Name: Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Erfahren Sie die endothelial-mesenchymale Transition in MS-1-Zellen durch TGF-β2-Behandlung zur Analyse morphologischer und molekularer Veränderungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von EndMT-Mechanismen in der Gefäßbiologie.

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Wir danken Zea Borok und Kohei Miyazono für Anregungen bei der Vorbereitung des Manuskripts. H.I.S und m.h. werden unterstützt durch Uehara Memorial Foundation Research Fellowship und H.I.S stützt sich auf die Osamu Hayaishi Memorial Scholarship für Study Abroad. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von Takeda Science Foundation (A.S.) unterstützt.

1. Induktion von EndMT
<ol><li>MS-1-Zellen im standard Kulturbedingungen pflegen und Konfluenz zu vermeiden. Eine Quelle für MS-1-Zellen wird in der Tabelle der Materialienbeschrieben. Verwenden Sie für MS-1-Zellen Minimum wesentliches Medium-α (MEM-α) mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 50 U/mL Penicillin und 50 μg/mL Streptomycin.</li>
	<li>Waschen MS-1-Zellen auf 10 cm Schüssel mit 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 1,0 mL Trypsin auf den Teller. 5 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Lösen Sie die Zellen mit 9 mL von Nährmedien. Sammeln Sie Zellsuspension in einer 15 mL Tube.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 – 400 X g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und Aussetzen der Zelle Pellet in vorgewärmten Kulturmedien.</li>
	<li>Zählen Sie entwicklungsfähigen Zellen verwenden Trypan blau Lösung und eine standard Hemocytometer oder eine automatische Zelle Zähler.</li>
	<li>Platte MS-1-Zellen auf unbeschichtete standard Kultur Teller bei 0,5 x 103 Zellen pro cm2 für lange Begriff Kultur. Z. B. Kultur Platte 5.0 x 103 Zellen pro Bohrloch in einem 6 gut Platte. Verwenden Sie die gleiche Kultur Medien einschließlich der gleichen Konzentration von FCS. In MS-1-Zellen induziert TGF-β EndMT in langfristige Kultur (mindestens 48-72 h) mit dem Einsatz des FCS.</li>
	<li>Endothelzellen mit TGF-β2 (eine Endkonzentration von 1 ng/mL) nach 24 h zu stimulieren.</li>
	<li>Zellkulturen in einem befeuchteten Inkubator (5 % CO2, 37 ° C). Überwachen Sie Zellen täglich beim Fokussieren morphologischer Veränderungen.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Medien mit frischen vorgewärmten Nährmedien mit TGF-β2 nach einer Behandlung mit TGF-β in langfristige Kultur 48 h.</li>
	<li>Fahren Sie mit den nachfolgenden Analysen. In der Regel Aktin Reorganisation ist nach 24 Stunden nach der Behandlung beobachtet und Herabregulation der endotheliale Marker und Hochregulation der mesenchymalen Marker nach 48-72 h Behandlung mit TGF-β eingehalten werden.</li>
</ol>(2) Immunocytochemical Analyse
<ol><li>MS-1-Zellen im standard Kulturbedingungen zu erhalten.</li>
	<li>Platte-MS-1-Zellen auf 4 Zelle gut Kultur Kammer Folien bei 1,0 x 103 Zellen pro Bohrloch (1,7 cm-2). Folien sind vorbeschichtete mit Gelatine. Verwendung 0,5 – 1,0 mL der Nährmedien pro Bohrloch.</li>
	<li>Endothelzellen mit TGF-β2 (eine Endkonzentration von 1 ng/mL) nach 24 h zu stimulieren. Bei der Analyse der Beteiligung der ROCK in EndMT fügen Sie einen ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 μM) 1 h vor TGF-β-Behandlung hinzu. Bei der Beurteilung der Wirkung von TGF-β Signalisierung Hemmung können TGF-β-Rezeptor-Kinase-Inhibitoren verwendet werden.</li>
