Name: Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Erfahren Sie die kardiale Genbearbeitung in Mäusen mit rAAV-vermitteltem CRISPR zur Wiederherstellung der Dystrophin-Expression. Diese Methode bietet eine vielversprechende Therapiestrategie für dystrophe Kardiomyopathie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.h. wird vom U.S. National Institutes of Health Zuschüsse (R01HL116546 und R01 AR064241) unterstützt.

Die in diesem Protokoll verwendeten Tiere wurden an der Ohio State University Labor Tier Ressourcen entsprechend Tiernutzung Richtlinien gewartet. Alle Tierversuche wurden von den institutionellen Animal Care, Verwendung und Review Committee der Ohio State University genehmigt.
1. Design und Klonen von gRNAs in den CRISPR-Vektor
<ol><li>Wählen Sie 2 gRNAs targeting Dystrophin Intron 20 und Intron 23 (i20 und i23) für SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT und i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (die PAM-Sequenz ist unterstrichen und kursiv). Hinweis: Die Ziel-Sites für i20 und i23 sind etwa 23 Kilo Basenpaare (Kbp) entfernt. Um eine kodierende gen stören, zwei gRNAs Ausrichtung auf den gemeinsamen Exons mit der NNGRRT PAM Sequenz für SaCas9 (vorzugsweise NNGAAT, NNGGGT und NNGAGT) und Entfernung innerhalb 20 Kbp empfohlen.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden PCR-Parameter um zu tempern gRNA Oligos (100 µmol/L) 1 x glühen Puffer (5 x glühen ausgleichslagers enthält 0,5 Mol/L K-Acetat, 150 Mmol/L HEPES-KOH, 10 Mmol/L Mg-Acetat, pH7.4): 95 ° C 10 min 90 Zyklen von 95 bis 59 ° C mit einem 0,4 ° C sinken pro Zyklus für 20 s, 90 Zyklen von 59 bis 32 ° C mit einem Rückgang um 0,3 ° C pro Zyklus für 20 s, 20 Zyklen von 32 bis 26 ° C mit einem Rückgang um 0,3 ° C pro Zyklus für 20 s.</li>
	<li>Verbinden der geglühten gRNA Oligos in der pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA mit BsaI und T4 DNA-Ligase in einer Reaktion (1 µL 50 ng/µL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µL 1 µL geglüht Oligos, 1,5 µL 10 X T4 DNA-Ligase Puffer, 0,5 µL T4 DNA-Ligase BsaI, 10 µL DdH2O ), mit der folgenden Reaktion Bedingung in einem PCR Cycler: 5 Zyklen von [37 ° C 5 min und 16 ° C 10 min.]; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.</li>
	<li>15 µL Ligatur Produkt in 30 µL kompetente Zellen verwandeln, die Zellen in der Agarplatte mit 100 µg/mL Ampicillin und Kultur bei 37 ° C für 24 h-Platte.</li>
	<li>5-10 Kolonien und Kultur in LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin bei 37 ° C, 250 u/min in einem Shaker-Inkubator für ca. 3-4 h abholen.</li>
	<li>Die Kolonien durch PCR-Bildschirm: 10 µL 2 x PCR-master-Mix, 8 µL DdH2O, 1 µL E. Coli Kultur, 1 µL 10 µmol/L U6-Forward Primer, 1 µL i20 oder i23 gRNA-rückwärts-Primer. Die PCR-Radsport-Parameter: 95 ° C 5 min, 35 Zyklen von 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.</li>
	<li>5 mL Kultur der positive Klone durch Hinzufügen von 4 mL frisches LB mittlere containing100 µg/mL Ampicillin und Kultur über Nacht bei 37 ° C, 250 u/min vorzubereiten.</li>
	<li>Das Plasmid DNA mit dem entsprechenden Plasmid Extraktion Kit zu reinigen, und überprüfen Sie das Plasmid von Sanger-Sequenzierung mit der U6-Forward Primer.</li>
	<li>Kultur C2C12 Zellen in DMEM mit 10 % FBS und 1 % ergänzt Pen-Strep bis ~ 70 % Konfluenz zu Testzwecken das Gen Wirksamkeit der Plasmide Bearbeitung zu erreichen.</li>
	<li>Electroporate insgesamt 5 µg SaCas9/gRNA Plasmid Mischung im Molverhältnis 1:1 in 1 x 106 C2C12 Zellen laut Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Ernten Sie nach 48 h nach Transfektion die C2C12 Zellen und extrahieren Sie genomischen DNA.</li>
	<li>Einsatz 100 ng genomischer DNA als Vorlage die PCR-Reaktion für Maus Dystrophin Locus durchführen: forward Primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µL 10 µmol/L), reverse Primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µL 10 µmol/L), 10 µL 2 x Grüne PCR master Mix, 7 µL ddH2O, genomische DNA (1 µL 100 ng). Verwenden Sie PCR Radfahren Bedingungen als 95 ° C 5 min, 35 Zyklen [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.</li>
