Name: Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Lernen Sie die 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Phagozytose in residenten Peritoneal-Makrophagen der Maus mit Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung einzelner Phagozytose-Ereignisse.

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Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse HA 3271/4-1 und HA 3271/4-2 von der DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) und die FF-2016-05 Stipendium EXC 1003 (Cluster of Excellence 1003), Zellen in Bewegung (CiM), DFG unterstützt.

Die Protokolle folgen den Leitlinien unserer lokalen Humanforschung Ethik-Kommission sowie die Tierpflege-Richtlinien.
1. Isolation von Resident Maus peritonealen Makrophagen
<ol><li>Opfern Sie die Maus (3 – 4 Monate alt (beiderlei Geschlechts); z.b. C57BL/6 Stamm) mit einer Überdosis des volatilen Anästhetikums Isofluran (> 5 % in Luft) oder Kohlendioxid13, gefolgt von zervikale Dislokation. Induktion der Anästhesie kann leicht durch Verlust der aufrichtenden reflex14sowie durch Verlust der Pfote Rückzug Reflex beurteilt werden.</li>
	<li>Nach der Reinigung des Bauches der Maus mit 80 % Ethanol in Wasser stellen einen Mittellinie Hautschnitt und Aussetzen der zugrunde liegenden Bauchwand.</li>
	<li>Legen Sie einen 24-G Kunststoff-Katheter in die Peritonium und Lavage der Hohlraum mit 2 x 4,5 mL eiskaltes Hank gepufferte Salzlösung (HBSS) ohne Ca2 + und Mg2 +über eine 5 mL kunststoffspritze. Während der Injektion, verlassen ca. 0,5 mL residual HBSS (5-4,5 mL (injiziert) = 0,5 mL) in der Spritze im Fall Gewebe in der Spitze des Katheters gesaugt und muss ausgeschlossen werden. Übertragen Sie die angesaugte Aussetzung in eine 14 mL Polypropylen Rundboden Röhrchen und Zentrifuge bei 300 X g 6,5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Die Spitze des Katheters Kunststoff ist stumpf, die im Vergleich zu einer Nadel, minimiert Verletzungen des Abdominal-Inhalts. In der Regel folgende sanfte Bauchmassage, 8 mL peritonealen Zellsuspension aus der Bauchhöhle abgerufen werden kann.</li>
	<li>Den überstand verwerfen und die peritonealen Zellen in 1 mL Bikarbonat-freie RPMI 1640 Medium mit 20 mM Hepes, 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum und Antibiotika wie Penicillin (100 Einheiten/mL) und Streptomycin (100 µg/mL), vorbereitet durch Aufschwemmen 100 X Penicillin/Streptomycin 1: 100 Verdünnung. Dadurch werden in der Regel eine Konzentration von etwa 6 x 106 Zellen/mL. Hinweis: Etwa 30 % der isolierten peritonealen Zellen sind Makrophagen, während der andere (kleineren) Zellen Lymphozyten, überwiegend B-Zellen sind.</li>
</ol>2. Aussaat von peritonealen Zellen im Kanal gleitet
<ol><li>
Nach dem pipettieren der Zellsuspension rauf und runter zur Reduzierung Verklumpung, pipette 100 µL Aussetzung in den vorgefüllten Kanal (Volume, 100 µL) einen Kanal Fibronektin-beschichtete Folie (100 µL Kanal hat die Abmessungen (Länge x Breite x Höhe): 50 x 5 mm 0,4 mm).
	<ol>
<li>Vorausfüllen von der Kammers durch eines der beiden Stauseen der Kanal Folie 1 mL Serum ergänzt RPMI 1640 (Hepes) Medium hinzufügen, kippen die Folie und dann Absaugen des Mediums aus dem nachgeschalteten Reservoir (Abbildung 1).<ol>
<li>Entfernen Sie unerwünschte Luftblasen, oder lange Streifen von Luft in den Kanal durch Hinzufügen 1 – 2 mL Medium auf eines der beiden Stauseen, fest Anwendung ein Deckel und dann Abpumpen der Luft durch rhythmische Daumendruck auf die Kappe und, wo nötig, kippen die Folie. Nach Vertreibung Luft, kippen Sie die Folie mit der nicht begrenzten Reservoir (und Medium enthalten) nach unten vor dem Entfernen der Kappe zur Vermeidung von Luft, zurück in den Kanal gesaugt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kanal-Folie ausgesät mit Zellen in einer feuchten Kammer für 2 h bei 37 ° C in der Abwesenheit von CO2 (CO2 ist nicht erforderlich, da die HCO3-Co2 -Puffer-System wird durch Hepes ersetzt). Die Kanal-Folien können bequem auf einem Gestell enthält acht Folien platziert werden. In der Regel sind 6 – 8 Dias von einem Mausklick bereit, obwohl bis zu 10 oder mehr möglich ist.</li>
	<li>
Entfernen Sie den Ständer und tauschen Sie das RPMI 1640 (Hepes) Medium in jede Folie für RPMI 1640 Medium enthält Bikarbonat, mit 10 % fötalen Rinderserum sowie Penicillin/Streptomycin ergänzt.
	<ol>
<li>Kippen Sie die Folie und Aspirieren Sie Medium zuerst aus der untere Behälter und dann aus dem oberen Becken. Als Nächstes fügen Sie 1 mL des neuen Mediums zu einem der Stauseen, kippen Sie die Rutsche und aspirat Medium aus dem nachgeschalteten Reservoir zu, nachdem es durch den Kanal geflossen ist.</li>
		<li>Füllen Sie nach dieser Waschschritt (Datenträgeraustausch) die Kanal-Folie durch Zugabe von 1 mL Medium zu einem der Stauseen. Hinweis: Waschschritten mit Kanal-Folien ist sehr einfach und effektiv im Hinblick auf die Lösung Austausch und nicht anhaftende Zellen entfernen. Beachten Sie, dass das Medium RPMI 1640 (Bicarbonat) normalerweise vorher inkubierten mit 5 % CO2 über Nacht um Wärme- und pH Gleichgewicht zu gewährleisten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Am folgenden Tag durchführen Sie Experimente.</li>
</ol>3. Isolation der menschlichen Erythrozyten
<ol><li>Am Tag 2 (zweite Tag der Experimente; nach der Übernachtung Inkubation von isolierten peritonealen Makrophagen), 1 – 2 mL peripheren venösen Blut eines gesunden Spenders in einer heparinisierten Röhrchen zu sammeln. 1 mL zu einem Rundboden 2,0 mL (Polypropylen) Microcentrifuge Schlauch, Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 18 ° C (empirische Einstellung) zu übertragen, und den überstand (Plasma und buffy Coat) zu entfernen.</li>
	<li>Vorsichtig Aspirieren Sie 100 µL sedimentierten Erythrozyten und mischen Sie diese Band 1:1 mit modifizierten RPMI 1640 (Hepes) Medium (siehe unten) in einem Rundboden 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch. Beschriften Sie das Rohr "1:1". Hinweis: Das Medium RPMI 1640 (Hepes) am 2. Tag (für Assays) nach Zellen zu isolieren enthält, zusätzlich 10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, Penicillin (100 Einheiten/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und 1 mM N-(2-Mercaptopropionyl) Glycin (zu reduzieren Phototoxizität). Im folgenden wird dieses Medium als "modifizierte" RPMI 1640 (Hepes) Medium bezeichnet.</li>
	<li>4 µL der 1:1 verdünnt erythrozytensuspension in 2 mL Pipette geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium, vorab zu einem 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch pipettiert (wiederholen Sie diesen Schritt, d. h. Vorbereitung 2 Röhren). Beschriften Sie jedes Rohr "4:2000". Legen Sie die "1:1" und "4:2000" Röhren auf Eis.</li>
</ol>4. Kennzeichnung der Plasmamembran Makrophagen
