Bewertung der Exon-Aufnahme durch induzierte Splice Switching Antisense Oligonukleotide in SMA Patienten Fibroblasten
11. Mai 2018
Verschiedenen antisense Oligonukleotide (AONs) haben gezeigt, zu induzieren Exon Aufnahme (Spleiß-Modulation) und SMN Ausdruck für Spinale Muskelatrophie (SMA) zu retten. Hier beschreiben wir ein Protokoll für AON Lipotransfection, Exon Aufnahme in das SMN2 -gen und die Bewertungsmethoden zu ermitteln, die Wirksamkeit bei SMA Patienten Fibroblasten zu induzieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Lipotransfektionsprotokolls ist es, Antisense-Oligonukleotide in die Zellen einzuführen und die Wirksamkeit dieser Medikamente auf den Exon-Einschluss in SMA-Zellen zu bewerten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Antisense-Therapie zu beantworten. Zum Beispiel die Wirksamkeit neuer Antisense-Oligos zur Behandlung von Patienten.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell, einfach und empfindlich genug ist, um verschiedene Antisense-Oligonukleotidchemikalien zu testen. Obwohl diese Methode für die Transfektion von Antisense-Oligos in Fibroblasten verwendet werden kann, kann sie auch auf andere Zelltypen, wie primäre Myoblasten und verschiedene andere Zelllinien, angewendet werden. Das Verfahren wird von Aleks, einem Techniker aus meinem Labor, vorgeführt.
Tauen Sie zunächst eine 10-mikromolare Lösung des LNA/DNA-Mixmers auf Eis auf. Die Mixmerlösung wird in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf die erforderliche Konzentration verdünnt. Als nächstes verdünnen Sie das Transfektionsreagenz und geben Sie das verdünnte Transfektionsreagenz im Verhältnis eins zu eins in das Mixmer.
Es ist entscheidend, dass die Zellkonfluenz während der Transfektion bei etwa 65 bis 80 % liegt. Wenn die Konfluenz über 80% liegt, wird die Transfektionseffizienz reduziert. Inkubieren Sie dann das Transfektionsreagenzgemisch 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Pipettieren Sie nach 10 Minuten 900 Mikroliter serumarmes Medium mit 5 % fötalem Rinderserum in das Röhrchen. Fügen Sie das FBS nicht vor der Inkubation mit dem Transfektionsreagenz und den LNA/DNA-Mixmern hinzu, da dies auch die Transfektionseffizienz beeinflusst. Aspirieren Sie dann das alte Medium aus der Kulturplatte.
Geben Sie nun einen Milliliter des Mediums, das das LNA/DNA-Mixmer enthält, in die Kulturplatte. Lassen Sie die Platte dann 24 bis 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Inkubator. Nach der Inkubation wird das Medium von der Kulturplatte abgesaugt.
Pipettieren Sie dann einen Milliliter GPC-Reagenz in die Zellen. Waschen Sie anschließend die Vertiefungen mehrmals mit dem GPC-Reagenz. Nach mehreren Wäschen sammeln Sie die Zellen in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen und bewahren die Proben auf Eis auf.
Wirbeln Sie dann das Rohr 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit durch. Lagern Sie das Röhrchen dann eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius. Tauen Sie nun die Probe bei Raumtemperatur auf und wirbeln Sie sie schnell ein.
Geben Sie anschließend 200 Mikroliter Chloroform in die Probe und schütteln Sie sie 15 Sekunden lang kräftig. Inkubieren Sie das Röhrchen dann drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach drei Minuten zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Sobald die Zentrifugation beendet ist, sammeln Sie die wässrige Phase von der Oberseite des Zentrifugenröhrchens. Dann überführen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Isopropanol und einen Mikroliter acht Mikrogramm pro Mikroliter Glykogen in RNA-Qualität in die wässrige Phase.
Die Probe 10 Sekunden lang schnell vortexen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand nach dem Lauf.
Fügen Sie einen Milliliter kaltes 75%iges Ethanol hinzu und wirbeln Sie es kurz ein, um das erhaltene Pellet zu waschen. Auch hier zentrifugieren Sie die Probe bei 7500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Stoßen Sie dann das gesamte Ethanol aus und trocknen Sie das Pellet bei Raumtemperatur.
Nachdem das Pellet ausgetrocknet ist, lösen Sie es in 30 Mikrolitern DNAse/RNAse freiem Wasser auf. Inkubieren Sie die Probe dann 10 Minuten lang bei 60 Grad Celsius. Als nächstes lesen Sie die Konzentration der RNA bei 260 Nanometern im Spektralphotometer ab und stellen sie auf 15 Nanogramm pro Mikroliter ein.
Um den RT-PCR-Mastermix zu bilden, fügen Sie die beiden X RT-PCR-Reaktionspuffer, den einstufigen RT-PCR-Enzymmix, Vorwärts- und Rückwärtsprimer und RNAse/DNAse-freies destilliertes Wasser hinzu. Verteilen Sie den Mastermix in 0,2-Millimeter-PCR-Röhrchen und fügen Sie die Gesamt-RNA für die jeweilige Probe hinzu. Starten Sie dann die PCR-Reaktion.