</ol>(2) rAAV Produktion
<ol><li>Um die Zellen zu Kultur, seed AD293 Zellen auf 20 bis 40 15 cm Gerichte und pflegen in DMEM mit 10 % FBS und 1 % ergänzt Pen-Strep bis hin zu ca. 90 % Konfluenz zur Transfektion.</li>
	<li>Verdünnen Sie 3 Plasmide mit 200 µL reduziert Serum Medium (pro Schale): 1) 10 µg pHelper; (2) 5 µg pXR (rh.74 oder andere Serotypen) und 3) insgesamt 5 µg pX601 i20 und pX601-i23-Gemisch (Verhältnis 1:1). Führen Sie Polyethylenimine (PEI) Transfektion durch Mischen mit 80 µL PEI und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. hinzufügen die Mischung auf die AD293-Zellkulturen in gewissem Sinne tropfenweise.</li>
	<li>Verwenden Sie für AAV Virus Produktion, nach 72 h Post Transfection Schabeisen Zelle, um die Medien und die AD293 Zelle Pellets durch Zentrifugation bei 1100 X g für 10 Minuten zu sammeln.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellets in 15 mL rAAV Lyse Puffer (50 Mmol/L Tris-Base, 150 Mmol/L NaCl, pH 8,5), gefolgt von 3 Gefrier-tau-Zyklen mit abwechselnden Inkubation in flüssigem Stickstoff und 42 ° C Wasserbad. Speichern Sie die Zelle Lysates bei-80 ° C für die zukünftige Bearbeitung, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden.</li>
	<li>Filtern Sie die Nährmedien mit einem 0,45-µm-Filter und fügen Sie eine 40 % PEG8000 in 2,5 Mol/L NaCl, eine Endkonzentration von 8 %. Inkubieren Sie die Mischung bei 4 ° C für 1 h und Zentrifuge bei 1100 X g für 15 min.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie die Pellets in rAAV Lyse Puffer und kombinieren Sie mit Zelle Lysates aus Schritt 2.3, gefolgt von Benzonase (50 U/mL) Behandlung bei 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie der Benzonase behandelt rAAV mit Mischung 1100 X g für 15 min bei 4 ° C, und speichern Sie den überstand (grobe rAAV-Vorbereitung).</li>
</ol>(3) rAAV Reinigung und Konzentration
<ol><li>Laden Sie die grobe rAAV-Vorbereitung auf einer Iodixanol Steigung in einer Ultrazentrifuge Röhre in der folgenden Reihenfolge von oben nach unten: grobe AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15 % Iodixanol, 6 mL 25 % Iodixanol, 5 mL 40 % Iodixanol, 5 mL 58 % Iodixanol. Füllen Sie die leeren Restvolumen des Rohres an der Spitze mit 1 X DPBS.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 230.000 x g in einer Ultrazentrifuge Rotor für 120 min. bei 10 ° C und sammeln Sie 3 – 4 mL der 40 % Steigung Bruch mit den rAAV-Partikeln mit einer 18 G-Nadel zu.</li>
	<li>Verdünnen Sie die rAAV-Partikel mit 1 X DPBS und Zentrifuge mit Hilfe der Zentrifugalkraft Filtereinheit (MWCO 100 kDa). Wiederholen Sie diesen Schritt für 3 - 5 Mal und schließlich die rAAV-Vorbereitung, 300-500 µL zu konzentrieren.</li>
</ol>4. rAAV verschoben
<ol><li>Extrahieren Sie die genomische DNA aus 2 µL konzentriert rAAV, Niederschlag mit 3 M NaOAc in Ethanol und in 20 µL DdH2O. Aufschwemmen</li>
	<li>Die Standardkurve für rAAV Quantifizierung durch serielle Verdünnung des Plasmids pX601 erhalten: 1 x 109, 1 x 108,1 x 107, 1 x 106, 1 x 105 Exemplare in jeweils 10 µL DdH2O. verdünnt DNAase behandelt rAAV Proben als 01:10, 01:50, 1: 100 und 1: 1000.</li>
	<li>RAAV-Titer durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) mit qPCR Kit nach Anweisungen des Herstellers in einem Real-Time PCR System zu bestimmen: 1 µL 10 µmol/L jeweils Fibel (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC und 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µL 2 x PCR-master-Mix, 1 µL verdünnt rAAV Proben und 2 µL DdH2O. laufen die Reaktion mit den folgenden Parametern Radsport: 95 ° C-3 min., 45 Zyklen [95 ° C 5 sec und 61 ° C 20 sec].</li>
</ol>(5) intravenös und intraperitoneale Injektion von rAAVrh.74-CRISPR in Neugeborenen Mdx/Utrophin+ / Mäuse
<ol><li>Immobilisieren Sie die Mdx/Utrophin+ / Maus Welpen (Tag 3) zu, indem man für 1 min auf Eis, und dann mit 1 x 1012 Viruspartikel in 50 µL pro Maus systemisch über einen Retro-Orbital-Ansatz oder eine intraperitoneale Injektion verabreichen.</li>