<ol><li>Entfernen Sie die gesetzte Kanal Folien aus dem CO2 Inkubator und tauschen Sie RPMI 1640 (Bicarbonat) Medium in jede Folie für modifizierte RPMI 1640 (Hepes) Medium. Dann geben Sie die Zellen in einer feuchten Kammer bei 37 ° C in der Abwesenheit von CO2. Hinweis: Nach der Inkubation über Nacht und waschen, sind die meisten der Lymphozyten aus dem Kanal entfernt. Die Mehrheit der verbleibenden adhärenten Zellen sind Makrophagen, die morphologisch oder durch Immunfluoreszenz-Färbung mit Anti-F4/80 Antikörper identifiziert werden können. Etwa die 95 % der Maus resident peritonealen Makrophagen F4/80 positiv.</li>
	<li>Verdünnen Sie fluoreszent grün markierten Anti-Maus-F4/80 Antikörper (bei 4 ° C gelagert) 01:40 in veränderter RPMI 1640 (Hepes) Medium. Nehmen Sie eine Folie, kippen und pipette (tropfenweise) 100 µL der Antikörper-Mischung in die Öffnung des Kanals 100 µL der Folie (siehe Abbildung 1). Aspirieren Sie Medium, das in den nachgelagerten Stausee mündet. Inkubieren Sie die Zellen für 20 min bei 37 ° C (feuchte Umgebung, ohne CO2). Während der Inkubationszeit beschriften Sie die menschlichen Erythrozyten (siehe Abschnitt 5). Hinweis: Wie oben erwähnt, CO2 ist nicht erforderlich da die HCO3-Co2 -Puffer-System wird durch Hepes ersetzt.</li>
	<li>Nach 20 min Inkubationszeit (während die menschlichen Erythrozyten gebeizt und opsonized sind), waschen die Folie durch Zugabe von 1 mL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium zu den Stauseen und das Medium absaugen, nachdem es durch den Kanal geflossen ist durch erleichtert kippen die Folie. Fügen Sie 1 mL Medium für eine kurzfristige Speicherung oder fahren Sie mit einem Experiment (d. h. pipettieren in Partikel (opsonized rote Blutkörperchen) und imaging Phagozytose von Time-Lapse drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopie).</li>
</ol>5. Kennzeichnung der Plasmamembran der menschlichen Erythrozyten
<ol><li>Beginnen Sie, die Kennzeichnung der menschlichen Erythrozyten unmittelbar nach der Inkubation einer Folie von Makrophagen mit grünen eindringmittel beschriftete Anti-F4/80 Antikörper (nach Abschnitt 4.2). Nach schonendes mischen, 400 µL von einer der "4:2000" Röhren (siehe Abschnitt 3.3) zu nehmen und zu einem (Rundboden) 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch zu verzichten. Planen Sie Zeit für die Aussetzung auf etwa 37 ° C erwärmen (siehe Abschnitt unten). 0.4 µL Orange/rot fluoreszierende Plasmamembran Fleck (Aliquote bei-20 ° C gelagert), mischen und bei 37 ° C für 5 min inkubieren. Hinweis: Einen beheizten Aluminiumblock, platziert in der Laminar-Flow-Kapuze, eignet sich zur Minimierung der Wärmeverluste während der Vorbereitung Folien. Rohre können in Bohrbrunnen Heizblock und einem separaten platziert werden, oder integrierte, beheizte Aluminiumplatte dient als ein Arbeitsraum.</li>
	<li>Nach der Inkubationszeit 5 min Vorbereitung der ersten Waschschritt durch Zugabe von 1600 µL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium (um 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch zu füllen).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g für 5 min bei 18 ° C (empirische Einstellung). Ein kompakte rote Pellet sollten an der Wand (d. h. außerhalb der Mitte) an der Unterseite des Rohres sichtbar. Drehen Sie das Rohr, so dass die Kugel nach oben zeigt, und entfernen Sie vorsichtig alle des Überstands nacheinander (in zwei Stufen) mit einer 1 – 1,5 mL PIPETTENSPITZE.</li>
	<li>Nach dem Absaugen des Überstands, durchmischen Sie 2.000 µL geändert RPMI 1640 (Hepes) mittlere, (um die Zellen zu Aufschwemmen), und wiederholen Sie die oben genannten Zentrifugation und überstand Aspiration Schritte.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie das Pellet (der Plasmamembran gebeizt und 2 X gewaschen roten Blutkörperchen) mit 400 µL des modifizierten RPMI 1640 (Hepes) Medium. Beschriften Sie das Rohr PMS (Abkürzung für Plasmamembran Fleck). Hinweis: Alternativ der Succinimidyl Ester eines pH-Sensitive Rhodamin-Derivats, das mehr wird stark Leuchtstofflampen bei sauren pH genutzt werden, um menschliche Erythrozyten zu beschriften. In diesem Fall dient der Fluoreszenzintensität zusätzlich als Maß für die Phagosom Reifung nach Partikel verinnerlicht zu haben.</li>
</ol>6. Opsonization (Beschriftung) der menschlichen Erythrozyten mit Maus Immunglobulin G (IgG)
<ol><li>Fügen Sie 1 µL Maus (IgG2b) monoklonalen (Klon HIR2) Anti-Human CD235a (1 mg/mL) Antikörper (bei-20 ° C gelagert) in das Röhrchen mit der Bezeichnung PMS (siehe Abschnitte 5.2 – 5.5), mit der Plasmamembran gebeizt menschlichen Erythrozyten in 400 µL Medium suspendiert. CD235a (auch bekannt als Glycophorin A) ist ein erythroiden Abstammung-spezifischen Membran Sialoglycoprotein.</li>
	<li>
Inkubation bei 37 ° C für 8 min. Beachten Sie, dass Opsonization der menschlichen Erythrozyten mit IgG Ursachen Agglutination (Verklumpung Zelle). Obwohl Agglutination als eine visuelle Anzeige der Opsonization dienen kann, ist es für die Darstellung der einzelnen phagocytic Effekte unerwünscht. Auf Agglutination umgehen, immer wieder mischen der Zellsuspension (alle 1 min) verwenden, zum Beispiel eine Variable 20-200 µL Volumen Pipette festgelegt zu 200 µL.
	<ol>
<li>Gegen Ende der Inkubationszeit von 8 min wenn gewünscht, waschen die Makrophagen-Folie, mit grün eindringmittel inkubiert beschriftet Antikörper Anti-F4/80, mit 1 mL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium. Sicherstellen Sie, dass die beiden Stauseen der Kanal Folie nach der Waschschritte Medium sind.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. die Phagozytose der Plasmamembran imaging gebeizt und IgG beschichtet menschlichen roten Blutkörperchen
<ol><li>Nach 8 min Inkubation mit Anti-CD235a Antikörper (Abschnitt 6.2), pipette 100 µL Aufhängung mit Plasmamembran gebeizt und IgG opsonized menschlichen roten Blutkörperchen in den Kanal eines Dias mit Makrophagen beschriftet mit grün fluoreszierenden Anti-F4 / 80 Antikörper (Schritt 4). So werden rote Fluoreszenz, IgG-opsonized menschlichen roten Blutkörperchen grün fluoreszierenden Fresszellen (Makrophagen) hinzugefügt.</li>
	<li>Als menschliche Erythrozyten hinzugekommen sind, montieren die Kanal-Folie auf einer drehenden Scheibe confocal Mikroskop (mit der Bühne Inkubator, eingestellt auf 37 ° C) für bildgebende Verfahren, z. B. über ein 60 X / 1,49 Ölimmersion Objektiv. Beginnen Sie imaging-so bald wie möglich, da Partikel beginnen, innerhalb von 1 min. zu begleichen. Hinweis: Wenn Sie fluoreszierende Kügelchen mit einem Durchmesser von 100 nm, wir gemessen, durch Analyse der Punkt verbreitet Funktionen, XY-Auflösungen von X = 0,22 µm, y = 0,23 µm (488 nm Laser) und X = 0,27 µm, y = 0,27 µm (561 nm-Laser). Jedoch um Immunofluoreszenz und Phototoxizität während Zeitraffer 3D-Bildgebung lebender Zellen zu verringern, gefährden wir räumliche Auflösung mit 2 x 2 binning. Binning erhöht die Empfindlichkeit (verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis) und der zulässigen Frame-Rate, aber auf Kosten der räumlichen Auflösung.</li>
