Name: Integration von Imaging Durchflusszytometrie und transkriptomischen Profilierung zu veränderten Endocytic CD1d Handel bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Lernen Sie die Integration von Imaging-Durchflusszytometrie und transkriptomischer Profilierung zur Bewertung veränderter endozytischer CD1d-Trafficking-Funktionen in menschlichen dendritischen Zellen nach Schadstoffexposition.

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Die Autoren danken Robert Giulitto (Hoxworth Blutzentrale) für menschlichen Blutproben und Dr. Liang Niu für die Normalisierung der Genexpression liest. Wir danken auch Zuschüsse aus dem National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Zentrum für ökologische Genetik (CEG) Pilotprojekt (SH), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (AI115358) (s.h.), Universität Cincinnati University Research Council Award (SH) und Universität von Cincinnati College of Medizin Enhancement Grundfinanzierung (X. Z.).

Menschlichen Protokolle in dieser Studie wurden von der Institutional Review Board von der University of Cincinnati genehmigt und alle Methoden wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Verordnungen durchgeführt. Die Hoxworth Blutzentrale am Medical Center University of Cincinnati wurden Blutproben von gesunden Spendern entnommen.
1. transkriptomischen Profilierung der Schadstoff ausgesetzt menschliche Monocyte abgeleitet DCs
<ol><li>Insgesamt RNA-Extraktion von BaP-exponierten DCs<ol>
<li>Menschlichen DCs mit Zytokinen GM-CSF und IL-4 zu unterscheiden, und DCs, BaP für 4 Tage13setzen.</li>
		<li>BaP-exponierten DCs mit Durchflusszytometrie basierend auf der zum Ausdruck gebrachten Oberflächenmarker (Linie–HLA-DR+), von denen die meisten aus herkömmlichen DCs besteht zu sortieren (CD11c+CD1c+)13. In der Regel sortieren 10.000 DCs in Kulturmedium mit 10 % FBS, DCs bei 600 x g und 4 ° C für 6 min Zentrifugieren und umgehend entfernen den Überstand durch Absaugen mit einer 1 mL-Pipette-Spitze.</li>
		<li>Sobald der Überstand durch Absaugen entfernt wird, lösen Sie die Zelle Pellet durch Zugabe von 0,4 mL Lyse/Bindung Puffer aus dem RNA-Isolierung-Kit für die Lagerung in-80 ° C vor der RNA-Extraktion.</li>
		<li>Verwenden Sie das RNA-Isolierung-Kit mit dem total RNA-Extraktion-Protokoll, um total RNA-14zu extrahieren. Messen Sie die RNA-Integrität mit einem Bioanalyzer15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transkriptomischen Analyse der sortierten DCs (Abbildung 1A)<ol>
<li>Bereiten Sie die Bibliothek für RNA-Seq mit einer RNA-Bibliothek Vorbereitungssatz. Kurzum: fragment die isolierte Poly-A-RNA (~ 200 bp), reverse transkribieren die Fragmente der 1. Strang der cDNA, und führen Sie durch den zweiten Strang cDNA Synthese mit dUTP beschriftet.</li>
		<li>Verbinden Sie Doppelstrang DNA an den Adapter mit einer Haarnadelstruktur nach Perle Reinigung, Reparatur von Ende und dA-Tailing. Verbrauchsteuern Sie die Uracil-Rückstände in den 2. Strang der cDNA und Adapter Schleife mit Benutzer (Uracil-spezifische Exzision Reagenz) Enzym Strang Spezifität und öffnen Sie die Adapter-Schleife für die PCR.<ol>
<li>Führen Sie 13 Zyklen der PCR mit universal und Index-spezifische Primer, um die indizierte Bibliothek zu bereichern. Bereinigen Sie die Bibliothek und laufen auf einem Bioanalyzer DNA hohe Empfindlichkeit Chip Bibliothek Qualitätsprüfung und Größenverteilung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie eine Bibliothek Quantifizierung Kit und ein Echtzeit-PCR-System in Kombination mit Bibliotheksinformationen Größe berechnen Bibliothek Konzentration über eine Standardkurve Methode.</li>
