Identifizierung von Transkription Faktor Olig2 genomische Bindungsstellen in akut PDGFRα + Zellen durch Low-Zelle Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Analyse gereinigt

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die genomweite Bindung des Oligodendrozyten-Transkriptionsfaktors zwei in akut gereinigten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen des Gehirns zu analysieren, indem Immunpanning, Low-Cell-Chromatin-Immunpräzipitation, Hochdurchsatz-Sequenzierung und bioinformatische Datenanalyse durchgeführt werden. Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der genomweiten Transkriptionsregulation und epigenetischer Mechanismen, die eine wichtige Rolle bei der Zelldifferenzierung und -entwicklung spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie bei der ChIP-seq anderer Transkriptionsfaktoren mit jedem Zelltyp mit begrenzter Anzahl, einschließlich akut gereinigter Primärzellen ohne Proliferation in vitro, breit anwendbar ist.

Das Verfahren wird von Yanan You, einem Postdoc aus meinem Labor, demonstriert. Sie ist Mitautorin dieser Arbeit. Um die PDGFR-alpha-positiven Zellen auszuwählen, bereiten Sie eine Platte für das Immunpanning vor.

Bereiten Sie zwei weitere Platten für die Depletion von Endothelzellen und Mikroglia vor. Beschichten Sie dann eine 10 Zentimeter große Petrischale mit 30 Mikrolitern Ziegen-Anti-Ratten-Immunglobulin. Rühren Sie dann die Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche der Platte gleichmäßig mit der Beschichtungslösung bedeckt ist.

Lassen Sie die Petrischale über Nacht bei vier Grad Celsius stehen. Als nächstes verdünnen Sie 40 Mikroliter Anti-PDGFR-alpha-Antikörper der Ratte mit 12 Millilitern DPBS, die 0,2 % Rinderserumalbumin enthalten. Waschen Sie anschließend die Immunglobulin G-beschichtete Platte dreimal hintereinander mit 10 Millilitern 1X DPBS.

Inkubieren Sie dann die Immunglobulin-G-beschichtete Platte vier Stunden lang mit PDGFR-alpha-Antikörperlösung bei Raumtemperatur. Geben Sie nach vier Stunden vorsichtig DPBS entlang der Seitenwand der Platte, um die mit Anti-PDGFR-alpha-Antikörpern beschichtete Platte dreimal zu waschen. Berühren Sie nicht die beschichtete Oberfläche der Platte.

Verwenden Sie anschließend 20 Milliliter DPBS mit 2,3 Mikrogramm pro Milliliter BSL-1, um zwei 15 Zentimeter große Petriplatten zwei Stunden lang zu beschichten. Geben Sie nach der Inkubation vorsichtig 20 Milliliter DPBS entlang der Seitenwand der Platte, um die BSL-1-Platte dreimal zu waschen. Berühren Sie nicht die beschichtete Oberfläche.

Nach dem Waschen wird die einzellige Suspension bei 300 mal g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Zentrifugation fügen Sie dem Zellpellet 15 Milliliter Immunpanning-Puffer hinzu. Inkubieren Sie dann die einzelligen Suspensionen aus zwei Mausgehirnen nacheinander auf zwei BSL-1-beschichteten Petrischale.

Lassen Sie die Platten dann 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Rühren Sie die Platte während der Inkubation alle fünf Minuten um. Schwenken Sie dann die Platte vorsichtig, um alle nicht adhärenten Zellen aus der Zellsuspension zu sammeln.

Dann säen Sie die Zellen auf der mit PDGFR-alpha-Antikörpern beschichteten Platte der Ratte aus. Inkubieren Sie die Platte 45 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 45 Minuten den Teller noch einmal schwenken.

Verwerfen Sie dann die Zellsuspension. Spülen Sie die Platte anschließend achtmal mit DPBS aus, um die nicht anhaftenden Zellen zu entfernen. Untersuchen Sie die Platte unter einem Mikroskop.

Geben Sie als Nächstes die Zellablösungslösung auf die mit PDGFR-alpha-Antikörpern beschichtete Platte der Ratte. Inkubieren Sie die Platte dann 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Schütteln Sie in der Zwischenzeit die Platte, um die anhaftenden Zellen zu entfernen, und untersuchen Sie sie unter dem Mikroskop.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal g bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird das Zellpellet mit einem Milliliter OPC-Zellkulturmedium resuspendiert. Zählen Sie dann die Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode in einem Hämozytometer.

Nach der Zählung in einem Hämozytometer werden 20.000 gereinigte OPCs in einen Milliliter OPC-Zellkulturmedium für die ChIP-Reaktion gegeben. Fügen Sie dann 27 Mikroliter 36,5% Formaldehyd bei Raumtemperatur für 10 Minuten hinzu. Dadurch werden die Zellen fixiert.

Geben Sie nach 10 Minuten 50 Mikroliter 2,5 molares Glycin für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf die fixierten Zellen. Die Zugabe von Glycin stoppt die DNA-Protein-Vernetzung. Waschen Sie dann die vernetzten Zellen mit einem Milliliter HBSS-Puffer mit Proteasehemmer-Cocktail.

Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen in einer vorgekühlten Zentrifugenmaschine bei 300 mal g bei vier Grad Celsius. Nach der Vernetzung der gereinigten OPCs sollten die vernetzten Zellen mit eiskalter HBSS-Lösung gewaschen werden, und die restlichen ChIP-Schritte sollten bei vier Grad durchgeführt werden, da der Antikörper sonst die genomische DNA nicht richtig ausfällen kann. Geben Sie dann 25 Mikroliter vollständigen Lysepuffer zum Zellpellet und lassen Sie es fünf Minuten lang auf Eis.