	<li>Lassen Sie die Mäuse zu erholen und setzen Sie wieder in ihre Heimat Käfige. Zehn Wochen nach rAAV Verwaltung einschläfern Sie die Mäuse durch CO2 Belichtung für Gewebe-Sammlung.</li>
	<li>Snap-Freeze Gewebe für genomische DNA und RNA Gewinnung und Verwendung Kühlung Isopentane in flüssigem Stickstoff, Gewebe mit optimale Arbeitstemperatur für Kryoschneiden zusammengesetzten einzufrieren.</li>
</ol>6. Analyse der Zielgen Ergebnisse bearbeiten
<ol><li>
Genomische DNA-PCR-Analyse
	<ol>
<li>Isolieren Sie die Summe genomischer DNA aus dem Herz-Gewebe von Mdx/Utrophin+ /- Mäuse mit oder ohne rAAV behandelt.</li>
		<li>Verwenden Sie das gleiche Protokoll in Schritt 1.12 für PCR-Analysen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RT-PCR-Analyse Dystrophin Ausdrucksform
	<ol>
<li>Gesamt-RNS aus dem Herz-Gewebe mit dem RNA-Extraktion-Kit nach Anleitung des Herstellers zu extrahieren.</li>
		<li>Reversen Transkription, die gesamte-RNS mit einer RNase-freie DNase vorzubehandeln und 5 µg behandelten RNA als Vorlage für erste Strang cDNA Synthese mit der reversen Transkription-Kit verwenden.</li>
		<li>Verwenden Sie das Produkt der reversen Transkription für RT-PCR-Analyse von Dystrophin Ausdruck mit Dystrophin cDNA Primer: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT und 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Schätzen Sie das Gen Bearbeitung Wirksamkeit von qPCR-Analyse
	<ol>
<li>Schätzen Sie das Gen Bearbeitung Wirksamkeit mittels quantitativer RT-PCR, die Reduktion von Exon 22-haltige Protokolle mit dem forward Primer (Exon 21) zu erkennen: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA und die rückwärts-Primer (Exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Gapdh als Referenz-gen mit dem forward Primer verwenden: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC und die rückwärts-Primer: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.</li>
		<li>Führen Sie die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) mit qPCR Kit nach Anweisungen des Herstellers in einem Real-Time PCR-System und die 2-stufige Reaktionsbedingungen: 95 ° C-3 min., 45 Zyklen von 95 ° C 5 sec und 61 ° C 30 sec.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunfluoreszenz-Färbung Dystrophin Ausdruck zu analysieren
	<ol>
<li>Schneiden Sie die gefrorenen Gewebe mit einem Kryostaten bei einer Dicke von 10 µm. Fix Gefrierschnitte mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur 15 Minuten.</li>
		<li>2 X mit PBS waschen und mit der Blockierung Lösung (10 % Pferd Serum) für 1 h inkubieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Anti-Dystrophin Primärantikörper, bei 4 ° C über Nacht.</li>
		<li>Waschen Sie die Folien mit PBS 3 x 5 min und inkubieren Sie mit fluoreszierenden Sekundärantikörper (1: 500) bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
		<li>Montieren Sie die Folien mit der Eindeckmittel mit DAPI und Bildgebung mit einem inversen confocal Mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. off-Target-Analyse von T7E1 assay
<ol><li>Vorhersagen der potenziellen Ziel-Websites mit Online-CRISPR design-Tools wie z. B. < Http://crispr.mit.edu>.</li>
	<li>Verstärken die genomischen Regionen abdecken oben 5-10 potenzielle Ziel Standorte durch PCR: Genomische DNA 200 ng, 1 µL High-Fidelity-DNA-Polymerase, 5 µL 10-fach Puffer PCR Mischung 1,5 µL 10 µmol/L ortsspezifische vorwärts- und Zündkapseln, total zu 50 µL mit Lautstärke DdH2O.</li>
	<li>Laufen Sie die PCR-Produkte von Elektrophorese, zu extrahieren Sie und zu reinigen Sie die DNA mit einem Gel Extraction Kit. Messen Sie die Konzentration mit Spektralphotometer.</li>
	<li>Heteroduplex-Bildung durch Denaturierung und wieder glühen die gereinigten Amplifikate langsam in den Puffer 2.1 mit einem PCR Cycler zu fördern. Verwenden Sie die gleichen Radsport Bedingungen wie in Schritt 1.2.</li>
	<li>Verdauen Sie die neu geglühten Produkte für 30 min bei 37 ° C mit 0,5 µL T7E1 Enzym zu, und analysieren Sie die Reaktion durch mit 1-2 % Agarosegel Elektrophorese. Hinweis: Der Amplifikate kann auch durch gezielte Tiefe Sequenzierung analysiert werden.</li>
</ol>

