Laser Capture Microdissection von hochreinen trabekuläre Geflecht aus Maus Augen für Gene Expression Analysis

Das übergeordnete Ziel dieses Laser-Mikrodissektionsverfahrens ist es, eine robuste und reproduzierbare Methode zur Isolierung eines hochangereicherten Trabekelwerks aus Mausaugen mittels Laser-Capture-Mikroskopie für die anschließende RNA-Isolierung und nachgeschaltete Expressionsanalyse zu entwickeln. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Augenheilkunde zu beantworten, z. B. welche wichtigen Gene und Signalwege vorhanden sind, die bei Fehlregulation zu Augenerkrankungen führen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass hochwertige RNA aus dem Trabekelwerk von Mausaugen für die Genexpressionsanalyse reproduzierbar isoliert werden kann.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Lasermikrodissektion eine leistungsstarke Technik ist, die verschiedene Schritte zur Fehlerbehebung während des gesamten Protokolls umfasst. Beginnen Sie dieses Verfahren mit einer optimalen Gewebeentnahme für die Lasermikrodissektion, wie im Textprotokoll beschrieben. Sprühen Sie RNase-Dekontaminationslösung auf die Bürste, die Pinzette, die Kupplungsgläser und das Montagefutter.

Spülen Sie das Gerät nach gründlichem Abwischen mit nukleasefreiem Wasser ab und trocknen Sie es ab. Wischen Sie den Kryostaten mit 100 % Ethanol ab, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Drücken Sie eine kleine Menge O.C.T. auf das Einspannfutter, entfernen Sie dann den Gewebeblock aus der Form und legen Sie den Block vorsichtig auf das Einhängefutter.

Sobald der Gewebeblock an der Einhängeplatte fest gefroren ist, wird er auf den Probenhalter des Kryostaten eingesetzt. Stellen Sie dann den Kryostaten so ein, dass er Acht-Mikrometer-Schnitte schneidet, und schneiden Sie vorsichtig durch den OCT-Block, um die Gewebeprobe zu erreichen. Sobald das Gewebe beobachtet ist, hören Sie auf zu schneiden.

Schneiden Sie die gefrorenen Blöcke mit einer sauberen Rasierklinge von allen Seiten ab und lassen Sie drei bis vier Millimeter O.C.T. um das Tuch herum, um die Handhabung mit dem Pinsel zu ermöglichen. Schnitt durch das Auge und arbeite schnell. Färben Sie jeden dritten Abschnitt, indem Sie die Folie 60 Sekunden lang mit einem schnellen, einstufigen H&E-Fleck überfluten.

Spülen Sie die Stelle mit Leitungswasser ab und trocknen Sie sie an der Luft. Nachdem Sie den Schnitt mit einem Räummittel gereinigt haben, montieren Sie den Schnitt auf einen geladenen Objektträger mit Deckglas und überprüfen Sie ihn unter dem Mikroskop. Fahren Sie mit dem Schneiden fort, bis das TM in den gefärbten Abschnitten sichtbar wird.

Sobald das TM erscheint, schneiden Sie zwei Abschnitte und montieren Sie sie auf einen geladenen Objektträger für die routinemäßige H&E-Färbung, um eine Karte für das Schneiden mit Laser-Capture-Mikrodissektion zu erstellen. Nach dem ersten H&E-Map-Objektträger schneiden und richten Sie sechs serielle acht Mikrometer dicke Abschnitte im Kryostaten aus und montieren sie gleichzeitig auf den PET-Membranobjektträger. Kleben Sie das Gewebe fest, indem Sie einen behandschuhten Daumen kurz über die Rückseite der Membran schieben.

Legen Sie den PET-Membranschieber nach der Montage sofort in eine Objektträgerbox auf Trockeneis. Fahren Sie fort, das Auge zu teilen. Nach jeweils zwei PET-Membranobjektträgern mit jeweils sechs Abschnitten sammeln Sie zwei Abschnitte auf einem geladenen Glasobjektträger, um einen weiteren Map-Objektträger für die H&E-Färbung zu erstellen.

Fahren Sie mit dem Schneiden von ca. 100 seriellen Abschnitten mit einer Dicke von acht Mikrometern fort, bis das TM nicht mehr sichtbar ist. Bestätigen Sie das Fehlen von TM, indem Sie schnell einen Abschnitt auf einem geladenen Objektträger färben. Nachdem Sie die H&E-Map-Färbung durchgeführt haben, wie im Textprotokoll beschrieben, überprüfen Sie die H&E-Objektträger visuell mit einem Mikroskop.