	<li>Zellkulturen in einem befeuchteten Inkubator (5 % CO2, 37 ° C). Aktin Reorganisation ist nach 24 Stunden nach der Behandlung mit TGF-β in MS-1-Zellen beobachtet. Andere Änderungen werden nach 48-72 h der Behandlung deutlich. Ersetzen Sie für 72 h Kultur die Medien mit neuen Medien mit TGF-β nach 48 h Behandlung mit TGF-β.</li>
	<li>
F-Aktin Färbung
	<ol>
<li>Nach 24 Stunden der TGF-β-Behandlung Entfernen von Medien, Zellen mit 4 % Paraformaldehyd in 1 X PBS für 20 min bei Raumtemperatur zu beheben und spülen Sie Zellen mit 1 X PBS.</li>
		<li>Inkubieren Sie mit 0,2 % Triton x-100 für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 X PBS.</li>
		<li>Inkubieren mit Phalloidin-Tetramethylrhodamine B Herstellung von Amanita Phalloides 150-fach verdünnt mit blockierenden Puffer für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 X PBS.</li>
		<li>Färben Sie die Kerne mit Cyanin Nukleinsäure-bindende Farbstoffe für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Spülen-Folien und Mount Deckgläsern verdeckt auf einer Folie mit Folie Montage Medien.</li>
		<li>Mit einem confocal Mikroskop beobachten. Verwenden Sie eine 543 nm-Laser und eine Emission Filter von 560 – 615 nm zur Detektion der Fluoreszenz von Phalloidin. Verwenden Sie ein 633 nm-Laser und eine Emission Filter mehr als 650 nm für nukleare Färbung. Bei der Behandlung mit TGF-β würde Bildung von dicken Stress Fasern beobachtet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VE-Cadherin und α-SMA Färbung
	<ol>
<li>Nach 72 h der TGF-β-Behandlung, Entfernen von Medien, Zellen mit kalten 50 % Methanol und 50 % Aceton fix (0,5 – 1,0 mL pro Well) für 5 Minuten.</li>
		<li>Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 X PBS (0,5 – 1,0 mL pro Well).</li>
		<li>Brüten Sie mit Primärantikörpern in blocking-Puffer über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln nach dem Hersteller empfohlenen Konzentration. Verwenden Sie VE-Cadherin monoklonaler Antikörper (BV13, 1: 100 Verdünnung) und α-SMA Cy3 konjugierten monoklonalen Antikörper (1A4, Verdünnung 1: 200)20.</li>
		<li>Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 X PBS.</li>
		<li>Inkubieren Sie Zellen mit grünen Farbstoff-konjugierten Sekundärantikörper, VE-Cadherin Antikörper blockieren Puffer für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln nach dem Hersteller empfohlenen Konzentration.</li>
		<li>Spülen Sie die Zellen dreimal mit 1 X PBS.</li>
		<li>Färben Sie die Kerne mit Cyanin Nukleinsäure-bindende Farbstoffe für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Spülen-Folien und Mount Deckgläsern verdeckt auf einer Folie mit Folie Montage Medien.</li>
		<li>Mit einem confocal Mikroskop beobachten. Verwenden Sie eine 543 nm-Laser und eine Emission Filter von 560 – 615 nm für die Erkennung von α-SMA (Cy3). Verwenden Sie eine 488 nm-Laser und eine Emission Filter von 505-550 nm für die Erkennung von VE-Cadherin. In der Regel bei der Behandlung mit TGF-β-Behandlung, Abnahme der VE-Cadherin Signale und Anstieg der α-SMA Signale beobachtet werden würde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dreidimensionale Kollagen Gel Kontraktion Assay
<ol><li>Durchführen Sie Kultur des MS-1-Zellen mit/ohne TGF-β für 72 h vor Kollagen Gel Kontraktion Test.</li>
	<li>Vorbereiten den Typ ich Kollagen Gel auf Eis. Mischen Sie kalt Kollagen Lösung, 10-fach konzentriert MEM Medium und Kollagen Verdünnungspuffer mit 0,05 N NaOH, 2,2 % Nahco33und 200 mM HEPES pH 7.4 ein 8:1:1 Verhältnis.</li>
	<li>Mischen Sie 200 mL Kontrolle oder TGF-β-behandelten Endothelzellen Suspensionen (1,0 x 106 Zellen/200 μL) und 800 µl der Kollagen-Gel-Lösung. Für TGF-β behandelte Proben hinzufügen TGF-β2 (1 ng/mL) um die Zellsuspension.</li>