		<li>Proportional individuell indizierte kompatible Bibliotheken zu bündeln und passen Sie die endgültige Gesamtkonzentration bis 15 Uhr. Führen Sie Bibliothek Cluster Generation und Sequenz der Bibliothek bei einer Einstellung von einzelnen lesen 1 x 50 bp, 25 Millionen Lesevorgänge pro Probe zu generieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sequenzierung<ol>
<li>Laden Sie die Sequenzierung und Reagenzien zu den SBS und PE-Reagenz-Racks bzw. Indizierung. Legen Sie die Reagenzien im Wasserbad Laborqualität 1 h, bis das Eis geschmolzen und der Reagenzien in jede Flasche/Tube richtig gemischt.</li>
		<li>Die ICB Mischung indem das aufgetaute Farbstoff und-20 ° C Enzym zu der Flasche zubereiten und mischen. Bereiten Sie eine NaOH-Lösung gemäß den Anweisungen der Sequenzierung. Platzieren Sie alle Reagenzien bei 4 ° C bis zum Gebrauch.</li>
		<li>Während der 1 h Wartezeit, schalten Sie den Sequenzer. Warten Sie, bis das DONOTEJECT Laufwerk erscheinen und verbinden den Computer auf ein Netzlaufwerk.</li>
		<li>Die Sequenzer-Steuerungs-Software zu starten.</li>
		<li>Bereiten Sie 2 L Wartung Waschlösung, die 0,5 % Tween 20 und 0,03 % enthält ProClin 300 in Laborqualität Wasser.</li>
		<li>Fügen Sie in der SBS-Reagenz-Rack hinzu ~ 100 mL Waschlösung Wartung zu jedem der 8 Flaschen und Schraubverschlüsse Trichter in die Flaschen. In der PE-Reagenz-Rack jedes der zehn 15 mL konische Rohre ~ 12 mL Waschlösung Wartung hinzu, und entsorgen Sie die Kappen.</li>
		<li>Laden Sie die beiden Zahnstangen mit der Lösung gefüllt Flaschen/Rohre zu den Sequenzer.</li>
		<li>Der Sequenzer-Steuerungssoftware wählen Sie die Wartung zu waschen; Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm um die Sequenzer-Fluid-System zu reinigen, bis der Vorgang abgeschlossen ist.</li>
		<li>Starten Sie eine neue Folge im Register "Sequenz" aus der Software; leiten Sie die Ausgabedaten auf ein Netzlaufwerk. Wählen Sie Parameter für einzelne lesen 1 x 50 bp mit Einzelindex gemultiplext Bibliotheken.</li>
		<li>Optional, melden Sie sich bei BaseSpace Sequenz Hub, so dass der Sequenzierung Status über einen Computer oder Smartphone aus der Ferne überwacht werden kann.</li>
		<li>Laden ein Beispielblatt für die Entpackung und Reagenz Informationen entsprechend der Software-Anforderung.</li>
		<li>Laden Sie SBS und PE Reagenzien in den Sequenzer. Entlüften Sie das System mit einer gebrauchten Durchflusszelle (~ 15 min).</li>
		<li>Nach Abschluss die Cluster-Generation (~4.5 h), die Durchflusszelle herausnehmen, leicht spray die Messzelle mit Wasser und wischen Sie es mit Linsenpapier trocken. Leicht spray die Messzelle mit 95 % igem Ethanol und trocken wischen. Überprüfen Sie gegen ein Licht, um sicherzustellen, dass die Oberfläche sauber ohne Schmutz oder Salz Rückstand ist.</li>
		<li>Nachdem der Prime Schritt abgeschlossen ist, laden Sie die gruppierten Durchflusszelle und beginnen Sie die Sequenzierung. Die Sequenz-Analyse-Viewer-Software wird automatisch gestartet.</li>
		<li>Überwachen Sie die Sequenzierung Datenqualität über SAV einschließlich Cluster Dichte, liest-Pass-Filter, Cluster-Pass Filter %, % ≥Q30, Legacy Phase/Prophase %, Indizierung, QC, etc. , das hilft zu verstehen, die Datenqualität und zu beheben.</li>
