischen Bilder der Utrikel- und Cochlea-Kultur, die in das dreidimensionale Kollagen-One-Gel eingebettet sind. Der Utriculum und die Cochlea werden aus 17,5 bzw. 14,5 Tage alten Embryonen gewonnen und 48 Stunden lang kultiviert. Diese konfokalen mikroskopischen Bilder zeigen einen 18,5 Tage alten embryonalen Utrikel kurz vor und nach der Explantation im 40PA Kollagen One Gel.Nach drei Tagen in der Kultur sind fast 80% der Myo7A-positiven Haarzellen noch intakt. Die unterstützende Zelldichte nimmt nach drei Tagen in utrikulären Kulturen um über 30 % ab und die Zelldichte der Haare nimmt um 60 % ab. Diese konfokalen mikroskopischen Bilder zeigen eine embryonale, 14,5 Tage alte Cochlea kurz vor und nach der Explantation im 40PA Kollagen One Gel.Nach drei Tagen in Kultur sind Myo7A- und Sox2-positive innere und äußere Haarzellen morphologisch unterscheidbar und in etwa vier bis fünf Reihen organisiert. Hier zeigen die Bilder eine erfolgreiche Virusinfektion der Stützzellen an der Basis der Cochlea und in den utrikulären dreidimensionalen Kulturen, die aus 15,5 bzw. 17,5 Tagen Embryonen gewonnen wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intakte Sinnesorgane des Innenohrs seziert, dreidimensionale Kulturen von Utricula und Cochlea und Kollagen-Typ-1-Gel etabliert und virale Transfektionen in diesen dreidimensionalen Kulturen durchführt.Denken Sie daran, dass die Arbeit mit Viruspartikeln je nach Genfracht gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und die ordnungsgemäße Virusentsorgung, sollten immer praktiziert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Verfahren beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der murinen Corti-Organ mit oder ohne die Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Wir zeigen auch ein Verfahren zur Expression eines exogenen Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantat durch Elektroporation.

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

Ein einfaches Verfahren der Vibratom Schneiden des Corti-Organ, durch Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie folgt beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine verbesserte Erhaltung der feinen Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ, und somit ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Zelltypen.

Vibratom Sectioning für Enhanced Erhaltung der Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ

Dieses Video zeigt den Prozess der Isolierung von Spiralganglien-Explantaten aus dem Innenohr und deren Co-Kultivierung mit dem Corti-Organ auf einem Multielektroden-Array. Spiralganglien werden sorgfältig entnommen und in kleinere Gewebeschnitte oder Explantate geschnitten. Diese Explantate werden auf der aktiven Fläche des Multielektrodenarrays kultiviert, um das Wachstum des neuronalen Prozesses zu fördern.

Kultivierung von Neuronen-Explantaten von Maus-Spiralganglien auf Multielektroden-Arrays

Analyse der vestibulären Haarzellen Funktion wird durch ihre Lage tief innerhalb der schwierigste Teil des Schädels, der Felsenbein kompliziert. Die meisten funktionalen Haarzellen Studien haben akut isolierten Haarzellen verwendet. Hier beschreiben wir eine semi-intakten Herstellung von Maus vestibulären Epithel für elektrophysiologische und Zwei-Photonen-Mikroskopie Studien.

Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Kultivierung primärer Maus-Spiralganglien-Neuronenexplantate auf Multi-Elektroden-Arrays, um neuronale Reaktionsprofile zu untersuchen und Stimulationsparameter zu optimieren. Solche Studien zielen darauf ab, die Neuron-Elektroden-Grenzfläche von Cochlea-Implantaten zu verbessern, um das Gehör der Patienten sowie den Energieverbrauch des Geräts zu verbessern.

Spiralganglion Neuron Explantation Kultur und Elektrophysiologie auf Multi-Elektroden-Arrays

In dieser Studie stellen wir ein Echtzeit-Bildgebungsverfahren unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie vor, um Zellen zu beobachten, die sich durch Ex-vivo-Inkubation mit dem Cochlea-Epithel, das das Organ von Corti enthält, in Richtung geschädigtes Gewebe bewegen.

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti

Das Küken ist ein kostengünstiger, zugänglicher und weit verbreiteter Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien. Hier wird eine Reihe von Protokollen detailliert beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Regeneration des Vogelinnenohrs zugrunde liegen.

In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

Hier werden Methoden vorgestellt, die detaillierte Anweisungen zum Sezieren, Dissoziieren, Kultivieren und Patch-Clamp-Aufzeichnen von vestibulären Ganglion- und Spiralganglienneuronen des Innenohrs liefern.

Isolierung und Kultivierung von vestibulären und spiralförmigen Ganglien-Somata von neonatalen Nagetieren für Patch-Clamp-Aufnahmen

Das aktuelle Protokoll aktualisiert frühere Protokolle und enthält relativ einfache Ansätze für die Kultivierung hochwertiger Cochlea-Explantate. Dies ermöglicht eine zuverlässige Datenerfassung und hochauflösende Bildgebung in lebenden und fixierten Zellen. Dieses Protokoll unterstützt den anhaltenden Trend zur Untersuchung von Innenohrzellen.

Ganze neonatale Cochlea-Explantate als In-vitro-Modell

In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen von Mäusen vor. Zunächst wurde das Corti-Organ aus neonatalen (3-5 Tage alten) murinen Cochleae unter dem Mikroskop präpariert. Anschließend wurden die Zellen enzymatisch zu einer Einzelzellsuspension verdaut und nach mehreren Tagen in Kultur mittels Immunfluoreszenz identifiziert.

Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

In dieser Arbeit beschreiben wir eine Technik zur Entnahme menschlicher vestibulärer Endorgane unter physiologischen Bedingungen während der Labyrinthektomie und deren Analyse mittels Immunfärbung.

Entnahme vestibulärer Endorgane unter physiologischen Bedingungen während der Labyrinthektomie

Lernen Sie die Herstellung dreidimensionaler organotypischer Kulturen des murinen Gleichgewichts- und Hörorgans. Diese Methode ermöglicht mechanische Stimulation und virale Gentransfer zur Untersuchung der Innenohrentwicklung.

Dreidimensionale organotypischen Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane

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