<ol><li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+Classification+of+CRISPR-Cas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems.</a> Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163, 759-771 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).</li>
<li>Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+discovery%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell discovery. 3, 17018(2017).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+Effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy.+Nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264(2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+genome+editing+restores+dystrophin+expression+and+function+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice.</a> Mol Ther. 24, 564-569 (2015).</li>
<li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351, 400-403 (2016).</li>
<li>Long, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+germline+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345, 1184-1188 (2014).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351, 403-407 (2016).</li>
<li>Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 6, 6244(2015).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li>
<li>Bengtsson, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+CRISPR%2FCas9+dystrophin+gene+editing+ameliorates+pathophysiology+in+a+mouse+model+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 8, 14454(2017).</li>
<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin%3A+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li>
<li>Nowak, K. J., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy+and+dystrophin%3A+pathogenesis+and+opportunities+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment.</a> EMBO reports. 5, 872-876 (2004).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).</li>
<li>Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+of+MDA+muscle+disease+symposium+on+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).</li>
<li>Spurney, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy+of+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+understanding+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions.</a> Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).</li>
<li>Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8211986">Autopsy analyses of the muscular dystrophies.</a> Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).</li>
<li>McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+in+the+therapy+of+cardiomyopathy+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+medicine%22%5BJournal%5D)">New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy.</a> Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).</li>
<li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approvals%2C+Submission%2C+and+Important+Labeling+Changes+for+US+Marketed+Pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Hosp+Pharm%22%5BJournal%5D)">Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals.</a> Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).</li>
<li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28515510">Eteplirsen.</a> Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse%3A+a+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Function+in+mdx+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).</li>
<li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circ Res. 121, 923-929 (2017).</li>
<li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li>
<li>Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li>
<li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li>
<li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li>
</ol>