		<li>Ändern Sie die Strömung Zelle Dichtung und führen Sie eine Wartung zu waschen, nachdem die Sequenzierung abgeschlossen ist. Der Sequenzer ist bereit für den nächsten Lauf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bioinformatische Analyse<ol>
<li>Durchführen Sie Bioinformatik RNA-Seq-Daten-Analyse-13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Weg-Analyse der transkriptomischen Profile (Abbildung 1 b)
<ol><li>Mithilfe einer Staucher Bioconductor um resultierende gen Ausdruck Intensität zählt zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten DCs von drei Gebern zu vergleichen. Dann identifizieren differentiell exprimierten Genen zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten DCs auf Basis der absoluten Falte Änderung (> 2 Falten) und die falsche Entdeckung (FDR) - eingestellten p- Werte (< 0,05).</li>
	<li>Um die funktionale Cluster differentiell Vorhersagen ausgedrückt Gene, verwenden die ToppCluster-Software-Paket zu suchen die veränderten Gene gegen mehrere Datenbanken einschließlich KEGG und REACTOME und clustering Daten generieren. ToppCluster nutzt die hypergeometrische Test um funktionale Anreicherung über die gen Liste Anreicherung Analyse16zu erhalten.</li>
	<li>Weiter geben Sie die Ergebnisse aus dieser Funktion Cluster Cytoscape17,18 Version 3.3.0, eine allgemein verwendeten open-Source-Software-Plattform zur Visualisierung von komplexer Netzwerken. So werden die Gene in verschiedenen Clustern oder Wege, einschließlich endocytic Cluster und Fettstoffwechsel, in einem Netzwerk mit Farbe Anmerkung die gemittelten Falte Veränderung des Gens Ausdruck (Abbildung 1 b)13angezeigt.</li>
</ol>(3) Bildgebung Durchflusszytometrie CD1d und Lamp1 NS1
<ol><li>Antikörper Kennzeichnung von BaP-exponierten DCs<ol>
<li>Expose 0,5 x 106 menschlichen DCs 5,94 mm BaP für 4 Tage bei 37 ° C in 2 mL komplette Dulbecco geändert Eagle Medium. Ernten Sie DCs durch Zentrifugation bei 400 X g für 10 min. Block die differenzierte DCs durch Inkubation der Zellen mit humanem Serum-Blocker und Anti-Human Fc-Rezeptor Antikörper für 10 min im Eis, einschließlich Anti-Human CD64 CD16 und CD32 Antikörper.</li>
		<li>Inkubieren Sie brillante violett 421-Anti-CD1c (L161), Phycoerythrin/Cyanin färben 7 (PE/Cy7) - Anti - HLA-DR und PE/Cy5-Anti-CD11c mit DCs für 20 min in Eis. Tabelle 1 zeigt die Liste der Antikörper.</li>
		<li>DCs mit 4 % Paraformaldehyd in PBS befestigen und permeabilize sie mit Permeabilisierung Waschpuffer. Führen Sie die intrazelluläre Färbung mit einer Mischung aus PE-Label gereinigten Anti-Human CD1d (51,1) und Alexa Fluor 647-markierten Anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imaging-Zytometrie Durchflussmessung (Abbildung 2)<ol>
<li>Analysieren Sie die gefärbten Proben unter Verwendung einer bildgebenden Durchflusszytometer Herzstück Flow Cytometry Cincinnati Kinderkrankenhaus mit einem 40 X Objektiv 300 Pixel für eine Zelle mit ca. 10 mm Durchmesser liefern. Ein-Pixel-Größe ist ca. 0,5 mm x 0,5 mm des Objekts.</li>
		<li>10.000 zellulären Bilder unvoreingenommen nach Anleitung des Herstellers zu erwerben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Bildgebung Analysen der Flow Cytometry Bilder
<ol><li>NS1 Analyse mit Ideen-Software (Abbildung 2)<ol>
<li>Führen Sie Entschädigung mit Single-gefärbten versus nicht-gefärbten Proben durch Festlegen der Fluoreszenzintensität-gefärbten Proben unterhalb der Schwelle, einschließlich nicht-gefärbten BaP-exponierten DCs mit BaP Autofluoreszenz, wie routinemäßige Flow Cytometry Daten Analyse.</li>