	<li>Verwenden Sie einen perfekten Fokus (oder ähnlichen) System Fokus Drift bei Aufnahmen zu verhindern. Nach der Aktivierung der perfekte Fokus-System, verwenden Sie das Offset Steuerelement Fokus auf Makrophagen Lamellipodial Vorsprünge unmittelbar über dem Deckglas (siehe Hinweis unten) von der Kanal-Folie. Dieser Fokus-Ebene entspricht Z = 0 µm. erhalten Z-Stapel von-1 µm bis + 16 µm bei 0,8 µm Schritten die beläuft sich auf 22 Z-Scheiben. Z-Stapel, beispielsweise erzielt werden mit einer Rate von 1 Stapel (für jeden Kanal) alle 15 s für eine Gesamtmenge von 16 Minuten. Hinweis: Längere Aufnahme leiden unter Verlust der Bildqualität, vor allem durch Immunofluoreszenz. Z-Stacks sind für jeden der beiden Kanäle erworben: Makrophagen sind abgebildet mit einem 488 nm Laser (grün-Kanal) und menschlichen Erythrozyten werden mit einem 561 nm Laser (Rot-Kanal) abgebildet. Bei dieser Vorgehensweise erhalten Sie verschiedene Ansichten von Makrophagen, die Einnahme von IgG-opsonized menschlichen roten Blutkörperchen an verschiedenen Zeitpunkten (z. B. siehe Abbildung 2). Hinweis: Die Standardeinstellungen des Systems (mit 2 x 2 binning) sind: grün-Kanal (20,5 % Laser (50 mW; 488 nm) macht, 101 Empfindlichkeit (Bereich 0-255) und 200 ms Belichtungszeit); Rot-Kanal (10,5 % Laser (50 mW; 561 nm) macht, 101 Empfindlichkeit (Bereich 0-255) und 98 ms Belichtungszeit). Hinweis: Die unten auf der Kanal-Folie ist ein Polymer mit der gleichen Dicke wie ein Glas #1.5-Deckglas und die gleichen optischen Eigenschaften des Glases, aber vor allem das Material hat den Vorteil der Gasdurchlässigkeit.</li>
</ol>8. imaging die Phagozytose der Plasmamembran gebeizt und Ergänzung-beschichtete menschlichen roten Blutkörperchen
<ol><li>Ergänzung opsonize Plasmamembran gebeizt und IgG-opsonized roten Menschenblut Zellen ähnlich Abschnitte 5 und 6, außer statt pipettieren 4 µL der 1:1 verdünnt erythrozytensuspension in 2 mL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium, wie in Abschnitt 3.3 beschrieben, Pipette 4 µL in 1 mL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium, und die Röhre 4:1, 000 entsprechend zu kennzeichnen. So sind die menschlichen Erythrozyten 2 X mehr konzentriert.</li>
	<li>Die Schritte in den Abschnitten 4 und 5, aber beginnend mit der 4:1,000 anstatt der 4:2,000 verdünnt bestand der menschlichen Erythrozyten (4:1, 000 und 4:2,000 beziehen sich auf die spätere Verdünnungen von zunächst 1:1 verdünnt menschlichen roten Blutkörperchen in Abschnitten beschriebenen 3.1 und 3.2).</li>
	<li>Opfern einer C5 null Maus (z. B. B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Jackson-Labor) durch (> 5 % in Luft) Isofluran Inhalation gefolgt von Enthauptung und sammeln das Blut. Wir Tropfen in der Regel etwa 0,8 mL Blut in ein Rundboden 14 mL Plastikrohr unmittelbar nach Isofluran Inhalation und Enthauptung.</li>
	<li>Nach 1 h wenn das Blut vollständig koaguliert, übertragen Sie die Restflüssigkeit in einem 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Sammeln Sie anschließend, sorgfältig die gelbliche Serum. In der Regel erholen wir mindestens 200 µL C5 null Serum. Legen Sie das C5 null Serum auf Eis.</li>
	<li>Nach 4 min Inkubation der Plasmamembran menschlichen Erythrozyten mit IgG gebeizt, fügen Sie ein weiteres 1 µL Anti-CD235a Antikörper (mit 2 x konzentriert), und dann nehmen Sie 50 µL Zellsuspension und mischen Sie es in einem separaten 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch mit 50 µL C5 null Serum. Weiterhin wiederholt (alle 1 min) durch pipettieren rauf und runter wie in Abschnitt 6.2 für weitere 4 Minuten mischen. So, nach diesem Schritt haben die menschlichen Erythrozyten mit Anti-CD235a Antikörper für eine Gesamtmenge von 8 min inkubiert worden. Hinweis: Die Inkubationszeit von 4 min mit C5 null Serum genügt zur Aktivierung der klassischen Komplementkaskade und opsonize der menschlichen roten Blutkörperchen mit C3b, die um Faktor ich zu iC3b gespalten ist.</li>
</ol>9. Bestätigung des IgG - und C3b-Opsonization der menschlichen Erythrozyten
<ol><li>
Bestätigen Sie Opsonization der menschlichen Erythrozyten mit Maus Anti-CD235a (IgG2b; siehe Abschnitt 6.1) IgG Antikörper durch Inkubation der Zellen mit Ziege Anti-Maus (sekundären) IgG Antikörper konjugiert, eine grüne oder rote fluoreszierende Fluorophor.
	<ol>
<li>400 µL Aussetzung der menschlichen roten Blutkörperchen 1 µL Maus Anti-CD235a IgG Antikörper und 1 µL eindringmittel beschrifteten Anti-Maus Sekundärantikörper hinzu, und bei 37 ° C 8 min inkubieren. Anschließend waschen Sie zweimal (wie in den Abschnitten 5.2 – 5,5).</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 400 µL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium und Pipette 100 µL der Suspension in einen Kanal für die konfokale Fluoreszenz-Bildgebung schieben (siehe Abbildung 1). Hinweis: Die Zellen werden Büschel (agglutinieren) nach Waschen und Wiederfreisetzung, aber Waschen ist notwendig, um Hintergrundfluoreszenz durch ungebundene Sekundärantikörper zu reduzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bestätigen Sie Opsonization der menschlichen Erythrozyten, vorab mit Maus IgG beschriftet und Ziege Anti-Ratte IgG Antikörper konjugiert mit C5 null Maus Serum mit C3b/iC3b verwenden, zum Beispiel, Ratte Anti-Maus C3b, iC3b/C3c Antikörper und z. B. Sekundärantikörper inkubiert um eine grüne fluoreszierende Fluorophor.
	<ol>
<li>Wiederholen Sie die Schritte in Abschnitt 8 mit ungefärbten menschlichen roten Blutkörperchen.</li>
		<li>Fügen Sie 0,25 µL eindringmittel beschriftet Anti-Maus C3b, iC3b/C3c Antikörper zu 100 µL-Mischung (50 µL IgG-Label menschlichen Erythrozyten + 50 µL C5 null Maus Serum) und bei 37 ° C 8 min inkubieren.</li>
		<li>Zweimal waschen Sie, Aufschwemmen Sie das Pellet in 100 µL geändert RPMI 1640 (Hepes) Medium und Pipette die Aussetzung in einen Kanal für die konfokale Fluoreszenz-Bildgebung schieben (siehe Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die überwiegende Mehrheit der Phagozytose-Assays, vor allem Endpunkt und Hochdurchsatz-Assays, bieten keine Visualisierung von wie Partikel eigentlich eingefangen, eingehüllt und eingenommen werden. Bahnbrechende Studien von Munthe-Kaas Et al. 10 und Kaplan2 in den 1970er Jahren vorgeschlagen, dass auffallend andere Zellskelett Umstrukturierungen in der Phagozytose von IgG-opsonized im Vergleich zu ergänzen opsonized Partikel (Schafe Erythrozyten) beteiligt waren. Hier beschreiben wir Phagozytose Assays mit drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopie die hochauflösenden, Echtzeit-Bildgebung einzelner phagocytic Termine zu ermöglichen. Unser Modell Phagozyten ist die Maus resident peritonealen Makrophagen, die mit minimalen Handling isoliert werden können, und wir verwenden frisch isolierte menschliche Erythrozyten als Partikel. Allerdings könnte die Phagozytose-Assays auf andere Fresszellen, wie Maus Knochenmark stammenden Makrophagen oder Neutrophile, Makrophagen-Zelllinien Maus, menschliche Monocyte abgeleiteten Makrophagen oder menschlichen peripheren Blut neutrophile angewendet werden. Im Falle von menschlichen Fresszellen oder Maus Neutrophilen wäre Alternative eindringmittel beschriftet Antikörper erforderlich, z. B. eindringmittel beschrifteten Anti-CD14 Antikörper (menschlichen Monozyten/Makrophagen)16 oder Anti-Gr-1 (Ly - 6 G) Antikörper (Maus Neutrophile).