Kein Interessenkonflikt besteht.

In diesem Protokoll zeigen wir die Schritte, die zur Erreichung der in Vivo kardiale gen Bearbeitung in postnatale Mäuse mit rAAVrh.74-vermittelte Lieferung von SaCas9 und zwei gRNAs. Wie bereits erwähnt, dieser Ansatz kann verwendet werden, um Dystrophin Ausdruck in Dystrophischen Mäuse wieder herzustellen, wie in unserer Arbeit27beschrieben, aber es könnte auch schnelle reverse Genetik Studien kardial bedingte Gene in Mäusen ohne den langwierigen Prozess der ermöglichen die traditionell...

Die gruppierte, regelmäßig dazwischen, kurze palindromische wiederholende (CRISPR) Technologie stellt die neueste Weiterentwicklung im Genom Engineering und revolutioniert die derzeitige Praxis der Genetik in Zellen und Organismen. CRISPR-basierte Genom-Bearbeitung nutzt einen einzigen Leitfaden RNA (gRNA) eine CRISPR-assoziierten Endonuklease wie CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9) leiten und Cpf1 zu einem genomische DNA-Ziel, die in Folge der Protospacer ergänzt durch die gRNA mit kodiert ein spezifische Protospacer angrenzenden Motiv (PAM)1,2. PAM ist abhängig von der bakteriellen Spezies des Gens Cas9 oder Cpf1. Die am häufigsten verwendeten Cas9-Nuklease abgeleitet von Streptococcus Pyogenes (SpCas9) erkennt eine PAM-Sequenz von NGG, die direkt hinter der Zielsequenz in der genomischen DNA auf Nichtziel-Strang gefunden wird. An der Ziel-Site generieren die Cas9 und Cpf1 Proteine eine Doppel-Strang-Pause (DSB), die dann über intrinsische zelluläre DNA-Reparaturmechanismen einschließlich nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) und unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) Wege3repariert wird, 4. In Ermangelung einer DNA-Vorlage für homologe Rekombination der DSB in erster Linie Reparaturen durch die fehleranfällige NHEJ Weg, die Einfügungen oder Löschungen (Indels) führen kann von Nukleotiden Frameshift-Mutationen verursacht, wenn die DSB in der Kodierung erstellt wurden Region ein gen5,6. So hat das CRISPR-System verbreitet, Verlust der Funktion Mutationen in verschiedenen zellmodellen und ganze Organismen zu entwickeln um die Funktion eines Gens zu untersuchen. Darüber hinaus die katalytisch inaktive Cas9 und Cpf1 wurden entwickelt, um einen transcriptionally und epigenetisch modulieren Ausdruck Ziel Gene7,8.
In jüngerer Zeit, SpCas9 und SaCas9 (abgeleitet von Staphylococcus Aureus) verpackt in recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Vektoren für postnatale gen Korrektur im Tiermodell von menschlichen Krankheiten, insbesondere Duchenne Muskeldystrophie (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD ist eine tödliche X-chromosomal rezessiv-Krankheit verursacht durch Mutationen im DMD -gen, das Dystrophin-Protein16,17kodiert, betrifft etwa 1 in 3500 männlichen Geburten nach Neugeborenen-Screening18 , 19. zeichnet sich durch fortschreitende Muskelschwäche und verschwenden. Die DMD-Patienten verlieren in der Regel die Fähigkeit, zwischen 10 und 12 Jahre alt und sterben der Atemwege und/oder kardiale Versagen im Alter von 20-30 Jahre20gehen. Insbesondere entwickelt Kardiomyopathie > 90 % der DMD-Patienten und stellt die führende Ursache des Todes in DMD-Patienten21,22. Obwohl Deflazacort (ein Anti-Entzündung Medikament) und Eteplirsen (ein Exon-skipping Medizin zum Skippen von Exon 51) vor kurzem für DMD durch die Food and Drug Administration (FDA)23,24, keine dieser Behandlungen genehmigt wurden den genetischen Defekt auf der genomischen DNA-Ebene zu korrigieren. Die MDX-Maus, die eine Punktmutation in Exon 23 das Dystrophin-gen trägt, wurde weithin als eine DMD Modell25eingesetzt worden. Darüber hinaus haben wir zuvor gezeigt, dass funktionelle Dystrophin Ausdruck durch-Frame Löschen der genomic DNA für Exons, 21, 22 und 23 in der Skelettmuskulatur Mdx Mäuse mit intramuskulären Ad-SpCas9/gRNA9 wiederhergestellt wurde , und in der Herzmuskulatur Mdx/Utrophin+ /- Mäuse mit intravenöser und intraperitonealer rAAVrh.74-SaCas9/gRNA Lieferung26.
In diesem Protokoll beschreiben wir im Detail jeden Schritt bei der postnatalen kardiale gen Bearbeitung um Dystrophin in Mdx/Utrophin+ /- Mäuse mit rAAVrh.74-SaCas9/gRNA Vektoren von gRNA Design Dystrophin-Analyse in den Herz-Muskel-Abschnitten wiederherzustellen.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 555 Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21428</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase-Nuklease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Sicherheitswerkbänke</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1347</td><td>1300 Serie A2 Klasse II, Typ A2</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>RO535S Kompetente</td><td></td></tr><tr><td>Zellen</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td>200314</tr><tr><td>Zellkulturschalen, 150 mm</td><td>Nest Scientific USA</td><td>715001</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Leica CM3050S</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Corning cellgro</td></tr><tr><td>Dystrophin Antikörper</td><td>Spring Bioscience</td><td>E2660</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47111</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>Filtereinheit, 0,45 μm m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Plasmid-Mini-Kit</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47102</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Abcam</td><td>ab139501</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 2239 Wasserbad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-460-11Q</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Wärmeblock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Inversmikroskop</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>LSM 780</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480 Instrument II</td></tr><tr><td>Großraumzentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-910</td><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002445</td><td>Sorvall Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>Nanodrop-Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>NanoDrop&trade 2000/2000c</td></tr><tr><td>Oligos für i20-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC</td></tr><tr><td>Oligos für i20-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td></tr><tr><td>Oligos für i23-F</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC</td></tr><tr><td>Oligos für i23-R</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>GACCTTTCCCTCTCTCGGTGc</td></tr><tr><td>Oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510-1kg-F</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Seal Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>342414</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR-Kits</td><td>Alkali Scientific</td><td>QS2005</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transkriptionskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>337922</td><td>Typ 70Ti</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>New England BioLabs Inc</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Biorad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>8043-30-1192</td><td>Optima le-80k</td></tr><tr><td>Ultra Zentrifugalfiltereinheit</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

adeno-assoziierten virus-vermittelte lieferung von crispr für kardiale gen bearbeitung bei mäusen