Pipettieren Sie anschließend 75 Mikroliter eiskalten HBSS-Puffer mit Proteasehemmer-Cocktail. Scheren Sie dann das Chromatin des Zelllysats in einem vorgekühlten Beschallungssystem mit fünf Zyklen von 30 Sekunden ein- und 30 Sekunden außerhalb des Programms. Sobald das Chromatin geschert ist, zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 14.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Am Ende der Zentrifugation wird der Überstand aufgefangen. Verdünnen Sie dann 100 Mikroliter des gescherten Chromatins mit dem gleichen Volumen des eiskalten ChIP-Puffers mit Proteaseinhibitor. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter Kaninchen-Anti-Olig2-Antikörper zu 180 Mikrolitern des verdünnten gescherten Chromatins hinzu.

Inkubieren Sie die Röhrchen auf einem rotierenden Rad für 16 Stunden bei vier Grad Celsius und 40 Umdrehungen pro Minute. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter vorgewaschene Protein-A-beschichtete Kügelchen in das ChIP-Reaktionsröhrchen in einem Kühlraum. Auch hier werden die ChIP-Röhren bei vier Grad Celsius für weitere zwei Stunden auf dem rotierenden Rad inkubiert.

Nach zwei Stunden lassen Sie das ChIP-Reaktionsröhrchen eine Minute lang auf dem Magnetgestell. Waschen Sie dann das Bead-Pellet mit 100 Mikrolitern zu je vier Waschpuffern vier Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius. Geben Sie dann 200 Mikroliter Elutionspuffer zum Bead-Pellet

Inkubieren Sie das Reaktionsröhrchen vier Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Sobald die doppelsträngige DNA denaturiert ist, wird das dreisträngige Ende der Einzelstrang-DNA durch Zugabe von alkalischer Phosphatase für Garnelen dephosphoryliert. Fügen Sie dann der einzelsträngigen DNA mit Hilfe der terminalen Desoxynukleotidyltransferase einen Poly-T-Schwanz hinzu.

Als nächstes annehen Sie den DNA-Poly-dA-Primer an das einzelsträngige DNA-Template. Amplifizieren Sie als Nächstes die ChIP-Sequenzbibliothek mit Vorwärts- und Rückwärtsprimern für die Indizierung. Die Anzahl der PCR-Zyklen für die Bibliotheksvorbereitung hängt von der Menge der Ausgangs-DNA ab.

Eine gute Bibliotheksvorbereitung erfordert eine genaue Quantifizierung der eingegebenen DNA-Menge. Zu viele oder zu wenige PCR-Zyklen können die Konzentration der Bibliothek sowie die Komplexität beeinflussen, was zu PCR-Artefakten führt. Verwenden Sie paramagnetische Kügelchen, um die Fragmente im Bereich von 250 bis 500 Basenpaaren aus der PCR-amplifizierten ChIP-Sequenzbibliothek auszuwählen.

Verwenden Sie ein mikrofluidisches Chip-Kapillar-Elektrophoresegerät, um die Qualität der ausgewählten ChIP-Sequenzbibliothek zu überprüfen. Um die Reinheit der immungepanierten OPCs zu bewerten, werden Immunfärbestudien durchgeführt. Bei Verwendung des OPC-Linienmarkers NG2-Antikörpers zeigt sich, dass die Mehrheit der immungepanierten Zellen des PDGFR-alpha-Antikörpers NG2-positiv ist.

Als nächstes wird eine quantitative PCR durchgeführt, um die Anreicherung von PDGFR-alpha zu verifizieren. Das erhaltene Diagramm zeigt eine geringe Expression von Tuj1, einem neuronalen Marker, der auf eine signifikante Anreicherung von PDGFR-alpha im Vergleich zu den dissoziierten Gehirnzellen hinweist. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, die bei allen anderen Markern, wie GFAP, Mog und Mbp, eine geringe Expression zeigen, was auf eine Anreicherung von PDGFR-alpha hinweist.

Anschließend wird die Qualität der ChIP-Sequenzbibliothek analysiert. Das Elektropherogramm stellt einen deutlichen Peak für den Olig2-Transkriptionsfaktor im Bereich von 250 bis 500 Basenpaaren nach Größenauswahl des PCR-Bibliotheksprodukts dar. Hier zeigt das Histogramm die Tag-Klonalität, um die Qualitätskontrollmetriken zu überprüfen, die vor dem Peak-Aufruf erhalten wurden.

Der Balken zeigt an, dass mehr als 90 % der Lesevorgänge nur einer genomischen Stelle zugeordnet sind. Dann wird ein Strangkorrelationsdiagramm erhalten, das einen angereicherten Peak darstellt, der der vorherrschenden Fragmentlänge entspricht. Im Diagramm stellen die roten Linien die Leselänge bei 50 Basenpaaren bzw. die Fragmentlänge bei 130 Basenpaaren dar, was auf qualitativ hochwertige Daten hinweist.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die genomweite DNA-Bindungsstelle von Transkriptionsfaktoren und anderen Proteinen in Primärzellen oder seltenen Zellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre OPCs aus dem Gehirn von Mäusen durch Immunpanning reinigt und wie man ein ChIP-seq-Experiment mit einer geringen Anzahl von Zellen durchführt.