		<li>Tor gefärbten Zellen erhalten die Teilmengen von HLA-DR+CD11c+CD1d+Lamp1+ Zellen (Abbildung 2A) und zelluläre Bilder anzeigen in den gated Teilmengen (Abbildung 2 b).</li>
		<li>Speichern Sie Zelle Bilder im Png-Format basierend auf zwei technische Einschlusskriterien, die visuelle Präsenz der starke Co gefärbten Signale und subzelluläre Lokalisation der CD1d und Lamp1 Proteine, für die NS1-Analysen mit ImageJ-Fidschi (Abbildung 2 b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie Software ImageJ-Fidschi NS1 Analyse (Abbildung 3).<ol>
<li>Bereiten Sie die Bild-Dateien durch die Zusammenlegung der 100 gespeicherte Zelle Bilder für nicht-exponierten und BaP-exponierten menschlichen DCs bzw. (Abb. 3A).</li>
		<li>Analysieren Sie CD1d (rot) und Lamp1 (grün) NS1 mit ein Streudiagramm.<ol>
<li>ImageJ-Fidschi-Programm ausführen. Öffnen Sie die PNG-Datei mit 100 Bildern der Zelle (Abb. 3 b und Abbildung 4A): "Datei | Offene".</li>
			<li>Das Bild mit zusammengeführten roten und grünen Kanäle in zwei Bilder mit einem roten oder grünen Kanals aufgeteilt: "Bild | Farbe | Split Kanäle".</li>
			<li>Zeichnen Sie ein Streudiagramm mit den Befehlen "Analyze | NS1 | NS1 Threshold". Speichern Sie das Streudiagramm mit der "PrintScreen" -Taste.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen die Mander NS1 Koeffizienten für jedes Einzelbild zellulären (n = 100) (Abbildung 4 b)<ol>
<li>Wählen Sie eine einzelne Zelle Bild auf die Image-Datei mit Split-Kanäle mit der "Oval" Auswahl-Werkzeug.</li>
			<li>Verwenden Sie die Befehle "Analyze | NS1 | NS1 Threshold". Wählen Sie "Channel 1" aus der Dialogbox der Region of Interest (ROI). Halten Sie alle Berechnungsoptionen einschließlich der "Mander es Verwendung Schwellenwerte" für jedes Bild der Zelle.</li>
			<li>Wiederholen Sie diese Berechnung für alle 100 Zelle Bilder.</li>
			<li>Speichern Sie und öffnen Sie die Ergebnisse mit einer Tabellenkalkulation.</li>
			<li>Handlung der Durchschnitt und Standardfehler für "Thresholded Mander Koeffizienten" (n = 100, 0 bedeutet keine NS1 und 1 perfekte ns1). Verwenden Sie Studenten t-Test zur Berechnung des p -Wert für den Vergleich zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten Gruppen (Abbildung 4 b).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie den Prozentsatz der thresholded Pixel Intensität Co zwischen CD1d und Lamp1 für mehrere Bilder der Zelle lokalisiert (n = 100) (Abbildung 4).<ol>
<li>Verwenden Sie die gleiche Analyse-Protokoll in 4.2.3 und wählen Sie zusätzlich das Ergebnis Option "% Intensität über Schwelle colocalized".</li>
			<li>Führen Sie diese Analyse zusammen mit der Mander NS1 Koeffizienten.</li>
			<li>In ähnlicher Weise Grundstück dem Durchschnitt und Standardfehler für % Intensität zwischen CD1d und Lamp1 colocalized. Verwenden Sie Studenten t-Test zur Berechnung des p -Wert für den Vergleich zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten Gruppen (Abbildung 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Funktionale Bestätigung über eine veränderte Gen Weg ist anspruchsvoll, wegen der stark belasteten Genexpression, an denen mehrere Wege und die Schwierigkeit, individuelle und populational Zellaktivitäten zu integrieren. Wir beschäftigten bildgebenden Durchflusszytometrie, speziell Test CD1d Handel in endocytic Fächern. Imaging Durchflusszytometrie integriert die populational Messung der Zellen und die individuelle Demonstration der subzellulären NS1 mehrere Proteine. Konfokale Mikroskopie hat zuvor hohen Auflösung bei d...