Nachdem die RT-PCR abgeschlossen ist, fügen Sie dem amplifizierten Produkt fünf Mikroliter mit sechs X Ladefarbstoff hinzu. Laden Sie dann fünf Mikroliter der Mischung auf ein 2%iges Agarose-Gel. Starten Sie das Elektrophoresegerät bei 100 Volt für 40 Minuten.
Zunächst wird die Effizienz verschiedener Mischer untersucht. Zu diesem Zweck wird der Einschluss der SMN2-Exon-7- und GAPDH-Spiegel in SMA-Fibroblasten analysiert, die mit den Mixmeren transfiziert wurden. Das Gelbild zeigt den Einschluss von Exon 7, wobei die obere und die untere Bande die enthaltene und ausgeschlossene SMN2-RNA von Exon 7 darstellen.
Die Einschlusseffizienz wird ebenfalls auf 78 bis 98 % quantifiziert, wenn sie mit den Mixmeren eins bis fünf transfiziert wird. Auf der anderen Seite werden keine signifikanten Ergebnisse erzielt, wenn die Mixmer sechs bis acht verwendet werden, um die SMA-Fibroblasten des Patienten im Vergleich zur Kontrolle zu transfizieren. Im Experiment wird GAPDH als Kontrolle verwendet.
Als nächstes wird eine quantitative PCR durchgeführt, um die relative Expression des SMN2 in voller Länge im Vergleich zu GAPDH zu analysieren. Ein starker Anstieg der Menge des SMN2-Transkriptspiegels wird beobachtet, wenn mit den Mixmeren eins bis drei und Nummer fünf transfiziert wird, im Vergleich zur Kontrolle. Das SMN-Proteinexpressionsniveau wird ebenfalls untersucht, was einen Anstieg des SMN-Proteinexpressionsniveaus in den Fibroblasten des Patienten zeigt, die mit den Mixmeren eins bis fünf transfiziert wurden.
Es wird ein starker 1,5- bis 1,9-facher Anstieg des SMN-Proteinspiegels beobachtet. Hier kommt Cofilin zum Einsatz. Im Gegensatz dazu verändern die Mixmer sechs bis acht das Expressionsniveau des SMN-Proteins nicht.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Antisense-Oligo in Fibroblasten transfiziert und die Wirksamkeit in vitro bewertet.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Lipotransfektionsprotokoll zur Einführung von Antisense-Oligonukleotiden (AONs) in Zellen vor, um die Exoneinschaltung im SMN2-Gen zu induzieren, mit dem Ziel, die spinale muskuläre Atrophie (SMA) zu behandeln. Die Wirksamkeit dieser Methode wird in Fibroblasten von SMA-Patienten evaluiert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Genetik
- Zellbiologie
Hintergrund
- Die spinale muskuläre Atrophie (SMA) ist eine genetische Erkrankung, die die Motoneurone betrifft.
- Antisense-Oligonukleotide können das Spleißen modulieren und die SMN-Expression wiederherstellen.
- Effektive Applikationsmethoden für AONs sind entscheidend für therapeutische Anwendungen.
- Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung verschiedener AON-Chemikalien.
Zweck der Studie
- Einführung von AONs effektiv in SMA-Zellen.
- Beurteilung der Wirksamkeit von AONs bei der Induktion der Exon-Inklusion.
- Bereitstellung einer schnellen und empfindlichen Methode zur Prüfung von AONs.
Verwendete Methoden
- Lipotransfektion von Antisense-Oligonukleotiden in Fibroblasten.
- Beurteilung der Exoneinschlussrate im SMN2-Gen.
- Anwendung der Methode auf verschiedene Zelltypen, einschließlich primärer Myoblasten.
- Demonstration des Verfahrens durch eine Laborfachkraft.
Hauptergebnisse
- Die Lipotransfektionsmethode ist wirksam für die AON-Abgabe.
- Die Exon-Inklusion im SMN2-Gen wurde erfolgreich induziert.
- Das Protokoll ist an verschiedene Zelltypen anpassbar.
- Die Ergebnisse stützen das Potenzial von AONs als Therapie für SMA.
Schlussfolgerungen
- Dieses Lipotransfektionsprotokoll ist ein wertvolles Werkzeug für die Forschung zur Antisense-Therapie.