Identifizieren Sie Map-Folien mit TM deutlich sichtbar und zum Schneiden zugänglich. Verwenden Sie die PET-Membranfolien zwischen diesen Map-Folien für LCM. Nehmen Sie die Objektträgerbox mit gefrorenen Gewebeschnitten aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius und legen Sie sie auf Trockeneis.

Bearbeiten Sie die Objektträger nacheinander. Fixieren Sie die Abschnitte, indem Sie den Objektträger sofort 30 Sekunden lang in kaltes 75%iges Ethanol mit RNase-Inhibitoren legen. Tauchen Sie den Objektträger vorsichtig für 10 bis 15 Sekunden in nukleasefreies Wasser, um das O.C.T. aufzulösen, ohne die Gewebeschnitte zu beeinträchtigen.

300 Mikroliter 1,5%ige Kresylviolettacetatlösung vorsichtig direkt auf die Schnitte pipettieren und 45 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie dann die Abschnitte einmal, indem Sie sie 30 Sekunden lang in ein 75%iges Ethanolbad legen. Pipettieren Sie 200 Mikroliter Eosin Y-Lösung auf die Schnitte und inkubieren Sie sie drei bis fünf Sekunden lang.

Dehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger anschließend jeweils 30 Sekunden lang in 75 % Ethanol, 95 % Ethanol und schließlich in ein 100 % Ethanolbad legen. Tupfen Sie das Ende des Objektträgers zwischen jedem Schritt mit einem Taschentuch ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Lassen Sie die Rutsche fünf Minuten lang vollständig unter der Motorhaube an der Luft trocknen.

Nach dem Trocknen sofort danach LCM durchführen. Vermeiden Sie die Verwendung von Xylol für den letzten Reinigungsschritt. Die Xylolbehandlung führt dazu, dass der Gewebeschnitt unzureichend an den Membranschieber anhaftet.

Xylol verringert auch die Effizienz der Gewebeerfassung durch LCM. Legen Sie den PET-Objektträger mit der gefärbten Gewebeseite nach unten direkt auf einen neuen Objektträger, der auf den Mikroskoptisch eingelegt wurde. Stellen Sie sicher, dass die Membran und der Objektträger fest auf dem Mikroskoptisch liegen.

Starten Sie LCM, indem Sie zuerst die Schiebegrenzen festlegen. Wählen Sie die niedrigste 4-fache Vergrößerung im Objektivfenster und definieren Sie dann den Arbeitsbereich des Membranobjektträgers, indem Sie den XY-Tisch des Mikroskops bewegen, bis die obere linke Ecke, in der sich Metall und Membran treffen, im Live-Video-Feed sichtbar ist. Drücken Sie an dieser Stelle die Taste Limit 1 und ein rotes Rechteck erscheint auf der Straßenkarte.

Bewegen Sie als Nächstes den XY-Tisch in die gegenüberliegende Ecke und drücken Sie die Taste Limit 2. Drücken Sie die Scan-Taste, um ein Roadmap-Bild der Membran und des Gewebes zwischen den eingestellten Grenzwerten zu erstellen. Doppelklicken Sie in der Nähe des TM eines der Augenausschnitte innerhalb der Straßenkarte.

Der TM kann sich in der Nähe des Scheitelpunkts des Iridokornealwinkels befinden. Sobald das TM identifiziert wurde, erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 10-fache und fokussieren Sie manuell auf das TM. Wiederholen Sie dies mit 20X- und 40X-Objektiven. Wenn das TM mit dem 40X-Objektiv scharf ist, navigieren Sie in einen leeren Bereich, wählen Sie das Freihandzeichenwerkzeug aus und zeichnen Sie eine lange Linie auf einen leeren Bereich des Gewebes.

Stellen Sie die Laserparameter so ein, dass die Schnittgeschwindigkeit 34 % beträgt, die Fokussierung 58 % und die Leistung 70 % beträgtund drücken Sie dann die Taste Schneiden. Nehmen Sie feine Laseranpassungen an den Parametern für Geschwindigkeit, Fokus und Leistung vor, bis eine klare und feine Schnittlinie zu sehen ist. Stellen Sie für einen präzisen Schnitt sicher, dass der Schnitt der gezeichneten Linie folgt.

Legen Sie anschließend den Deckel des Isolationsschlauchs in den Kappenhalter und öffnen Sie den Schlauch. Befestigen Sie den Kappenhalter an der Kappenanhebung und stellen Sie sicher, dass das Rohr umgedreht ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Klebekappenmaterial über die Spitze der Kappe hinausragt, um sicherzustellen, dass das gewünschte Gewebe richtig erfasst wird.

Es ist wichtig, visuell sicherzustellen, dass das Trabekelwerk aufgenommen und an der Isolationskappe befestigt wird. Wählen Sie den Modus Manuelles Präparieren auf dem Software-Panel. Überprüfen Sie sorgfältig, ob sich der TM direkt unter dem Isolationsschlauch befindet.