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Die gruppierte, regelmäßig dazwischen, kurze, palindromische wiederholende (CRISPR) System hat Genom Engineering in kultivierten Zellen und Organismen aus einer Vielzahl von Arten erheblich erleichtert. Die CRISPR-Technologie ist auch als neuer Therapeutika für eine Reihe von Krankheiten beim Menschen untersucht worden. Proof-of-Concept-Daten sind sehr ermutigend, wie jüngste Studien, die die Machbarkeit und Wirksamkeit von gen bearbeiten-basierte Therapieansatz für Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) mit einem Mausmodell zeigen. Intravenöser und intraperitonealer Injektion von recombinant Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Serotyp rh.74 (rAAVrh.74) hat vor allem effiziente kardiale Bereitstellung von Staphylococcus Aureus CRISPR-assoziierten Protein 9 (SaCas9) und zwei aktiviert. Guide RNAs (gRNA) um eine genomische Region mit einem mutierten Codon in Exon 23 der Maus Dmd gen zu löschen. Diese Vorgehensweise kann auch verwendet werden, knock out das Gen des Interesses und ihrer Herzfunktion bei postnatalen Mäusen zu studieren, wenn die gRNA der kodierende Region des Gens ansprechen soll. In diesem Protokoll zeigen wir im Detail, wie rAAVrh.74-CRISPR Vektor zu konstruieren und hocheffiziente kardiale Lieferung bei Neugeborenen Mäusen zu erreichen.

Die Wirksamkeit von gRNAs induzieren die Streichung der Zielregion für genomische DNA sollte in Zellkulturen vor dem Verpacken in rAAV für in vivo Studien ausgewertet werden. Zu diesem Zweck die gRNAs und SaCas9 exprimierenden Konstrukte wurden elektroporiert in C2C12 Zellen und die genomische DNA wurde durch PCR analysiert, mit dem Primer flankieren die Ziel-Sites (Abbildung 1). Ein PCR-Produkt von ~ 500 bp zeigt erfolgreiche Löschung das Ziel genomic DNA au...

