Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Prozess des Elektronentransports in der Transplasmamembran in Echtzeit durch spektrophotometrische Assays zu überwachen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Radoxbiologie zu beantworten, die sich auf den Mechanismus des Elektronentransports der Transplasmamembran beziehen und darauf, wie die Redoxumgebung einer Zelle aufrechterhalten wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich bei dem Assay um einen spektrophotometrischen Echtzeit-Multiwell-Schnelltest handelt.

Zu Beginn setzen Sie die C2C-12-Adhärenzzellen zweimal 10 bis zu den 4. Zellen pro Quadratzentimeter in den Reihen A bis F einer 96-Well-Platte und bedecken Sie dann die Zellen mit Wachstumsmedien. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nach 24 Stunden in Kultur aspirieren Sie das Wachstumsmedium, waschen es mit 150 Mikrolitern PBS, ersetzen es durch Differenzierungsmedium und inkubieren die Zellen für weitere 24 bis 48 Stunden.

Bereiten Sie als Nächstes einen Vorrat an WST-1- und PMS-Lösungen vor. Stellen Sie eine 10 millimolare Stammlösung von WST-1 her, indem Sie 033 Gramm WST-1 in fünf Millilitern PBS auflösen. Wirbeln Sie dann die Lösung.

Bereiten Sie dann die Stammlösung von PMS vor, indem Sie 0023 Gramm PMS in 1,5 Millilitern ionisiertem Wasser auflösen. Vortex die Lösung. Um die Arbeitslösung herzustellen, fügen Sie PBS Glukose hinzu, um 11,4 Milliliter einer fünf Millimolaren Glukoselösung herzustellen.

Zu dieser Lösung werden 480 Mikroliter der WST-1-Stammlösung für eine Endkonzentration von 400 mikromolaren WST-1 und 48 Mikroliter der PMS-Stammlösung für eine Endkonzentration von 20 mikromolaren PMS hinzugefügt. Wirbeln Sie die Lösungen zum Mischen ein. Teilen Sie dann die Lösung in zwei Sechs-Milliliter-Aliquoten.

Je nach Assay fügen Sie die hier beschriebenen relevanten Komponenten hinzu. Mit den nun vorbereiteten Lösungen aspirieren Sie das Differenzierungsmedium aus den Zellen und waschen sie einmal mit 150 Mikrolitern PBS. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 100 Mikroliter aus Aliquot eins in die Spalten eins bis sechs hinzu.

Und fügen Sie 100 Mikroliter von Aliquot zwei zu den Spalten sieben bis 12 der 96-Well-Platte hinzu. Legen Sie die 96-Well-Platte in ein Plattenlesegerät und messen Sie die Absorptionswerte eine Stunde lang alle 10 Minuten bei 438 Nanometern. Nach der abschließenden Messung aspirieren Sie das Medium und waschen Sie jede Vertiefung mit 150 Mikrolitern PBS.

Aspirieren Sie dann das PBS. Berechnen Sie für die Analyse die Änderung der Extinktion für jede Vertiefung, indem Sie die anfängliche Absorption für die Vertiefung von der Absorption zu einem späteren Zeitpunkt für dieselbe Vertiefung subtrahieren. Korrigieren Sie diese Änderung basierend auf der Änderung der Absorption, die in den Hintergrundvertiefungen beobachtet wird.

Sobald der Hintergrund korrigiert ist, normalisieren Sie die Absorptionsdaten auf die 60-minütigen Kontrollmessungen. Alternativ können Sie mit einem Standard-BCA-Protein-Assay nach dem Proteingehalt in jeder Vertiefung normalisieren. Quantifizieren Sie abschließend die Daten, um die Menge der WST-1-Reduktion um Mikrogramm Protein zu erhalten.

Um mit dem DPIP-Reduktionsassay zu beginnen, züchten und differenzieren Sie C2C-12-Adhärenzzellen, wie für den WST-1-Reduktionsassay gezeigt. Als nächstes bereiten Sie eine Stammlösung her, die 10 millimolare DPIP enthält, indem Sie 029 Gramm DPIP in 10 Millilitern des ionisierten Wassers auflösen. Wirbeln Sie dann die Lösung ein.

Bestätigen Sie die Konzentration, indem Sie die Extinktion der Lösung bei 600 Nanometern mit einem Spektralphotometer messen. Um die Arbeitslösung herzustellen, fügen Sie 120 Mikroliter der 10 Millimolaren DPIP-Stammlösung zu 11,88 Millilitern einer fünf Millimolaren Lösung aus Glukose und PBS hinzu, um eine endgültige DPIP-Arbeitskonzentration von 100 Mikromolar zu erhalten. Wirbeln Sie dann die Lösung.