Stellen Sie den Weißabgleich ein und passen Sie die Helligkeit an, um eine optimale Bildqualität zu erzielen. Um mit dem Schneiden zu beginnen, passen Sie den Fokus manuell an und zeichnen Sie mit dem Freihandwerkzeug eine Linie. Achten Sie darauf, dass die Auffangkappe in der oberen Position bleibt und die Membran noch nicht berührt.

Zeichnen Sie Teilkreise in der Nähe der Stelle, an der das TM auf die Sklera trifft, und drücken Sie Ausschneiden. Sobald die ersten Schnitte gemacht sind, positionieren Sie die Kappe in die untere Position und stellen Sie den Fokus neu ein, zeichnen Sie dann zwei Linien in den freien oder freien Raum, um die beiden Teilkreise zu verbinden und den Kreis um den TM zu vervollständigen. Drücken Sie dann auf Ausschneiden und sammeln Sie Gewebe aus dem Schnitt. Stellen Sie sicher, dass das TM von der Mikrodissektionskappe aufgenommen wurde.

Bringen Sie die Kappe wieder in die obere Position und wiederholen Sie den Vorgang an den restlichen Abschnitten. Passen Sie die Position der Kappe leicht an, so dass alle isolierten Proben auf die Kappe passen und sich nicht überlappen. Für die nächste PET-Membran setzen Sie einen neuen Isolationsschlauch ein und wiederholen Sie diesen Abschnitt.

Um die Lyse des mikrodisparierten TM-Gewebes durchzuführen, pipettieren Sie vorsichtig 10 Mikroliter Lysepuffer auf den Deckel des Entnahmeröhrchens und stellen Sie sicher, dass der Lysepuffer die mikrodisparierte TM vollständig bedeckt. Schließen Sie die Klebekappe vorsichtig und inkubieren Sie das Entnahmeröhrchen kopfüber bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Nach der Inkubation zwei Minuten lang bei 800 g zentrifugieren und das Lysat auf Trockeneis geben. Lagern Sie die Lysate bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Reinigung und Analyse.

Ein schneller Abbau von RNA kann sich auf die nachgeschaltete RNA-Analyse auswirken. Die RNA-Qualität sollte mit Hilfe einer mikrofluidikbasierten Plattform gemessen und quantifiziert werden. Repräsentative Ergebnisse der Genexpressionsanalyse der hochwertigen Gesamt-RNA, die aus dem Trabekelwerk aufgereinigt wurde, sind hier dargestellt.

Das digitale Gel für die verbleibende Gesamt-RNA aus dem Augengewebe nach der Lasermikrodissektion zeigt eine hohe RNA-Integritätszahl, die für die anschließende nachgeschaltete RNA-Analyse benötigt wird. Sobald hochwertige RNA aus dem Gewebe extrahiert wurde, können nachgelagerte Analysen wie Micro-Array, RNA-Seq und qPCR durchgeführt werden. Hier wurde eine quantitative digitale PCR-Analyse verwendet, um die Expression der trabekulären Meshwork-assoziierten Gene Myocilin und ACTA2 aus LCM-gesammelter RNA zu analysieren.

Die Heatmap, die aus Daten aus der Microarray-Analyse generiert wurde, zeigt, dass diese Technik verwendet werden kann, um Veränderungen der Genexpression im Trabekelwerk von Wildtyp-Mäusen und Knockout-Mäusen mit einem erhöhten IOD-Phänotyp zu verstehen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in nur einem Tag pro biologischem Tier durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist unerlässlich, da die Schritte der Lasermikrodissektion aufgrund der Schwierigkeit der Visualisierung der interessierenden Zellen und des Fehlens von Standards für diese einzigartigen Proben schwer zu erlernen sind.

Es ist entscheidend, sich auf den geschickten Bediener zu verlassen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass RNA in kleinen Gewebemengen schnell abgebaut werden kann. Vorsichtsmaßnahmen wie die Dekontamination von Geräten aus RNase, die Minimierung der Luftexposition und die Kälte des Gewebes sollten getroffen werden.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Auswirkungen eines erhöhten Augeninnendrucks auf die trabekuläre Netz-spezifische Genexpression geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Bewertung von Veränderungen der Genexpression in der Netzhaut, die durch erhöhten Augeninnendruck verursacht werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie RNA-Seq oder Micro-Array durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Signalwege im Trabekelwerk von Mäusen mit erhöhtem Augeninnendruck verändert sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, Veränderungen der Genexpression im Trabekelwerk in Mausmodellen effektiver zu untersuchen.