Unopsonized menschlichen roten Blutkörperchen, wie traditionell benutzt Schafe Erythrozyten sind inert in dem Sinne, dass diese Zellen nicht (oder zumindest, sehr selten) durch Maus peritonealen Makrophagen aufgenommen werden. Dadurch wird sichergestellt, im Gegensatz zu Polystyrol-Kügelchen, niedrige Hintergrundaktivität. Menschlichen roten Blutkörperchen können bequem opsonized werden, mit Immunglobulinen mit Maus IgG oder IgM monoklonale Antikörper gegen CD235a (Glycophorin A), eine spezifische Marker des menschlichen Erythrozyten (roten Blutkörperchen) und erythroiden Vorläufer17, 18. in parallele Tests eindringmittel beschrifteten Anti-Maus IgG oder IgM Sekundärantikörper können angewendet werden, um Opsonization zu bestätigen. Die IgG und IgM Antikörper-Klassen sind Hemagglutinins, Stoffe (Antikörper), die dazu führen, dass die roten Blutkörperchen zu verbinden. Zur Vermeidung von Agglutination mischen wir zeitweise die Zellsuspension während der Inkubationszeit von 8 min mit Anti-CD235a Antikörper, und dann fügen wir die gemischte Suspension direkt zu einer Makrophagen-haltigen Kanal Folie (Fibronektin-beschichtete Folie) ohne ein Waschschritt . Wash Schritte beinhalten Sedimentation der roten Blutkörperchen durch Zentrifugieren, die Agglutination stark fördert. Vor opsonizing menschlichen Erythrozyten, beschriften wir die Plasmamembran mit lipophilen Orange/rot fluoreszierende Sonde. Diese Sonde ist hell fluoreszierende zu Beginn des Zeitraffer-Aufnahmen, aber das Signal allmählich verblasst, wahrscheinlich vor allem wegen Immunofluoreszenz19. Darüber hinaus können Makrophagen und Fibronektin Beschichtung der Folie schwach Orange/rot fluoreszierende während Aufnahmen geworden. Dieses Problem ist vermutlich durch unzureichende Waschung der menschlichen Erythrozyten nach Kennzeichnung. Anstelle eines lipophilen fluoreszierende Plasmamembran Markers könnte menschlichen Erythrozyten mit einem pH-Sensitive Rhodamin-Derivat mit seiner Amine reaktive Succinimidyl Ester15,20beschriftet werden. Dies hat den Vorteil, dass Visualisierung von Phagosom Reifung da Fluoreszenzintensität nimmt mit abnehmendem pH-Wert15,20, aber dieser Ansatz hat den Nachteil, die reaktiven Ester Vorbereitungen derzeit teuer und nach der Rekonstitution in wässrigen Medium instabil.
IgG-opsonized menschlichen roten Blutkörperchen werden über FcγRs, die bestätigt werden kann, dass mit peritonealen Makrophagen von NOTAM21 oder Fcer1g- / - (Fcer1g Ko) Mäusen isoliert gegessen. NOTAM Makrophagen IgG opsonized menschlichen roten Blutkörperchen zu binden, aber es fehlt ITAM (Immunoreceptor Tyrosin-basierte Aktivierung Motiv) - vermittelten Signalisierung benötigt, Phagozytose, induzieren, während Fcer1g ko-Makrophagen Oberfläche FcγRs. IgG nicht ausdrücken - oder IgM-opsonized menschlichen roten Blutkörperchen können zusätzlich mit C3b (die zu iC3b gespalten wird) durch Inkubation der Zellen mit frisch isolierte Serum von einer Ergänzung C5 null Maus opsonized werden (Wildtyp Serum bewirkt Hämolyse). Opsonins IgG und IgM Aktivieren der klassischen Komplementkaskade, die zur Bildung von Poren (Membran-Angriffs-komplexe) und Lyse der Zelle führt. In Mäuse Ergänzung C5 fehlt, geht der Komplementkaskade Ergänzung C3 Spaltung, aber C5-Konvertase fehlt das Substrat erforderlich, um den terminal Weg zu katalysieren. Wir entwickelten einfache Tests zur Messung der Kinetics der Komplementkaskade. Kurz gesagt, kann menschliche Erythrozyten Co beschriftet mit einem rot fluoreszierende, Plasmamembran Marker und das grün fluoreszierende, cytosolischen Fluorophor. Nach Gründung des Membran-Angriffs-Komplex, durch Ergänzung Komponenten C5-C9 gebildet, die cytosolische Fluorophor ist schnell (in Sekunden) aus dem Zytosol verloren. Visualisierung der Effektor (Zytolyse) Funktion der Komplementkaskade darauf hingewiesen, dass 4 min Inkubationszeit für C3b/iC3b Opsonization der menschlichen Erythrozyten ausreicht. In parallel-Assays kann eindringmittel Sekundärantikörper C3b/iC3b Beschichtung der menschlichen Erythrozyten leicht nach der Anwendung einer Mischungaus aus Anti-Maus C3b bewertet und gekennzeichnet werden. In diesem Fall muss ein Waschschritt ungebundenen fluoreszierende Antikörper zu entfernen. Obwohl der Waschschritt Zelle Sedimentaion durch Zentrifugation, die Agglutination fördert beinhaltet, kann erfolgreich Opsonization leicht durch konfokale Mikroskopie bewertet werden. Komplement-Rezeptor-vermittelten Phagozytose kann durch jede Anwendung IgG - abgebildet / iC3b opsonized roten Menschenblut Zellen NOTAM oder Fcer1g- / - Makrophagen oder durch die Einführung von IgM- / iC3b opsonized roten Menschenblut Zellen zu Wildtyp Makrophagen. IgM-opsonized Blutkörperchen werden von der ITAM-haltigen FcγRs (FcγRI, FcγRIII und FcγRIV) für die Phagozytose von IgG-opsonized Partikel22benötigt nicht erkannt.
Zu phagocytic image können Ereignisse, die Plasmamembran von Makrophagen mit grün fluoreszierenden Fluorophor konjugierten Anti-F4/80 Antikörper, beschriftet werden, dient auch als eine spezifische Marker der Maus Makrophagen. Menschlichen roten Blutkörperchen können rot fluoreszierende durch Inkubation mit einem Marker Orange/rot fluoreszierende Plasmamembran gerendert werden wie oben beschrieben. Diese lipophilen Plasmamembran Markierung vermeidet mögliche verwirrende Effekte von Antikörper-basierten Etiketten. Rot fluoreszierende menschlichen roten Blutkörperchen, mit oder ohne Opsonization, können direkt in den Kanal 100 µL einer Kanal-Folie pipettiert werden und 3D Zeitraffer abgebildet über ein 60 X / 1,49 Öl-Immersion (oder ähnlich) Objektiv mit Hilfe der 488 nm und 561 nm Laser-Linien , bzw. der drehenden Scheibe konfokale (oder ähnlich) Mikroskop. Es ist verlockend, Optimierung des Systems für hochauflösende Bildgebung, sondern den Erwerb von wiederholten Z-Stapel über 16 min oder so verursachen erhebliche Immunofluoreszenz und Phototoxizität. Wir haben 2 x 2 binning zur Förderung guter Signal-Rausch-Verhältnis und Ermäßigungen in Erregung Intensität und/oder Belichtungszeiten, aber auf Kosten der optischen Auflösung zu ermöglichen. Darüber hinaus um Phototoxizität zu reduzieren, fügen wir ein Fänger von reaktiven Sauerstoffspezies auf das Medium. In zukünftigen Studien könnte die Assays der Phagozytose apoptotischer menschlichen roten Blutkörperchen Bild geändert werden. Anwendung von Ca2 + Ionophore, wie A23187, kann verwendet werden, induzieren Phosphatidylserin Externalisierung23, ein "eat me" Signal und Markenzeichen der frühen Apoptose24,25.