Antigenpräsentation umfasst in der Regel intrazelluläre Protein Menschenhandel, die oft mit Morphologische Charakterisierung und phänotypischen Profilierung der antigenpräsentierende Zellen1,2,3 untersucht wurden . Um die Vorteile der Bildgebung und Phänotypisierung Methoden zu integrieren, beschreiben wir eine bildgebende Analyseplattform auf Einzelzelle und Einwohnerzahlen zu einem veränderten Protein NS1 in menschlichen dendritischen Zellen (DCs) zeigen. Im Peptid Antigenpräsentation große Histocompatibility complex (MHC) Klasse I Moleküle binden eine kurze Peptid (8-10 Rückstände) in das endoplasmatische Retikulum konventionellen CD8 aktivieren+ T-Zellen, während MHC-Klasse-II-Moleküle relativ länger binden Peptid (~ 20 Rückstände) in endocytic Fächern für konventionelle CD4 aktivieren+ T Zellen1,4. Im Gegensatz dazu werden Lipid-spezifischen T-Zellen durch CD1 Proteine mit Lipid-Antigenen, die vor allem in endocytic Fächern5,6geladen aktiviert. Lipid Antigenpräsentation erfordert die Versorgung von Lipid-Metaboliten in Lipid Metabolismus7,8,9,10 und das Laden von funktionalen Lipid-Metaboliten auf CD1 Proteine in produziert endocytic Fächer5,6. In diesem Zusammenhang kritisieren verschiedene zelluläre Faktoren modulieren Lipid Antigenpräsentation, vor allem in Umweltexposition von lipophilen Schadstoffen und Erkrankungen des Immunsystems, definiert werden. In dieser Studie verwendeten wir transkriptomischen Analyse, Bild Profilierung und zellulären und populational bildgebende Analyse der menschlichen Monocyte abgeleitet DCs bestimmen das endocytic Protein Menschenhandel zur Lipid Antigenpräsentation in Schadstoff-Exposition. Natürlich kann diese kombinierte Plattform genutzt werden, um Studium der subzellulären Protein Menschenhandel und NS1 in verschiedenen biologischen Prozessen.
Technisch, zeigte Protein subzelluläre Lokalisation in der Regel mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie und statistisch analysiert in einer begrenzten Anzahl von gefundenen Zellen1,2,3,11. Darüber hinaus wurde Durchflusszytometrie weitgehend auf Tor Zell-Populationen mit Co gefärbten Signale von mehreren Proteinen auf einem zellularen Niveau12angewendet; Das fehlen jedoch einer detaillierte Visualisierung der subzellulären Protein NS1. Um umfassende und statistische Analysen der Prozentsatz Protein NS1 Ebene Mobilfunk und der Bevölkerung zu erreichen, integrieren wir imaging Profilierung und Analyse Ansätze bestimmen die Eigenschaften des Proteins NS1 mit biologischen Relevanz. Insbesondere verwenden wir bildgebende Durchflusszytometrie NS1 CD1d und lysosomale verbundenen Membranprotein 1 (Lamp1) erkennen Proteine in dieser Studie. Quantitative Analyse der colocalized Moleküle war bisher schwierig, in einem populational Maßstab durchgeführt werden. In dieser Studie haben wir die ImageJ-Fidschi-Programm, den Anteil an Protein NS1 mit einer großen Anzahl von Co gefärbten Zellen populational und einzelner zellulärer Ebene untersuchen angepasst. Insbesondere haben wir gemessen Co lokalisierten Bereichen, Intensität und populational Größe zu der Schlussfolgerung, dass das CD1d-Protein weitgehend in späten endocytic Abteilen des menschlichen DCs in Exposition gegenüber einem lipophilen Schadstoffen Benzo [a] pyren (BaP)13 beibehalten wurde . Diese kombinierte zelluläre und Bevölkerung bildgebende Analyse zur Verfügung gestellt hoch reproduzierbare, umfassende und statistisch signifikante Ergebnisse der CD1d-Lamp1 NS1 für gehemmt Lipid Antigenpräsentation relevant.
Das Transkriptom des BaP-exponierten menschlichen DCs unterstützt nachdrücklich die Hypothese, dass endocytic Lipidstoffwechsel und CD1d endocytic Menschenhandel in BaP-Exposition beeinträchtigt wurden. Um diese Hypothese zu testen, haben wir bildgebende Durchflusszytometrie um die Bilder der DC Bevölkerung Profil, die mit mehreren Proteinen einschließlich CD1d, endocytic Markierungen und DC-Marker Co gebeizt wurden angewandt. Schließlich wurden Co gefärbten Zellen statistisch analysiert, um den Prozentsatz der Intensität und Bereiche der CD1d und Lamp1 NS1 zu demonstrieren.