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung kardiale gen bearbeiten in Vivo in Mäusen mit rekombinanten Adeno-Associated Virus (rAAV)-Lieferung von CRISPR vermittelt. Dieses Protokoll bietet eine vielversprechende therapeutische Strategie zur Behandlung von Dystrophischen Kardiomyopathie in Duchenne-Muskeldystrophie und kann verwendet werden, um Herz-Kreislauf-spezifische ko in postnatale Mäuse zu erzeugen.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Das übergeordnete Ziel dieses in vivo kardialen Gen-Editing-Protokolls ist es, die Dystrophin-Expression im Herzen von dystrophischen Mäusen unter Verwendung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus rh. 74 mit CRISPR SaCas9 und Guide-RNA-Vektoren wiederherzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Muskeldystrophie zu beantworten, z. B. ob die Geneditierung eine zuverlässige therapeutische Strategie ist, um die Ursache der Kardiomyopathie im Zusammenhang mit der Duchenne-Muskeldystrophie zu behandeln.Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass die Expression des korrigierten Dystrophin-Gens unter seiner endogenen regulatorischen Kontrolle steht und dieser Rettungseffekt dauerhaft ist. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Behandlung anderer genetischer Krankheiten, bei denen die Korrektur des mutierten Gens durch die CRISPR-Cas9-Gen-Editing-Technologie erreicht werden kann. Diese Methode bietet nicht nur Einblicke in die Dystrophin-Wiederherstellung im dystrophischen Herzen, sondern kann auch verwendet werden, um das Gen von Interesse für reverse genetische Studien auszuschalten.Das Verfahren wird von Yandi Gao, einem Techniker aus unserem Labor, vorgeführt. Das richtige Design der Guide-RNAs oder gRNAs ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Wählen Sie zwei gRNAs, die auf Dystrophin, Intron 20 und Intron 23 abzielen, für das Staphylococcus aureus CRISPR-assoziierte Protein neun.Die an den Protospacer angrenzende Motivsequenz für jede gRNA ist unterstrichen und kursiv geschrieben. Um die gRNA-Oligonukleotide zu annealen, wird eine Reaktion mit 100 Mikromol pro Liter der gRNA-Oligonukleotide in 1x Annealing-Puffer aufgebaut. Verwenden Sie die folgenden PCR-Parameter: 95 Grad Celsius für 10 Minuten, 90 Zyklen von 95 bis 59 Grad Celsius mit einer Abnahme von 0,4 Grad Celsius pro Zyklus für 20 Sekunden, 90 Zyklen von 59 bis 32 Grad Celsius mit einer Abnahme von 0,3 Grad Celsius pro Zyklus für 20 Sekunden und 20 Zyklen von 32 bis 26 Grad Celsius mit einer Abnahme von 0,3 Grad Celsius pro Zyklus für 20 Sekunden.Bereiten Sie sich als Nächstes darauf vor, die geannealten gRNA-Oligonukleotide in einer Reaktion in den CRISP-Vektor zu ligieren. Geben Sie Folgendes in ein Röhrchen: einen Mikroliter 50 Nanogramm pro Mikroliter CRISPR-Vektor, einen Mikroliter getemperte Oligonukleotide, 1,5 Mikroliter 10x T4-DNA-Ligase-Puffer, 0,5 Mikroliter T4-DNA-Ligase, einen Mikroliter Basal und 10 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser. Führen Sie die folgende Reaktion in einem Thermocycler durch: fünf Zyklen von 37 Grad Celsius für fünf Minuten und 16 Grad Celsius für 10 Minuten, 37 Grad Celsius für 20 Minuten und 80 Grad Celsius für fünf Minuten.Wandeln Sie das 15-Mikroliter-Ligaturprodukt in 30 Mikroliter kompetenter Zellen um und plättieren Sie die Zellen auf einer Agarplatte, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält. Kultur bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Am nächsten Tag werden fünf bis 10 Kolonien von der Agarplatte entnommen und in LB-Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin bei 37 Grad Celsius und 250 U/min für drei bis vier Stunden kultiviert.Um die Kolonien durch PCR zu screenen, bereiten Sie Reaktionen vor, die jeweils 10 Mikroliter PCR-Mastermix, acht Mikroliter doppelt destilliertes Wasser, einen Mikroliter E.coli-Kultur, einen Mikroliter U6-Forward-Primer und einen Mikroliter i20- oder i23-gRNA-Reverse-Primer enthalten. Verwenden Sie die folgenden PCR-Zyklusparameter: 95 Grad Celsius für fünf Minuten, gefolgt von 35 Zyklen mit 95 Grad Celsius für 30 Sekunden, 61 Grad Celsius für 30 Sekunden und 72 Grad Celsius für 30 Sekunden. Sobald die positiven Klone identifiziert sind, bereiten Sie eine Fünf-Milliliter-Kultur jedes positiven Klons vor, indem Sie vier Milliliter frisches LB-Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin hinzufügen und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 250 U/min kultivieren.Am nächsten Tag reinigen Sie die Plasmid-DNA mit dem entsprechenden Plasmid-Extraktionskit. Das Plasmid wird anschließend durch Sanger-Sequenzierung mit dem U6-Forward-Primer verifiziert. Um die Wirksamkeit der Geneditierung der Plasmide zu testen, kultivieren Sie C2C12-Zellen in DMEM, die mit 10 % FBS und 1 % Pen-Strep ergänzt wurden, bis die Zellen eine Konfluenz von etwa 70 % erreichen.Elektropotieren Sie insgesamt fünf Mikrogramm SaCas9/gRNA-Plasmidgemisch im molaren Verhältnis von eins zu eins in C2C12-Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers. 48 Stunden nach der Transfektion die C2C12-Zellen ernten und genomische DNA extrahieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie die genomische DNA als Vorlage, um eine PCR für den Dystrophin-Locus der Maus durchzuführen.Richten Sie Reaktionen ein, die den Forward-Primer, den Reverse-Primer, den grünen PCR-Mastermix, doppelt destilliertes Wasser und 100 Nanogramm genomische DNA enthalten. Verwenden Sie die gleichen PCR-Bedingungen wie für das Screening positiver Klone. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie das rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) vor, wie im Textprotokoll beschrieben.Verabreichen Sie am dritten Tag MDX-Mauswelpen mit Viruspartikeln systemisch über eine intraperitoneale Injektion. Lassen Sie die Mäuse sich erholen und setzen Sie sie wieder in ihre Käfige. 10 Wochen nach der Verabreichung von rAAV entnehmen Sie Gewebe von den Mäusen.Frieren Sie das Gewebe für die genomische DNA- und RNA-Extraktion ein und verwenden Sie gekühltes Isopentan in flüssigem Stickstoff, um Gewebe mit optimaler Schnitttemperatur für die Kryosektion einzufrieren. Beginnen Sie das Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll, indem Sie die gefrorenen Gewebeschnitte fünf Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixieren. Waschen Sie die Gewebeabschnitte nach 15 Minuten zweimal mit PBS.Eine Stunde lang mit Blockierlösung bei Raumtemperatur inkubieren. Inkubieren Sie anschließend mit dem Anti-Dystrophin-Primärantikörper bei vier Grad Celsius über Nacht. Waschen Sie die Objektträger am nächsten Morgen mit PBS und inkubieren Sie sie anschließend eine Stunde lang mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur.Montieren Sie die Objektträger mit einem Eindeckmedium mit DAPI und fotografieren Sie mit einem inversen konfokalen Mikroskop. Die Wirksamkeit der gRNAs bei der Induktion der Deletion der genomischen Ziel-DNA-Region in Zellkulturen wurde mittels PCR untersucht. Ein PCR-Produkt von etwa 500 Basenpaaren zeigt eine erfolgreiche Deletion der genomischen Ziel-DNA infolge der Geneditierung an, während die Kontrollzellen keine Bande ergeben sollten.Sobald die Wirksamkeit der gRNAs in Zellkulturen bestätigt wurde, werden die gRNAs in rAAV verpackt. Die rAAV-Viruspartikel werden mit SDS-PAGE gereinigt und die Reinheit analysiert. Das Vorhandensein von nur drei Banden, die den drei Kapsidproteinen entsprechen, deutet auf eine hohe Reinheit hin.Diese repräsentativen Immunfluoreszenzbilder von Herzschnitten von Wildtyp-, mdx- und mdx-Mäusen, die mit AAV SaCas9 gRNA behandelt wurden, zeigen systemisch, dass AAV SaCas9 gRNA die Dystrophin-Expression in dystrophischen Mäusen wiederherstellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie in vivo kardiale Gen-Editierungen bei postnatalen Mäusen mit rAAV rh durchführen können. 74-vermittelte Abgabe von SaCas9 und gRNAs.