Zwanzig Jahre zuvor Metchnikoffs Beobachtung der phagocytic Mesenchym Zellen im Seestern Larven, 1882, und nachfolgende Entwicklung seiner Theorie der Phagozytose1, beschrieben Ernest Haeckel, 1862 die Verwicklung von unlöslichen Farbstoff Partikeln durch Blut Zellen der Thetis Fimbris (Tethys fimbriae), eine Art von räuberischen Meeresschnecke (Ernest Haeckel. Radiolarien (Rhizopoda Radiaria) sterben: Eine Monographie; Druck Und Verlag von Georg Reimer, Berlin, 1862). Er beschrieb explizit Membran Vorsprünge umhüllt die Partikel, die anschließend in das Zytoplasma aufgegriffen und rund um den Zellkern angehäuft wurden. Mehr als 100 Jahre später, zufolge eine bahnbrechende Studie von Kaplan gab es mindestens zwei morphologisch verschiedene Mechanismen der Phagozytose2. Kaplan zeigte mittels Rasterelektronenmikroskopie, Maus peritonealen Makrophagen aufgenommen eine IgG-opsonized Schaf-Erythrozyten mit dünnen Membran-Erweiterungen, die Griff nach oben und eng umhüllt das Teilchen, was zunächst zu einer becherartigen Struktur. Phagocytic Tasse Bildung erforderlich Aktin-Polymerisation, da es von der Zelle durchlässig Pilz Toxin Cytochalasin B, bekanntermaßen Aktin Dynamik3Sperren aufgehoben wurde. Im Gegensatz dazu erschien Schafe roten Blutkörperchen opsonized mit Ergänzung direkt versinken die Makrophagen ohne die Erzeugung von Membran-Erweiterungen, obwohl in einigen Bildern Membran Rüschen in der unmittelbaren Umgebung der sinkenden Partikel gesehen werden können. Im Gegensatz zu phagocytic Tasse Bildung war Komplement-Rezeptor-vermittelten versinken in Insenstive auf Cytochalasin B Behandlung2. In den Experimenten von Kaplan beschrieben, erfolgte die Ergänzung Opsonization durch Inkubation Immunglobulin M (IgM) mit der Bezeichnung Schafe Erythrozyten mit Serum von Ergänzung C5-defizienten Mäusen, die Hämolyse durch Ergänzung C5-abhängige Terminal umgeht ergänzen Sie komplexe.
Die beiden Modi der Phagozytose, phagocytic Tasse Bildung und einsinken, identifiziert durch Kaplan sind etablierte Meinung im Feld4,5,6,7,8,9 geworden. . Allerdings verwendet der ultra-hochauflösende Bilder in der Originalstudie von Kaplan2, sowie eine ähnliche Studie von Munthe-Kaas Et Al. 10, nur Schnappschüsse von phagocytic Veranstaltungen zur Verfügung stellen. In einem aktuellen Review, Rougerie Et al. 11 betonte, dass morphologische Unterschiede zwischen FcγR und CR vermittelt Phagozytose müssen noch geklärt werden, und darüber hinaus während der Komplement-Rezeptor-vermittelten Partikel Aufnahme2Membran Rüschen eingehalten worden. Live-Cell Imaging von phagocytic Einzelveranstaltungen – von der Aufnahme der Partikel bis hin zu Verinnerlichung, kombiniert mit genetisch modifiziert Mausmodelle, könnte erheblich zu einem besseren Verständnis wie Fresszellen erfassen und Partikel aufnehmen. Ein Ansatz könnte sein, schnell Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwenden die ultrahohe Auflösung (10 – 20 nm) topographische Darstellung der lebenden Zellen ermöglicht. Vor kurzem wurde eine schnelle AFM System12 entwickelt, eignet sich für bildgebende Zelloberflächen schnell mit geringem Rauschen. Diese Technik hat den Vorteil, dass hochauflösende, topografische und mechanischen Parameter der lebenden Zellen in kurzen Abständen (Sekunden) gemessen werden können, im Gegensatz zu der Rasterelektronenmikroskopie, die die Fixierung und kritischen Punkt Trocknen erfordert Zellen. Ein weiterer Ansatz ist die Time-Lapse 3D konfokalen Mikroskopie, die weithin verfügbar ist, obwohl Phototoxizität und Bleichen Faktoren bei Aufnahmen begrenzt sind. Dieser Ansatz ist sehr vielseitig und kann optische mit hoher räumlicher Auflösung und außergewöhnliche Flexibilität bei der Kennzeichnung mit einer erstaunlichen Auswahl an fluoreszierende Sonden, einschließlich genetisch codierte fluoreszierende Proteine. Hier beschreiben wir mit Zeitraffer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopie Phagozytose-Assays, die hohen räumlich-zeitliche Auflösung von spezifischen Rezeptor-vermittelte phagocytic Veranstaltungen ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>24 G Kunststoffkatheter</td><td>B Braun Mesungen AG, Deutschland</td><td>4254503-01</td><td>Zur Peritonealspülung</td></tr><tr><td>Hank' s gepufferte Salzlösung ohne Ca2+ und Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific 14170120</td><td></td><td>Zur Peritonealspülung</td></tr><tr><td>14 mL Polypropylen-Rundbodenröhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td>Zur Entnahme von Peritonealzellen</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium mit 20 mM Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7388</td><td>Basismedium für Assays</td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Rind Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082139</td><td>Wird als Ergänzung für RPMI 1640 Medien</td></tr><tr><td>100x Penicillin/Streptomycin</td><td>verwendet Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Verwendet als Ergänzung für RPMI 1640 Medien</td></tr><tr><td>Fibronektin-beschichtet &Mikro;-Objektträger&nbsp; I Kammern</td><td>Ibidi, Martinsried, Deutschland</td><td>80102</td><td>Objektträger für Assays</td></tr> <tr><td>& Mikro-Objektträger (eloxiertes Aluminium)</td><td>Gestell Ibidi, Martinsried, Deutschland</td><td>80003</td><td>Autoklavierbares stapelbares Gestell für Objektträger</td></tr><tr><td>RPMI 1640 bicarbonathaltiges Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Medium für Übernachtkultur</td></tr><tr><td>N-(2-Mercaptopropionyl)glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6635</td><td>Fänger von reaktiven Sauerstoffspezies</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-konjugierte Ratte (IgG2a) monoklonaler (Klon BM8) Anti-Maus-Antikörper F4/80</td> Thermo <td>Fisher Scientific</td><td>MF48020</td><td>Mausmakrophagen-Marker und Plasmamembranmarkierung</td></tr><tr><td>CellMask Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td>Rot fluoreszierender Plasmamembran-Farbstoff</td></tr><tr><td>Succinimidylester von pHrodo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36600</td><td>Amin-reaktiver Succinimidylester von pHrodo</td></tr><tr><td>Maus (IgG2b), monoklonal (Klon HIR2), Anti-Human-CD235a&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-20893</td><td>Zur Opsonisierung menschlicher roter Blutkörperchen mit IgG</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-konjugiertem (sekundärem) IgG-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab150116</td><td>Zur Bestätigung der Opsonisierung von menschlichen roten Blutkörperchen mit Maus-IgG</td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus C3b/iC3b/C3c-Antikörper</td><td>Hycult Biotech</td><td>HM1065</td><td>Zur Bestätigung der C3b/iC3b-Opsonisierung von menschlichen roten Blutkörperchen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-konjugierter Ziegen-Anti-Ratten-IgG-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11006</td><td>Wird als Sekundärantikörper zur Bestätigung der C3b/iC3b-Opsonisierung verwendet</td></tr><tr><td>Calcein/AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C3100MP</td><td>Wird verwendet, um menschliche rote Blutkörperchen mit dem Calcein</td></tr><tr><td>UltraVIEW Vox 3D-Lebendzell-Bildgebungssystem zu laden&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland</td><td></td><td>Konfokales Mikroskopsystem mit Spinning-Disk</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti inverses Mikroskop</td><td>Nikon, Japan</td><td></td><td>Inverses Mikroskop</td></tr><tr><td>CSU-X1 Spinning-Disk-Scanner</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Japan</td><td></td><td>Nipkow Spinning Disk Unit</td></tr><tr><td>14-Bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltiergekühlte Kamera</td><td>Hamamatsu Photonics Inc., Japan</td><td></td><td>EM-CCD-Kamera des konfokalen Spinning-Disk-Mikroskopsystems&nbsp;</td></tr><tr><td>488 nm Festkörperlaser, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland</td><td></td><td>Laser (488 nm) Quelle für konfokales Mikroskopsystem mit Spinning-Disk</td></tr><tr><td>561 nm Festkörperlaser, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Deutschland</td><td></td><td>Laser (561 nm) Quelle für konfokales Mikroskopsystem mit Spinning-Disk</td></tr></tbody></table>