<table><tbody><tr><td>Transkriptomik</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500 v4</td><td>Illumina HiSeq-System</td></tr><tr><td>ImagingStream X</td><td>Millipore</td><td>100220</td><td>Bildgebende Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>mirVana miRNA-Isolationskit</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Gesamt-RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td></td><td>Gesamt-RNA QC-Analyse</td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Schnell-Thermocycler</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>PCR, Enzymreaktion</td></tr><tr><td>NEBNext Poly(A) mRNA Magnetisches Isolationsmodul&nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>PolyA RNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Automatisiertes SMARTer Apollo-System</td><td>Takara</td><td></td><td>PolyA RNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit für Illumina</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Bibliotheksvorbereitung</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP magnetische Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>DNA-Aufreinigung&nbsp;</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC, Größenverteilungsanalyse</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC, Größenverteilungsanalyse</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Library Quantifizierung</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit</td><td>New England Biolab</td><td></td><td>Library Quantifizierung</td></tr><tr><td>cBot</td><td>Illumina</td><td></td><td>Library Cluster-Generierung</td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &ndash; HS</td><td>Illumina</td><td></td><td>Library Cluster-Generation</td></tr><tr><td>HiSeq 1000</td><td>Illumina</td><td></td><td>Sequencing</td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-Zyklen)</td><td>Illumina</td><td></td><td>Sequenzierung</td></tr><tr><td>Phycoerythrin/Cyanin 7 (PE/Cy7)</td><td>Bio Legend</td><td>L243</td><td></td></tr><tr><td>Phycoerythrin/Cyanin 5 (PE/Cy5)</td><td>Bio Legend</td><td>3.9</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant violet 421</td><td>Bio Legend</td><td>L161</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-Maus IgG2b</td><td>Bio Legend</td><td>51.1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647)</td><td>Bio Legend</td><td>CD107a(H4A3)</td><td></td></tr></tbody></table>

integration von imaging durchflusszytometrie und transkriptomischen profilierung zu veränderten endocytic cd1d handel bewerten

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational Analysen der morphologischen und funktionellen Veränderung der endocytic Proteine sind aufgrund der Nachfrage der Bilderfassung in einer Einzelzelle Ebene und statistische Bildanalyse auf einem populational Niveau anspruchsvoll. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, zum wir bildgebende Durchflusszytometrie und transkriptomischen profiling (RNA-Seq) veränderten subzelluläre Lokalisation des Clusters Differenzierung 1D Protein (CD1d) verbundenen bestimmen mit eingeschränkter endocytic Genexpression in menschlichen Dendritische Zellen (DCs), die die gemeinsame lipophilen ausgesetzt wurden Luft Schadstoff Benzo [a] pyren. Die NS1 CD1d und endocytic Marker Lamp1-Proteine aus Tausenden von Zelle Bilder mit imaging-Durchflusszytometrie wurde mit Ideen und ImageJ-Fidschi analysiert Programme. Zahlreiche zelluläre Bilder mit Co gefärbten CD1d und Lamp1 Proteine wurden nach Anspritzung auf CD1d visualisiert+Lamp1+ DCs mit Ideen. Die verbesserte CD1d und Lamp1 NS1 auf BaP Exposition weiter demonstriert wurde, mit thresholded Scatterplots, getestet mit Mander des Koeffizienten für Co lokalisierte Intensität und geplottet basierend auf dem Prozentsatz von Co lokalisierten Bereichen mit ImageJ-Fidschi. Unsere Daten bieten einen vorteilhaften Instrumental- und bioinformatische Ansatz zur Messung von Protein NS1 auf Einzel- und populational zellulären Ebenen beeinträchtigtes funktionelle Ergebnis transkriptomischen Änderung in Schadstoff-exponierten Menschen unterstützen DCs.

Die lipophile Schadstoff BaP verändert endocytic gen-Cluster in menschlichen DCs. Human Monocyte abgeleitet DCs von jedem Spender (n = 3) wurden mit BaP inkubiert und sortiert für konventionelle DCs, die weiter für RNA-Extraktion und transkriptomischen Analyse wie beschrieben verwendet wurden . Nach der Normalisierung der Genexpression wurden veränderte Gene zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten Gruppen entsprechend der funktionalen Zusammenhang differentiell exprimierten Gene gr...

Durchflusszytometrie Imaging bietet einen idealen Ansatz um die morphologische und funktionelle Veränderung der Zellen auf individuelle und populational Ebene zu erkennen. Gestörten endocytic Funktion für Lipid Antigenpräsentation in Schadstoff-exponierten menschlichen dendritischen Zellen wurde mit einem kombinierten transkriptomischen Profilierung der Genexpression und morphologischen Demonstration des Handels mit Protein nachgewiesen.