Teilen Sie dann die Lösung in zwei Sechs-Milliliter-Aliquote. Je nach Assay fügen Sie die hier beschriebenen relevanten Komponenten hinzu. Mit den nun vorbereiteten Lösungen aspirieren Sie das Differenzierungsmedium aus den Zellen und waschen sie einmal mit 150 Mikrolitern PBS.

Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 100 Mikroliter von Aliquot eins in die Spalten eins bis sechs und 100 Mikroliter von Aliquot zwei in die Spalten sieben bis 12 der 96-Well-Platte hinzu. Legen Sie die 96-Well-Platte in einen Plattenleser und messen Sie die Absorptionswerte eine Stunde lang alle 10 Minuten bei 600 Nanometern und analysieren Sie die resultierenden Werte, wie in der WST-1-Reduktionsassay-Analyse beschrieben. Bereiten Sie zunächst zwei Lösungen vor.

Bereiten Sie zunächst sechs Milliliter 400 mikromolare WST-1 und 20 mikromolare PMS in PBS vor. Bereiten Sie dann sechs Milliliter einer 100-mikromolaren Lösung von DPIP und PBS vor. Bereiten Sie die erste 96-Well-Platte vor, indem Sie 100 Mikroliter einer WST-1/PMS-Lösung in einer flachen Bodenplatte in Abwesenheit von Zellen in die Reihen A bis D geben, und messen Sie die Absorption in einem Spektralphotometer bei 438 Nanometern.

Bereiten Sie dann eine zweite 96-Well-Platte vor, indem Sie 100 Mikroliter der DPIP-Lösung in einer flachen Bodenplatte in Abwesenheit von Zellen in die Reihen A bis D geben, und messen Sie die Absorption im Spektralphotometer bei 600 Nanometern. Geben Sie als Nächstes einen Mikroliter 10 Millimolar Ascorbat in die Hälfte der Vertiefungen, um eine Endkonzentration von 100 Mikromolar zu erreichen. Überwachen Sie die Absorption in der Platte, bis sie sich stabilisiert hat.

Wiederholen Sie danach den Vorgang mit DPIP. Bestimmen Sie nach der Stabilisierung, ob es sich bei den erzeugten Elektronenakzeptoren um Substrate handelt. Für Ascorbatoxidase für Superoxid-Dismutate, indem entweder Ascorbatoxidase oder Superoxid-Dismutate zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Absorptionsänderung eine Stunde lang überwacht wird.

Um den Elektronentransport der Transplasmamembran zu überwachen, wurde Ascorbatoxidase verwendet, um die Auswirkungen der Ascorbat-vermittelten Reduktion zu blockieren, und Superoxiddismutase wurde verwendet, um die Superoxid-vermittelte Reduktion zu blockieren, um zu bestimmen, welcher Anteil der WST-1-Reduktion auf jede Komponente zurückzuführen ist. Durch die Zugabe von Ascorbatoxidase wurde die WST-1-Reduktion um etwa 30 % unterdrückt, was darauf hindeutet, dass etwa 30 % des Elektronentransports der Transplasmamembran auf den Export von Ascorbat zurückzuführen waren. Durch die Zugabe von Superoxiddismutase wurde die WST-1-Reduktion um etwa 70 % unterdrückt, was darauf hindeutet, dass etwa 70 % des Elektronentransports der Transplasmamembran auf die extrazelluläre Superoxidfreisetzung zurückzuführen waren.

Um festzustellen, ob ein reduzierter DPIP ein Substrat für Ascorbatoxidase oder Superoxiddismutase ist, wurden die DPIP-Spiegel mit Ascorbinsäure reduziert. Nach 20 Minuten wurde Ascorbatoxidase zugegeben und die Absorption überwacht. Die Wiederfindung zeigt, dass ein reduzierter DPIP ein Substrat für Ascorbatoxidase ist.

Wenn Superoxiddismutase hinzugefügt wurde, wurde DPIP ebenfalls reoxidiert, wenn auch langsamer; daher ist ein reduzierter DPIP ein Substrat für diese Enzyme und kein geeigneter extrazellulärer Elektronenakzeptor, der mit diesen Enzymen verwendet werden kann. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Reagenzien jeden Tag frisch zu machen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Redoxbiologie, um den Elektronentransport der Transplasmamembran in einer Vielzahl von Zelltypen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Elektronentransport der Transplasmamembran mit extrazellulären Elektronenakzeptoren misst und wie man bestimmt, ob der Elektronenakzeptor ein Substrat für Enzyme sein könnte, die im Assay verwendet werden.