time-lapse 3d-bildgebung der phagozytose durch makrophagen der maus

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagozytose spielt eine Schlüsselrolle in der Wirt Verteidigung sowie in Gewebeentwicklung und Wartung und schnelle, Rezeptor-vermittelte Umgestaltungen des Aktin-Zytoskeletts zu erfassen, umhüllen und verschlingen große Partikel beinhaltet. Obwohl phagocytic Rezeptoren, nachgeschaltete Signalwege und Effektoren, z. B. Rho-GTPasen identifiziert wurden, die dynamische Zellskelett Umgestaltung des spezifischen Rezeptor-vermittelte phagocytic Veranstaltungen bleiben unklar. Vor vier Jahrzehnten zwei verschiedene Mechanismen der Phagozytose von Fcγ-Rezeptor (FcγR)- und Komplement-Rezeptor (CR) - beispielhaft vermittelt Phagozytose, durch Rasterelektronenmikroskopie identifiziert wurden. Bindung von Immunglobulin G (IgG)-opsonized Partikel FcγRs löst den Vorsprung der dünne Membran-Erweiterungen, die zunächst eine sogenannte phagocytic Tasse rund um das Teilchen zu bilden, bevor es wird vollständig umschlossen und in die Zelle zurückgezogen. Im Gegensatz dazu erscheinen Ergänzung opsonized Partikel zu versinken die Phagozyten nach Bindung an Rezeptoren zu ergänzen. Diese beiden Modi der Phagozytose, phagocytic Tasse Bildung und einsinken, sind gut etabliert in der Literatur geworden. Jedoch die Unterschiede zwischen den beiden Modi haben sich verwischt durch Berichte, dass Komplement-Rezeptor-vermittelten Phagozytose verschiedene Membran Vorsprünge induzieren kann. Mit der Verfügbarkeit von hochauflösenden bildgebenden Verfahren, Phagozytose Assays sind erforderlich, mit denen in Echtzeit 3D (dreidimensional) Visualisierung wie bestimmte phagocytic Rezeptoren vermitteln die Aufnahme der einzelnen Partikel. Mehr gebräuchliche Ansätze für das Studium der Phagozytose, wie Endpunkt Assays, verpassen Sie die Gelegenheit zu verstehen, was an der Schnittstelle von Partikeln und Fresszellen. Hier beschreiben wir phagocytic Assays mit Zeitraffer Spinning Disk konfokale Mikroskopie, die 3D-Bildgebung phagocytic Einzelveranstaltungen zu ermöglichen. Darüber hinaus beschreiben wir Assays um eindeutig Bild Fcγ - Rezeptor oder Rezeptor-vermittelte Phagozytose zu ergänzen.