Integration von Imaging Durchflusszytometrie und transkriptomischen Profilierung zu veränderten Endocytic CD1d Handel bewerten

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Diese Methoden integrieren die Sequenzierung der nächsten Generation und die Bildgebungsanalyse der Durchflusszytometrie. Es kann helfen, interessante Fragen zu beantworten, wie z. B. ob einige phänotypische Veränderungen impliziert sind, anstelle des Transkriptoms, vor allem in der Umwelt der Schadstoffbelastung. Der Hauptvorteil dieser einfachen Methode für uns ist, dass wir sie verwenden können, um die Kolokalisierung von biologisch wichtigem Protein zu messen, um die Ergebnisse der wichtigsten Differentialgenexpression auf funktioneller Ebene zu interpretieren.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Diagnose pathologischer und toxikologischer Ergebnisse. Als normaler Imager-Ansatz hat Forsee die Fähigkeit, genexpression mit der Proteinfunktion zu verbinden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der hohen technischen Anforderungen der bildgebenden und transkriptomischen Analyse Schwierigkeiten haben.Um die menschliche Monozyten-abgeleitete dendritische Zellbibliothek zu sequenzieren, laden Sie zunächst die Sequenzierungs- und Indexierungsreagenzien auf die Sequenzierungsbiosynthese- bzw. Indexierungsreagenz-Racks und legen Sie die Regale für eine Stunde in ein Laborwasserbad, bis das gesamte Eis geschmolzen ist und die Reagenzien gründlich gemischt werden. Während die Reagenzien auftauen, schalten Sie den Sequenzer ein, schließen Sie den Computer an ein Netzlaufwerk an, wenn das Laufwerk Nicht auswerfen, und starten Sie die Sequenzersteuerungssoftware. Als nächstes fügen Sie etwa 100 Milliliter Wartungswaschlösung zu jeder der Flaschen in der Sequenzierung Biosynthese Reagenz Rack, und schrauben Sie eine Trichterkappe auf jede Flasche.Fügen Sie etwa 12 Milliliter Wartungswaschlösung zu jedem 15 Milliliter konischen Rohr im Indexierungsreagenzgestell hinzu, und entsorgen Sie die Kappen. Dann laden Sie beide Racks auf den Sequenzer. Wählen Sie Maintenance Wash in der Sequenzersteuerungssoftware aus, und befolgen Sie die Anweisungen zur Reinigung des Sequenzerflüssigkeitssystems.Verwenden Sie eine Taschenlampe, um die Durchflusszelle visuell auf Blasen zu untersuchen, die durch die Fahrspuren gehen, um sicherzustellen, dass es keine Leckagen gibt. Wenn die Waschsequenz abgeschlossen ist, öffnen Sie die Registerkarte Sequenz, und starten Sie eine neue Ausführung, um die Ausgabedaten an ein Netzlaufwerk weiterzuleiten. Laden Sie ein Beispielblatt zum Entmultiplexing hoch, und geben Sie die entsprechenden Reagenzinformationen ein.Verwenden Sie eine verwendete Durchflusszelle, um das System mit den Sequenzierungsreagenzien zu grundieren. Sobald die Clustergenerierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Durchflusszelle. Und die Zelle leicht mit Wasser besprühen.Wischen Sie die Durchflusszelle trocken mit Linsenpapier ab, gefolgt von einem Lichtspray mit 95% Ethanol. Nachdem Sie die Durchflusszelle wieder trocken gewischt haben, überprüfen Sie die Oberfläche der Durchflusszelle mit dem Licht, um sicherzustellen, dass sie sauber ist, ohne Schmutz oder Salzrückstände. Wenn der Hauptschritt abgeschlossen ist, laden Sie die gruppierte Durchflusszelle, und beginnen Sie mit der Sequenzierung.Die Sequenzanalyse-Viewer-Software wird automatisch gestartet. Überwachen Sie etwa 26 Stunden später die Datenqualität der Sequenzierung über die Software für die hohe Sequenzsteuerung und die Analyseansichtssoftware, um die Datenqualität zu bewerten und die Fehlerbehebung zu beheben. Wenn die Sequenz abgeschlossen ist, ändern Sie dann die Durchflusszellendichtung, und führen Sie eine Wartungswäsche durch, bevor Sie mit dem nächsten Durchlauf beginnen.Nach der zytometrischen Bildgebung der schadstoffexponierten dendritischen Zellen öffnen Sie ImageJ Fidschi und verschmelzen Die 100 gespeicherten Zellbilder für die nicht exponierten und schadstoffexponierten menschlichen dendritischen Zellprobengruppen entsprechend der Behandlungsgruppe