Homogene Zeitaufgelösten Förster Resonanz Energie Transfer-basierten Test zur Erkennung von Insulin-Sekretion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Spiegel des sezernierten Insulins aus insulinsekretierenden Zellen zu induzieren und genau zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich Diabetes zu beantworten, wie z. B. die Hauptmechanismen der glukosestimulierten Insulinsekretion in Betazellen der Bauchspeicheldrüse. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Insulinsekretion als Reaktion auf die Glukosestimulation genau und schnell quantifizieren und potenzielle Auswirkungen von Arzneimitteln auf die Sekretion erkennen kann.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Wirkstoffforschung zur Behandlung von Typ-2-Diabetes, da sie es uns ermöglichen wird, die Mechanismen der medikamenteninduzierten Stoffwechseldysfunktion besser zu verstehen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Insulinsekretion von immortalisierten Betazelllinien geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf intakte Pankreasinseln. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund mehrerer Zellhandhabungsschritte und Arzneimittelvorbereitungen Schwierigkeiten haben.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir einen Schnelltest entwickeln wollten, um die Wirkung von dopaminergen Medikamenten auf die Insulinsekretion zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Handhabung der Zellen aufgrund der empfindlichen Natur der Zellen und der Bedeutung der Präzision, um die Konsistenz des Assays zwischen den Experimenten zu gewährleisten, schwer zu erlernen sind. Züchten Sie zunächst die INS-1E-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Sobald die Zellen die gewünschte Konfluenz erreicht haben, aspirieren Sie das Medium. Waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter 025%iges Trypsin in die Zellen und lassen Sie die Zellen drei bis vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius im Inkubator.

Deaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie neun Milliliter vollständiges Medium hinzufügen. Übertragen Sie anschließend die Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Dann zentrifugieren Sie die Zellen zu einem Pellet.

Nach dem Zentrifugieren das Pellet in fünf Millilitern frischem Medium auflösen. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der resuspendierten Zellen aus dem Röhrchen und mischen Sie es mit 10 Mikrolitern Trypanblau, um die Lebensfähigkeit zu beurteilen. Verwenden Sie als Nächstes ein Hämozytometer, um die Anzahl der lebenden und toten Zellen zu zählen und sicherzustellen, dass 90 % der Zellen lebend sind.

Nach der Zählung fügen Sie eine Million Zellen pro Milliliter in frisches RPMI 1640-Medium hinzu und säen Sie dann 0,5 Milliliter von 500.000 INS-1E-Zellen in jede Vertiefung einer mit Poly-L-Lysin beschichteten 24-Well-Platte. Lassen Sie die Platte einen ganzen Tag lang im Inkubator. Entfernen Sie am nächsten Tag das Medium und geben Sie 500 Mikroliter frisches RPMI 1640 Medium in jede der Vertiefungen.

Inkubieren Sie die Platte weitere 24 Stunden lang, damit sich die Zellen auf den Well-Oberflächen ausbreiten können. Um den Assay durchzuführen, bereiten Sie zuerst den KRB-Puffer vor, aspirieren Sie dann das Medium aus jeder der Vertiefungen und waschen Sie es zweimal mit vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Geben Sie anschließend 450 Mikroliter KRB-Puffer, ergänzt mit Rinderserumalbumin, aber ohne Glukose, in jede Vertiefung

Lassen Sie die Kulturplatte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Bereiten Sie serielle Verdünnungen der Arzneimittel in KRB-Puffer vor, ergänzt mit einer 10-fachen Endkonzentration von 200 Millimolar Glukose. Nach dem Schritt des Glukosemangels pipettieren Sie 50 Mikroliter seriell verdünnte Arzneimittel in jede der entsprechenden Vertiefungen.

Zur Glukosestimulation fügen Sie die jeweiligen seriell verdünnten Arzneimittel in Gegenwart von 20 Millimolarglukose hinzu. Anschließend werden die Zellen 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Sobald die Stimulation beendet ist, sammeln Sie die Überstände und geben Sie sie in beschriftete 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Übertragen Sie 10 Mikroliter jedes gesammelten Überstands in eine 96-Well-Platte. Geben Sie 90 Mikroliter KRB in jede Vertiefung, um ein Verdünnungsverhältnis von eins zu 10 zu erreichen. Mischen Sie die Verdünnungen, um die Homogenität zu gewährleisten.

Holen Sie sich dann die Insulin-Standardkurve für den HTRF-Insulin-Assay. Geben Sie anschließend jeweils 10 Mikroliter der Standardinsulinproben und die verdünnten Assay-Überstände auf eine 96-Well-Platte. Bereiten Sie die Antikörpermischung in einem Ein- bis Zweispender vor, um ein Verhältnis im Nachweispuffer zu akzeptieren.

Nachdem Sie die Antikörpermischung vorbereitet haben, geben Sie 30 Mikroliter davon in eine der Vertiefungen in einer 96-Well-Platte. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur. Nach zweistündiger Inkubation lesen Sie die Platte mit dem Antikörpermix auf dem Plattenlesegerät ab.

Verwenden Sie für die Messung das entsprechende HTRF-Optikmodul bei 665 und 620 Nanometern und verwenden Sie 200 Blitze für jede Vertiefung. Zunächst wird eine Insulin-Standardkurve gezeichnet, um die tatsächlichen Werte von Insulin aus den Assay-Proben zu extrapolieren. Die Standardkurve zeigt, dass der erhaltene ratiometrische Fluoreszenzwert in Abhängigkeit von den vordefinierten Standard-Humaninsulinkonzentrationen signifikant ansteigt.

Als nächstes wird das basale Niveau der Insulinsekretion aus den INS-1E-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von 20 Millimolarglukose untersucht. Aus dem Diagramm geht hervor, dass die Zellen in Gegenwart von Glukose etwa 100 Nanogramm pro Milliliter Insulin absondern. Interessanterweise ist der Insulinspiegel mit etwa 15 Nanogramm pro Milliliter in Abwesenheit von Glukose fast halb so hoch.

Als nächstes werden die Zellen in Gegenwart von steigenden Dopaminkonzentrationen mit 20 Millimolar Glukose inkubiert. Das sezernierte Insulin wird auf den Durchschnittswert des prozentualen maximalen Insulins aus jeder Vertiefung normiert. Die Grafik zeigt, dass Dopamin GSIS hemmt, was auf die funktionelle Bedeutung von dopaminergen Rezeptoren in GSIS hinweist.

Diese Grafik zeigt, dass Bromocriptin, ein Typ-2-Diabetes-Medikament, bei der Induktion von GSIS wirksamer ist als Dopamin. Dieses Diagramm zeigt, dass mit zunehmender Konzentration von Chinpirol ein D2-Agonist, obwohl weniger effizient als Bromocriptin, eine ähnliche Wirksamkeit wie Dopamin bei der Stimulierung der GSIS zeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sorgfältig und konsequent zu pipettieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere funktionelle Assays wie der zyklische AMP HDRF-Assay durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. dopaminerge Wirkstoffeffekte auf die nachgeschaltete Signalübertragung. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Stoffwechsels, um andere endokrine sekretorische Signalwege sowohl in immortalisierten Zelllinien als auch in Pankreasinseln zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Insulinsekretion aus Zellen mit HDRF genau messen können.