Abbildung 1zeigt eine schematische Darstellung der Kanal-Folie für die Darstellung der Phagozytose von Time-Lapse Spinnerei konfokalen Mikroskopie verwendet. Menschlichen roten Blutkörperchen (hRBCs) sind mit dem roten fluoreszierenden Plasmamembran Marker CellMask Orange gefärbt, während isolierte Maus resident peritonealen Makrophagen (Ms) mit grün fluoreszierenden Alexa Fluor 488-konjugierten Anti-F4/80 Antikörper ( gekennzeichnet sind Abbildung 2), dient als spezifische Marker für die Maus Makrophagen und als Plasmamembran Label. Menschlichen roten Blutkörperchen kann mit Maus IgG (mIgG) oder Maus IgM (mIgM), opsonized werden durch Inkubation der Zellen mit IgG (oder IgM) Anti-CD235a Antikörper (CD235a, auch bekannt als A, Glycophorin ist ein Protein, das speziell auf menschliche Erythrozyten ausgedrückt). Zeitraffer 3D-Bildgebung grün fluoreszierenden Makrophagen präsentiert mit rot fluoreszierende menschlichen Erythrozyten ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Partikels phagocytic Ereignisse (Abbildung 2). Genaue Beobachtung des phagocytic Einzelveranstaltungen kann Details der Partikel Abscheidung und Einnahme abgegrenzt werden. Beispielsweise kann die Erfassung von ein mIgG opsonized menschlichen roten Blutkörperchen durch eine Makrophage Filopodium, eine dünne, fingerartige Projektion (Abb. 3A; siehe auch Horsthemke Et Al. beobachtet 15). Darüber hinaus das Quetschen der menschlichen Erythrozyten während phagocytic Tasse Bildung beobachtet werden (Abb. 3A). Mit der Einführung des frischen Maus Serum, mIgG-opsonized, oder mIgM opsonized, menschlichen roten Blutkörperchen Auslösen der klassischen Komplementkaskade, die bei der Bildung von einer hämolytischen Membrane Angriff Komplex gipfelt. Die Kinetik der Komplement-vermittelten Hämolyse kann durch bildgebende Dual-gefärbt mit CellMask Orange und Calcein Zellen gemessen werden. Grün fluoreszierende cytosolischen Calcein ist schnell von Zellen während der Hämolyse (Abb. 3 b) befreit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig1.jpg"> Abbildung 1: Umgang mit Kanal Fibronektin-beschichteten Folien. (A) A Kanal Folie besteht aus zwei Stauseen, verbunden durch einen Kanal mit den Abmessungen 50 x 5 mm 0,4 mm. Kanal Folien sind zunächst durch die Anwendung 1-2 mL Medium zu einem der beiden Stauseen und Kippen der Folie vorausgefüllt. (B) Kappen können auf den Stauseen vor der Inkubation gelegt werden. Die Kappen können bequem verwendet zum auspumpen unerwünschte Luftblasen vor der Aussaat des Kanals mit Zellen. (C) die Luft blasenfreie 100 µL Kanal kann durch pipettieren Medium direkt in den Mund eines Kanals aufgefüllt werden. Dieser Schritt dient z. B. zum Samen Makrophagen in eine Folie oder Gfluorophore (grün fluoreszierend) hinzufügen-konjugierten Anti-F4/80 Antikörper, der als eine Membran-Label als auch eine Maus Makrophagen Markierung dient. (D) nach dem pipettieren Partikel wie opsonized menschlichen roten Blutkörperchen in einem Kanal mit Gewebekulturen ausgesät gebeizt Makrophagen, die Folie kann auf der Bühne von einem inversen Mikroskop platziert werden und Zeitraffer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopie kann sein durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig2.jpg"> Abbildung 2: Time-Lapse 3D-Bildgebung Phagozytose. (A) schematische Darstellung zeigt die Opsonization der Plasmamembran gebeizt (roter Leuchtstoff) menschlichen Erythrozyten (hRBCs) mit Maus (m) Anti-CD235a Immunglobulin G (mIgG) Antikörper und Präsentation der beschrifteten hRBCs, Maus Makrophagen (Ms), (grün fluoreszierend) beschriftet mit grün fluoreszierenden Fluorophor-konjugierten Anti-F4/80 Antikörper. (B) Zeitraffer-Bilder (XZ Ansichten), erhalten durch das Drehen der Scheibe konfokalen Mikroskopie, zeigt phagocytic Tasse Bildung und Aufnahme von mIgG-opsonized hRBCs. Maßstabsleiste = 10 µm. (C) 3D Rekonstruktionen zeigen Makrophagen, die Einnahme von mIgG-opsonized hRBCs. Entsprechende XZ-Ansichten (für 3 die Zeitpunkte) werden gezeigt, die Abstände in B. Grid 5.07 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig3.jpg"> Abbildung 3: Erfassen eines Teilchens durch ein Filopodium. Zeitraffer Bilder erhalten durch das Drehen der Scheibe konfokalen Mikroskopie, zeigt eine Maus Makrophagen Erfassung einer Maus Immunglobulin G (mIgG)-opsonized menschlichen Erythrozyten (hRBC) über ein Filopodium (Pfeile im oberen Panel), eine fingerartige Projektion. Beachten Sie, dass die rote Blutzelle seine Kerbungen früh während phagocytic Tasse Bildung verliert. Darüber hinaus scheint der phagocytic Cup drücken Sie die umhüllten rote Blutzelle (angezeigt durch Pfeile im unteren Bereich). Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Essays ist es, Makrophagen und opsonisierte rote Blutkörperchen für die Visualisierung der Phagozytose durch dreidimensionale Zeitraffermikroskopie vorzubereiten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, wie Phagozyten Partikel erfassen und aufnehmen. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung der Partikelaufnahme in Echtzeit, anders als bei herkömmlichen Endpunkt-Assays, die nur die Beurteilung ermöglichen, ob, aber nicht wie, ein Teilchen aufgenommen wurde.Im Allgemeinen können Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, bis sie sich an die Zellisolationsverfahren gewöhnen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir zum ersten Mal, als wir die Vorteile des Spinnens dieser konfokalen Mikroskopie für die 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Phagozytose erkannten. Um peritoneale Makrophagen zu isolieren, legen Sie einen 24 Gauge Plastikkatheter in das Peritoneum einer drei bis vier Monate alten Maus und verwenden Sie eine Kunststoff-Fünf-Milliliter-Spritze, um den Hohlraum zweimal mit 4,5 Millilitereis-kaltem HBSS ohne Kalzium und Magnesium pro Spüle zu spülen.Übertragen der angesaugten Suspension in ein 14-Milliliter Polypropylen-Rundbodenrohr, wie es gesammelt wird. Wenn beide Proben geerntet wurden, zentrifugieren Sie das Aspirat und setzen Sie die Peritonealzellen in einem Milliliter vollständiger bikarbonatfreier RPMI 1640 Medium, um etwa sechs mal 10 bis sechs Milliliter Konzentration zu erreichen. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter komplettes HEPES-Ergänzungsmedium zu einem Reservoir eines fibronectin beschichteten Kanalschlittens hinzu, und neigen Sie den Schlitten, damit das Medium aus dem nachgeschalteten Reservoir angesaugt werden kann.Um unerwünschte Luftblasen zu entfernen, fügen Sie einem der beiden Reservoirs ein bis zwei Milliliter frisches Medium hinzu und tragen Sie eine Reservoirkappe fest auf. Dann wenden Sie rhythmischen Daumendruck auf die Kappe an, um Luft aus dem Schlitten zu pumpen, und kippen Sie den Schlitten bei Bedarf. Wenn die gesamte Luft ausgestoßen wurde, neigen Sie den Schlitten in Richtung des ungekapselten Mediums, das Reservoir enthält, und entfernen Sie die Kappe, um zu vermeiden, dass Luft wieder in den Kanal gesaugt wird.Nun pipette die Zelllösung ein paar Mal, um Klumpen zu reduzieren, und fügen Sie 100 Mikroliter der Zellen in einem Kanal der Rutsche für eine zweistündige Inkubation in einer feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius in Abwesenheit von Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation ersetzen Sie das HEPES enthaltende Medium in jedem Schlitten mit komplettem Bicarbonat-ergänzungsmedium, wie gerade gezeigt. Dann legen Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius feuchten Inkubator mit 5% Kohlendioxid für ihre Nachtkultur.Am nächsten Morgen einen Milliliter frisch erhaltenes gesundes Spenderblut in ein zwei Milliliter rundes Polypropylen-Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie dann die Probe. Entfernen Sie das Plasma und das buffy Mantel mit Überstand.Und übertragen Sie sorgfältig 100 Mikroliter der sedimentierten roten Blutkörperchen in ein zwei Milliliter Mircocentrifuge-Rohr mit 100 Mikroliter komplettem HEPES-Ergänzungsmedium. Beschriften Sie die Röhre 1:1 und übertragen Sie vier Mikroliter der verdünnten roten Blutkörperchen in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit zwei Millilitern komplettem HEPES-Ergänzungsmedium. Dann beschriften Sie diese Röhre 4:2000 und legen Sie beide verdünnten roten Blutkörperchen Probenröhrchen auf Eis.Um die peritonealen Makrophagen zu beschriften, ersetzen Sie das Bicarbonatmedium in jedem Kanalschlitten durch komplette Medien, die durch HEPES ergänzt werden. Dann kippen Sie den Schlitten, damit 100 Mikroliter der fluoreszierend markierten Maus Makrophagen spezifischen Antikörper von Interesse hinzugefügt werden tropfen weise auf die Öffnung des 100-Mikroliter-Kanal der Folie. Aspirieren Sie das Medium, das in das flussabwärts gelegene Reservoir fließt, und brüten Sie die Zellen für 20 Minuten in einer feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius in Abwesenheit von Kohlendioxid.Während die Peritonealzellen beschriftet werden, mischen Sie 4:2000 rote Blutkörperchen Probe und übertragen 400 Mikroliter der Zellen in ein neues Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, in einem beheizten Aluminiumblock in einer laminaren Strömungshaube für etwa fünf bis acht Minuten. Wenn die Zellen auf 37 Grad Celsius erwärmt haben, mischen Sie 0,4 Mikroliter eines geeigneten roten fluoreszierenden Plasmamembranflecks mit den Zellen. Legen Sie die Zellen dann wieder in den Wärmeblock.Nach fünf Minuten waschen Sie die Zellen, indem Sie 1,6 Milliliter frische HEPES hinzufügen, ergänzt komplettes Medium und Zentrifuge. Drehen Sie das Rohr, um das rote Blutkörperchen zu identifizieren. Mit einer bis 1,5 Milliliter Pipette Spitze vorsichtig entfernen Sie den Überstand in zwei Bänden, ohne das Pellet stören und mischen 2000 Mikroliter frische HEPES ergänzt komplette Medium mit den Zellen.Zentrifugieren und wieder aufhängen das Pellet in 400 Mikroliter Medium. Dann beschriften Sie das Rohr PMS für Plasma Membranfleck. Am Ende der 20-minütigen Peritonealzellbeschriftung summieren Sie die Rutsche mit einem Milliliter frischer, kompletter HEPES-Ergänzungsmedium.Zur Opsonisierung der roten Blutkörperchen fügen Sie einen Mikroliter Maus IGG2B monoklonalen Anti-Human-CD235A-Antikörper in die PMS-Proberöhre. Nach acht Minuten bei 37 Grad Celsius mit einmal pro Minute Mischen übertragen 100 Mikroliter der Plasmamembran gebeizt IGG opsonisierte menschliche rote Blutkörperchen auf die peritoneale Makrophagen enthaltenKanalgleiten. Sobald die menschlichen roten Blutkörperchen hinzugefügt wurden, montieren Sie das Dia auf einem sich drehenden Scheiben-Konfokalmikroskop.Wenn der Bühneninkubator auf 37 Grad Celsius eingestellt ist und sofort mit der Abbildung der Zellen beginnt. Die Zeitraffer-3D-Bildgebung grüner fluoreszierender Makrophagen, die mit roten fluoreszierenden menschlichen roten Blutkörperchen präsentiert werden, ermöglicht die Visualisierung von phagozytären Ereignissen einzelner Teilchen. Zum Beispiel kann die Erfassung einer Maus IGG opsonisierte menschliche rote Blutkörperchen durch ein Makrophagen Filopodium beobachtet werden.Ebenso wie das Quetschen einer menschlichen roten Blutzelle während der phagozytischen Tasse Bildung. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie peritoneale Makrophagen, fluoreszierend markierte Zellen und opsonisierte Partikel isolieren können.