- Es ermöglicht die schnelle Überprüfung der Wirksamkeit von AONs in SMA-Zellen.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um neue AONs zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und empfindliche Bewertung der Wirksamkeit von Antisense-Oligonukleotiden (AON) hinsichtlich der Induktion der SMN2-Exon-Inklusion in aus Patienten gewonnenen Fibroblasten und unterstützt so die Validierung von Zielstrukturen und die Identifizierung führender Kandidaten in frühen Entwicklungsstadien für Therapien, die auf die Spleißmodulation abzielen. Durch die Quantifizierung der Exon-Inklusion und der Wiederherstellung des Proteins bei niedrigen AON-Konzentrationen liefert es eine vorhersagbare Sicherheit bei der Priorisierung von Kandidaten mit verbesserter Potenz und geringeren Toxizitätsprofilen. Die Anpassungsfähigkeit der Methode an verschiedene Zelltypen und Chemien erleichtert die präklinische Risikominderung und gewährleistet Kontinuität in der translationellen Entwicklung von Arzneimitteln gegen SMA.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Messung der Effizienz der SMN2-Exon-7-Einschaltung als funktionellen Endpunkt der Zielstrukturengagement.
- Operationaler Wert: Verwendet RT-PCR und qPCR zur Quantifizierung der Exoneinschaltung und Transkriptmengen und liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für die Zielstrukturvalidierung.
- Prädiktiver Wert: Zeigt eine dosisabhängige Wiederherstellung des SMN-Proteins mittels Western Blot nach, was die mechanistische Entlastung und die Priorisierung von AON-Kandidaten im Portfolio unterstützt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Etabliert einen auf Lipotransfektion basierenden Workflow, der mit Hochdurchsatz-Tests verschiedener AON-Chemien kompatibel ist, einschließlich LNA/DNA-Mixmeren.
- Reproduzierbarkeit: Standardisiert Transfektionsbedingungen (65–80 % Konfluenz, Reagenzverhältnisse) und Normalisierung auf GAPDH- und Cofilin-Kontrollen, um Konsistenz über Experimente hinweg sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit primären Myoblasten und anderen Zelllinien, wodurch die Plattform in verschiedenen, krankheitsrelevanten Modellen wiederverwendet werden kann.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verwendet Fibroblasten von SMA-Patienten, um genetische und phänotypische Treue zu gewährleisten und die translative Aussagekraft der AON-Screening-Daten zu erhöhen.
- Präklinische Kontinuität: Verknüpft Exon-Einschluss mit der Expression des SMN-Proteins und schafft so eine mechanistische Brücke von der Modulation des molekularen Zielmoleküls bis zur funktionellen phänotypischen Wiederherstellung.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf der Effizienz des Exon-Einschlusses (78–98 %) und der Protein-Expressionsänderung (1,5–1,9-fach), wodurch das biologische Risiko in späteren Stadien verringert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Bewertung und ermöglicht eine iterative Beurteilung der Wirksamkeit von AONs vor In-vivo-Studien.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Spleiß-Umschaltmechanismen durch Quantifizierung der Exon-Inklusion und Ausschluss von Nebenwirkungen mittels GAPDH-Normalisierung.
- Screening: Bietet bereitgestellte Assays und quantitative Ergebnisse (Prozent der Exon-Inklusion, Transkript-Veränderung als Faltungsänderung) für eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen über verschiedene AON-Chemien hinweg.
- Analytik: Erzeugt messbare Endpunkte (Quantifizierung von RT-PCR-Banden, relative Expression in qPCR, Proteinspiegel in Western Blot), die einen vergleichenden Ansatz zwischen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Wirksamkeit mit der Wiederherstellung von Proteinen in patientenabgeleiteten Zellen und unterstützt damit die Abstimmung von Biomarkern und die Kontinuität in der präklinischen Phase.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert ein standardisiertes Lipotransfektionsprotokoll, das auf verschiedene AON-Typen und Zellsysteme anwendbar ist und somit redundante Methodenentwicklung verringert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine verlässliche Vorhersage bei der Zielvalidierung durch direkte Messung der Exon-Inklusion und Wiederherstellung des SMN-Proteins.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit bei der Prüfung unterschiedlicher AON-Chemien in niedrigen Konzentrationen sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem die Effizienz der Exon-Inklusion mit der Proteinausprägung verknüpft wird, wodurch das Risiko von Fehlschlägen in späteren Phasen verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von AON-Kandidaten basierend auf quantitativen Wirksamkeitsschwellen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Nukleinsäuren, der Optimierung der Transfektion sowie der RNA- und Proteinanalyse.
- Abhängig von der Verträglichkeit des Transfektionsreagenz, einem Spektrophotometer zur RNA-Quantifizierung und den Geräten für Gelelektrophorese, qPCR oder Western Blot.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Arbeitsgruppen hinsichtlich der Transfektionsbedingungen (Konfluenz, Reagenzverhältnisse) und der Kontrollnormalisierung (GAPDH, Cofilin) für reproduzierbare Ergebnisse.
- Die Anpassung an primäre Myoblasten oder andere Zelllinien kann eine Optimierung der Transfektionseffizienz und eine Bewertung der Zytotoxizität erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Variabilität der Passagenanzahl bei patientenstammenden Fibroblasten und die Notwendigkeit, die RNA-Integrität während der Isolierung zu bewahren.
