Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Gefäß- und Krebsbiologie zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen der endothelialen Plastizität bei verschiedenen pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine robuste Induktion von in vitro EndMT durch die Behandlung mit TGF-in MS-1-Endothelzellen erreicht wird. Züchten Sie zunächst die MS-1-Zellen unter Standardkulturbedingungen und vermeiden Sie, dass die Kultur konfluent ist.

Anschließend die MS-1-Zellen auf einer 10 cm großen Schüssel mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen. Geben Sie dann 1 ml Trypsin in die Platte und inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann 9 ml Nährmedium zu den trypsinisierten Zellen zur Ablösung.

Sammeln Sie dann die trypsinisierte Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen. Die Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 bis 400 x G zentrifugiert. Verwenden Sie als Nächstes einen automatischen Zellzähler, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu zählen.

Anschließend plattieren Sie die MS-1-Zellen auf unbeschichteten Standardkulturplatten für die Langzeitkultur. Nach 24 Stunden stimulieren Sie die Endothelzellen mit einer Endkonzentration von 1 ng pro Milliliter TGF-2. Dann inkubieren Sie die Kulturplatte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Ersetzen Sie das Medium nach 48 Stunden Behandlung durch frisches, vorgewärmtes Kulturmedium, das TGF-2 enthält. Für die nachgelagerte Analyse plattieren Sie die MS-1-Zellen auf einem mit Gelatine vorbeschichteten 8-Well-Kulturkammerobjektträger. Nach 24 Stunden geben Sie 10 M ROCK-Inhibitor in die Zellkultur. Nach einer Stunde stimulieren Sie die Endothelzellen mit einer Endkonzentration von 1 ng pro Milliliter TGF-2.

Dann inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Für eine 72-stündige Kultur ersetzen Sie das alte Medium nach 48 Stunden durch frisches TGF-2-haltiges Medium. Nach einem ganzen Tag TGF-Behandlung entfernen Sie das Medium.

Fixieren Sie dann die Zellen mit 4%Paraformaldehyd und phosphatgepufferter Kochsalzlösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen nach Ablauf der Fixierzeit mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Dann inkubieren Sie die Zellen mit 0,2 % Triton X-100 für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Spülen Sie die Zellen nach fünf Minuten erneut dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Nach drei Wäschen werden die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit verdünntem fluoreszierendem Phallotoxin inkubiert, das einen Blockierungspuffer enthält. Nach der Inkubation die Zellen dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen.

Anschließend färben Sie die Zellkerne mit Cyanin-Nukleinsäure-Bindungsfarbstoff fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie den Objektträger nach fünf Minuten aus und befestigen Sie einen Deckglas mit einem Dia-Montagemedium auf dem Objektträger. Beobachten Sie die Zellen unter einem konfokalen Mikroskop.

Die Zellen zeigen eine Reorganisation der dicken Stressfasern nach TGF-2-Behandlung. Dies deutet auf die Wirksamkeit von TGF-2 bei der Induktion von EndMT in Endothelzellen hin. Nach 72 Stunden TGF-2-Behandlung verwerfen Sie das Medium und fixieren Sie die Zellen fünf Minuten lang mit 0,5 bis 1 ml 50 % kaltem Methanol und 50 % Aceton.

Spülen Sie dann die Zellen dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Nachdem die drei Waschgänge abgeschlossen sind, inkubieren Sie die Zellen mit Primärantikörpern in Blockierungspuffer über Nacht bei 4 Grad Celsius im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag erneut dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Dann inkubieren Sie die Zellen mit grünem Farbstoff konjugierten Sekundärantikörper gegen VE-Cadherin in Blockpuffer für eine Stunde im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen erneut dreimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Anschließend färben Sie die Zellkerne mit Cyanin-Nukleinsäure-Bindungsfarbstoff fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Spülen Sie den Objektträger nach fünf Minuten ab und befestigen Sie einen Deckglas mit dem Dia-Montagemedium auf dem Objektträger. Beobachten Sie dann die Zellen unter einem konfokalen Mikroskop. Die Zellen zeigen eine verminderte Expression von VE-Cadherin und eine erhöhte Aktinexpression der glatten Muskulatur nach TGF-2-Behandlung für 48 bis 72 Stunden.

Vor dem Kollagengel-Kontraktionsassay kultivieren Sie die MS-1-Zellen 72 Stunden lang in Gegenwart und Abwesenheit von TGF-2. Bereiten Sie dann das Kollagen-Gel Typ 1 auf Eis vor. Mischen Sie dann 800 l der Kollagengellösung mit 200 ml der Kontroll- oder TGF-2-behandelten Endothelzellen.

Geben Sie als Nächstes 1 ml dieser Mischung in jede Vertiefung einer 12-Well-Kulturplatte. Lassen Sie das Gel bei 37 Grad Celsius 30 bis 60 Minuten lang erstarren. Nach der Verfestigung des Gels fügen Sie 1 ml MEM Alpha hinzu, das 10% fötales Kälberserum, 50 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 50 g pro Milliliter Streptomycin enthält, um das Gel schwimmen zu lassen.

Löse dann das Gel von der Wand der Vertiefung und inkubiere das schwimmende Gel 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach 48 Stunden Inkubation scannen Sie die Bilder des Gels von der Unterseite der Platte mit einem Scanner. Deutliche morphologische Veränderungen sind sichtbar, die die Zellen aufgrund der 72-stündigen TGF-2-Behandlung vom Kopfsteinpflaster in die mesenchymale spindelförmige Architektur verwandeln.

Interessanterweise zeigt die Behandlung mit TGF beta 2 für 48 bis 72 Stunden einen Anstieg sowohl der mRNA- als auch der Proteinexpression von Aktin der glatten Muskulatur in den MS-1-Zellen. Der Gelkontraktionsassay zeigt auch, dass sich das Kollagen-Typ-1-Gel nach der TGF-2-Behandlung signifikant zusammenzieht. Interessanterweise senkt der Entzug von TGF-2 das Aktin der glatten Muskulatur auf das Basalniveau und die Zellen nehmen die Kopfsteinpflaster-Morphologie wieder auf, was darauf hindeutet, dass EndMT ein dynamischer Prozess ist.

Tatsächlich schwächt die Hemmung von microRNA 31 durch einen LNA-microRNA-Inhibitor unter Verwendung der MS-1-Zellen die Induktion mesenchymaler Marker ab. Der Inhibitor beeinflusst jedoch nicht die Induktion von TGF-Zielgenen wie Fibronektin 1, PAI-1 und Smad 7. Die Befolgung dieses Verfahrens als Methode wie Genexpression, Knockdown oder Microarray-Modulation kann durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die spezifische Gen- und microRNA-Funktion in EndMT zu beantworten.