time-lapse-3d-imaging-of-phagocytosis-by-mouse-macrophages

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Dieses Video zeigt einen Assay zur Überwachung unabhängiger Makrophagen-vermittelter Phagozytose-Ereignisse der roten Blutkörperchen (RBC). Immunglobulin G (IgG)-opsonisierte humane Erythrozyten der Maus werden mit Mausmakrophagen inkubiert und unter einem konfokalen Mikroskop betrachtet. Die Erythrozyten werden von Makrophagen über eine phagozytäre Becherbildung verschlungen und gezielt für den lysosomalen Abbau eingesetzt.

Echtzeit-Bildgebung der Makrophagen-Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen

Dieses Video zeigt eine hochauflösende Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopietechnik (TIRF) zur Echtzeit-Visualisierung der Phagosomenbildung und des Verschlusses während der Makrophagen-vermittelten Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen (RBCs), die an der Oberfläche einer Glasbodenschale befestigt sind. Die Makrophagen dehnen Pseudopodien um die Erythrozyten aus und umhüllen sie in den Phagosomen, wodurch sie sich von der Glasoberfläche lösen.

TIRF-Mikroskopie-basierte Visualisierung der Phagosomenbildung und des Phagosomenverschlusses

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagozytose von fluoreszierenden Partikeln durch adhärente Makrophagenzelllinien mit einer fluorometrischen Methode. Diese Methode ermöglicht eine Hochdurchsatz-Quantifizierung der Partikelinternalisierung sowie der daraus resultierenden Aktinpolymerisation.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau, um die Bildung und den Verschluss von Phagosomen in lebenden Makrophagen mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie in drei Dimensionen zu visualisieren. Es ermöglicht die Überwachung der Basis des phagozytischen Bechers, der sich ausdehnenden Pseudopoden sowie der genauen Stelle der Phagosomenspaltung.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Hier beschreiben wir eine mikroskopbasierte Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der frühen Kaskaden von Ereignissen während der Phagozytose von Krankheitserregern wie den Pilzen Candida albicans und Partikeln, die größer als 0,5 μm sind, einschließlich Zymosan und IgG-beschichteten Kügelchen.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

Makrophagen-phagozytische Aktivität gegen Krebszellen, insbesondere 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zellen, wurde in dieser Studie abgebildet. Das Modell der Kokultur von Lebenden Zellen wurde mit einer Kombination aus fluoreszierender und differentialer Interferenzkontrastmikroskopie erstellt und beobachtet. Diese Bewertung wurde mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware zur Entwicklung von Multipoint-Zeitraffervideos abget/die sich erstellt haben.

Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen

Hier beschreiben wir Methoden mit Zeitraffer-Phasen-Kontrast-Mikroskopie, um peritoneale Makrophagen in einem chemotaktischen Komplement C5a-Gradienten zu beleben. Die Protokolle können auf andere Immunzellen ausgedehnt werden.

Zeitraffer-Bildgebung von Mausmakrophage Chemotaxis

Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung und Erzeugung dynamischer Bilder der mesenchymalen Stammzell (MSC) vermittelten Regulation der Makrophagen (MΦ) Phagozytose von nicht opsonisierten Hefepartikeln (Zymosan) vorgestellt, die zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Lernen Sie die 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Phagozytose in residenten Peritoneal-Makrophagen der Maus mit Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung einzelner Phagozytose-Ereignisse.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

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