adeno-associated-virus-mediated-delivery-crispr-for-cardiac-gene

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

In diesem Video demonstrieren wir die rekombinante Adeno-assoziierte Virus-basierte Genabgabe im Maus-Welpen. Diese Methode hilft bei der Untersuchung der Genexpression in den Zielzellen.

Rekombinante Adeno-assoziierte virusbasierte Genverabgabung: Eine Technik für die transgene Verabreichung und kardiospezifische Expression im Nagetiermodell

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

In diesem Manuskript wird eine Methode zur Herstellung rekombinanter Adeno-assoziierter Virus 9 (rAAV9) Vektoren zur Manipulation der Genexpression im Mausherz beschrieben.

Herstellung von rAAV9 überexprimiert oder Sturz Gene in Mäuseherzen

Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System bietet ein viel versprechendes Instrument für Gentechnik und eröffnet die Möglichkeit, gezielte Integration der transgene. Wir beschreiben eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie für effiziente DNA Integration in Vivo gezielte und gezielte Gentherapien verwenden CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.

Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Für das Verständnis von Neoplasie ist die Entwicklung von murinen Modellen mit spezifischen Genen erforderlich, die bei Kopf- und Nackenkrebspatienten mutiert sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vitro-Transformation von primären murinen Zungenzellen unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus-Cas9-Systems vor, um murine HNC-Zelllinien mit spezifischen genomischen Veränderungen zu erzeugen.

In Vitro Einrichtung einer gentechnisch veränderten Murine Kopf- und Halskrebszelllinie mit einem Adeno-assoziierten Virus-Cas9-System

In diesem Protokoll beschreiben wir die technischen Verfahren zur Erzeugung von braunem Fettgewebe (BAT)-spezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV) Single-Guide RNA (sgRNA)-Systems. Die beschriebenen Schritte umfassen das Design der sgRNAs, die Herstellung der AAV-sgRNA-Partikel und die Mikroinjektion von AAV in die BAT-Lappen.

Generierung von braunfettspezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems

Dieses Protokoll stellt einen optimierten Ansatz zur Herstellung genetisch veränderter Rattenmodelle dar. Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wird verwendet, um eine DNA-Reparaturvorlage zu liefern, und die Elektroporation wird verwendet, um CRISPR-Cas9-Reagenzien zu verabreichen, um den Genom-Editierungsprozess im 2-Zell-Embryo abzuschließen.

CRISPR-Cas9 Genom-Editierung von Rattenembryonen mit Hilfe des Adeno-assoziierten Virus (AAV) und der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen

Dieser Bericht beschreibt die lokalisierte Injektionsmethode von AAV-Vektoren über das Nierenbecken für einen effektiven und sicheren Gentransfer in die Mausniere.

Effektive und sichere Genabgabe an die Mausniere durch langsame retrograde Injektion von Adeno-assoziierten Virusvektoren in das Nierenbecken

Erfahren Sie die kardiale Genbearbeitung in Mäusen mit rAAV-vermitteltem CRISPR zur Wiederherstellung der Dystrophin-Expression. Diese Methode bietet eine vielversprechende Therapiestrategie für dystrophe Kardiomyopathie.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

Weitere Videos entdecken