in einzelnen Dateien. Um CD1d und Lamp1-Kolokalisierung innerhalb der beiden Populationen zu analysieren, öffnen Sie das schadstoffbelichtete 100 zusammengeführte Zellbild, und wählen Sie Bild, Farbe und Split-Kanäle aus, um das Bild in zwei einzelne Bilder mit einem einzelnen Fluorophor pro Kanal aufzuteilen. Um ein Streudiagramm der kolokalisierten Pixel zu erstellen, wählen Sie Analysieren, Kolokalisierung und Colokalisierungsschwellenwert aus, und drücken Sie Druckbildschirm, um das Streudiagramm zu speichern.Um den Kolokalisierungskoeffizienten des Manders für jedes einzelzelluläre Bild zu berechnen, verwenden Sie das ovale Auswahlwerkzeug, um ein Einzelzellenbild in der Bilddatei mit den geteilten Kanälen auszuwählen, und wählen Sie erneut Analyse, Kolokalisierung und Colokalisierungsschwellenwert aus. Wählen Sie dann Kanal 1 aus dem Dialogfeld für die Interessenregion aus, und klicken Sie auf OK. Wenn der Koeffizient für alle 100 Zellbilder berechnet wurde, importieren Sie die Ergebnisse in eine entsprechende Kalkulationstabelle, und wiederholen Sie die Analyse für die nicht verfügbar gemachte Zellenprobe. Mithilfe von RNA-Sequenzierung und transkriptomischen Datenanalysen wurden mehrere wichtige veränderte Gencluster, einschließlich Lipidstoffwechsel und endozytäre Funktionen, in den schadstoffexponierten DCs identifiziert.Auf der individuellen Zellbildebene können HLADR-positive CD11c-positive dendritische Zellen gemäß ihrer CD1d- und Lamp1-Koexpression abgezäut werden. Kontrollieren Sie nicht exponierte dendritische Zellen zeigen minimale CD1d- und Lamp1-Proteinkolokalisierung, was auf einen basalen Gehalt an CD1d-Endozytikerhandel und eine hohe Oberflächenexpression unter physiologischen Bedingungen hinweist. Während CD1d in den späten endozytischen Kompartimenten von schadstoffexponierten dendritischen Zellen aufbewahrt wird, bestätigt sich die samtytischen Genprofile in dieser experimentellen Zellpopulation.Nach dem Zusammenführen der einzelnen Zellbilder in eine einzelne Bilddatei können die einzelnen Bilder entsprechend ihrem Fluorophorausdruck aufgeteilt und die Kolokalisierung der Pixelintensität zwischen den beiden Kanälen in einem Streudiagramm visualisiert werden. Der Grad der Kolokalisierung zwischen den CD1d- und Lamp1-Proteinen in den beiden Behandlungsgruppen kann dann mit Mander-Koeffizienten quantifiziert werden. Wenn die Proteinintensität zwischen den kolokalisierten und nicht-kolokalisierten Bereichen hetergenes ist, wird die kolokalisierte Intensität nicht parallel zu den kolokalisierten Bereichen sein, daher ist es auch wichtig, die Kolokalisierung der beiden Proteine auf der Grundlage der Pixelintensität weiter zu bewerten.Nach der Beherrschung kann die Bildanalyse in zwei Stunden abgeschlossen werden, und die RNA-Sequenzierung kann in drei Stunden abgeschlossen werden, wenn jede Technik ordnungsgemäß durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich vorzuvergessen, dass alle Reagenzien ordnungsgemäß in den richtigen Positionen geladen sind und dass es keine Leckage im Sequenzer gibt. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Mikro-RNA, Exom oder Mastzellsequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur globalen Mikro-RNA-Expression, Genmutation bzw. DNA-Methylierung zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der zellulären Bildgebungsanalyse und der Sequenzierung der nächsten Generation helfen, die Auswirkungen des Umweltschadstoffs auf die Genexpression und die Proteinfunktion zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Sequenzierung der nächsten Generation und die Imageranalyse der Proteinkolokalisierung einrichten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem giftigen Schadstoff Chemikalien in menschlichen Blutproben extrem gefährlich sein kann.Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung einer chemischen Dunstabzugshaube und persönliche Schutzausrüstung sollten bei der Durchführung dieser Verfahren immer getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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