	<li>1,0 mL des Gemisches in jede Vertiefung der Kultur 12-Well-Platten und in den Inkubator bei 37 ° C für 30 – 60 min zu festigen.</li>
	<li>Nach Verkleisterung überlagern Sie 1,0 mL der MEM-α mit 10 % FCS, 50 U/mL Penicillin und 50 μg/mL Streptomycin, das Gel zu schweben. Für TGF-β behandelte Proben hinzufügen TGF-β2 (1 ng/mL) zu den Medien. Hinweis: Für TGF-β behandelte Proben hinzufügen, TGF-β das Gel und Nährmedien.</li>
	<li>Inkubieren Sie die schwimmenden Gele bei 37 ° C für 48 h.</li>
	<li>Scannen Sie die Bilder der Gele aus der Unterseite der Platten mit Hilfe eines Scanners. Alternativ, zeichnen Sie die Bilder mit einer digitalen Kamera in einem festen Abstand über die Gele-Gele.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Gel-Oberfläche basierend auf der Anzahl der Pixel mit ImageJ. Wählen Sie das Gel eine Freihandauswahl oder Verwandte Auswahlwerkzeuge verwenden, oder wählen Sie das Gel mit "Bild | Anpassen | Farbe Schwelle"Werkzeug, und ermitteln Sie den Bereich der Verwendung von Gel" Analyze | Maßnahme"Befehl.</li>
</ol>4. Hemmung der MiRNA Aktivitäten von gesperrt Nukleinsäure-basierte MiRNA Inhibitoren
<ol><li>MS-1-Zellen im standard Kulturbedingungen zu erhalten.</li>
	<li>Transfizieren Sie gesperrt Nukleinsäure (LNA) MiRNA-Inhibitoren, synthetische MiRNA Maisonetten oder SiRNAs (20 oder 50 nM) mit Lipofektion Reagenzien entsprechend Anleitungen des Herstellers. Details und Quellen der LNA MiRNA-Inhibitoren, synthetische MiRNA Maisonetten und SiRNAs wurden in unsere früheren Berichte26,27beschrieben. In MS-1-Zellen standard Transfektion Verfahren anhand der Anweisungen des Herstellers funktionieren gut für Einführung der LNA MiRNA-Inhibitoren, synthetische MiRNA Maisonetten oder SiRNAs.</li>
	<li>Stimulieren Sie nach 16-48 h Endothelzellen mit TGF-β2 (eine Endkonzentration von 1 ng/mL).</li>
	<li>Fahren Sie mit verschiedenen nachgeschalteten Analysen einschließlich RNA Expressionsanalyse (quantitative RT-PCR und RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) Analysen), Immunocytochemical Analyse und Reporter Assay. Nachgeschaltete Analysen wurden in unsere früheren Berichte20,26,27beschrieben.</li>
</ol>

<ol><li>Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases%3A+Developmental+signaling+pathways+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry.</a> Developmental Dynamics. , (2017).</li>
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<li>Maleszewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+and+TGFbeta2+synergistically+induce+endothelial+to+mesenchymal+transition+in+an+NFkappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner.</a> Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-endothelial+transition+contributes+to+cardiac+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization.</a> Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+balance+of+aberrant+Rasal1+promoter+methylation+and+hydroxymethylation+regulates+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis.</a> Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Endothelial+Cells+with+Distinct+Patterns+of+TGFbeta-Driven+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es wurde berichtet, dass aktivierte Ras und TGF-β Behandlung für 24 h EndMT in MS-1-Zellen, induzierten während TGF-β allein nicht EndMT in diesem kurzen Zeitraum21zu induzieren. Konsequent haben wir beobachtet, dass TGF-β wesentlich EndMT nach längerer Behandlung (48-72 h) in MS-1 Zellen20induziert. EndMT wurde wiederholt beobachtet, nachdem längere Behandlung mit TGF-β (2 – 6 Tage) in verschiedenen Endothelzellen wie menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (HUVECS), ...

Endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT) ist der Prozess, durch den ein differenzierter Endothelzellen eine Vielzahl von molekularen Veränderungen in einer Fibroblasten-ähnliche Mesenchymale Zellen1erfährt. EndMT wurde ursprünglich als eine Transformation der Endothelzellen während der Entwicklung des Herzens2,3beschrieben. In einem frühen Entwicklungsstadium der Herzen besteht das Herz Rohr aus einer inneren Endokards und einer äußeren Myokard. Diese beiden Schichten sind durch eine Schicht der extrazellulären Matrix genannt das kardiale Gelee getrennt. Die embryonalen endokardialen Zellen, die Endothelzellen Marker erwerben, transit in Mesenchymale Zellen, dringen in das zugrunde liegende kardiale Gelee, und Bildung von kardialen Kissen, bietet die Grundlage für die ventrikulären Ventile und septum und die Semilunar Ventile. Darüber hinaus wurde EndMT vermutet, zu Quellen von perizyten und vaskulären glatten Muskelzellen in anderen embryonalen Gefäßsysteme einschließlich der Herzkranzgefäße, abdominale Aorta und Lungenarterie4,5,6. Darüber hinaus ist EndMT in physiologischen angiogenen sprießen7verwickelt.
Sammeln Beweise hat vorgeschlagen, dass EndMT auch mehrere Herz-Kreislauf-Krankheiten und anderen Krankheiten1,8beteiligt ist. EndMT verbundenen Bedingungen sind Gefäßverkalkung, Arteriosklerose, pulmonaler arterieller Hypertonie, höhlenartigen Fehlbildung, Orgel Fibrose, Vene Transplantat Umbau, Allograft Dysfunktion im Nieren-Transplantation und Krebs8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. ein kürzlich veröffentlichter Bericht beschrieben, dass mehrere molekulare Marker der EndMT ein Werkzeug für die Diagnose und Prognose Vorhersage der renal Transplantation Dysfunktion bei Nieren-Transplantation17sein können. Modulation des EndMT bedingte zelluläre Signalwege haben gezeigt, dass mehrere Erkrankungen einschließlich kardialer Fibrose zu verbessern und Vene Transplantat Umbau in Tier8,15Modelle. Daher ist das Verständnis der Mechanismen zugrunde liegenden EndMT wichtig, diagnostische und therapeutische Strategien für EndMT zu entwickeln.
EndMT zeichnet sich durch Verlust der Zell-Zell-Verbindungen, Erhöhung der wandernden Potenzial, Herabregulation der endothelialen-spezifischen Gene wie VE-Cadherin und Hochregulation der mesenchymalen Gene unter anderem α-Glattmuskel Aktin (α-SMA). Darüber hinaus sind EndMT und epitheliale-Mesenchymale Transition (EMT), ein ähnlicher Prozess, die Epithelzellen in Mesenchymale Zellen konvertiert mit veränderten Produktion verschiedener Komponenten der extrazellulären Matrix, die zur Entwicklung beitragen können von Gewebe Fibrose8,19.
Vor kurzem haben mehrere in-vitro- Studien von EndMT Details der molekularen Mechanismen von EndMT15,20aufgeklärt. EndMT wird durch verschiedene Signalwege, einschließlich der Umwandlung Wachstumsfaktor (TGF) induziert-β, Wnt, und1Kerbe. Unter ihnen spielt TGF-β entscheidende Rolle in der Induktion von EMT und EndMT. In EndMT verlängert Exposition gegenüber TGF-β Ergebnisse in EndMT in verschiedenen Endothelzellen, während kurze Belichtungszeiten scheint unzureichend21zu sein. Wir beschrieben hier eine einfache Protokoll für EndMT Induktion, wobei Meile SVEN 1 (MS-1) Maus Pankreas mikrovaskuläre Endothelzellen EndMT in Vitro nach längerer Einwirkung von TGF-β20unterziehen. In diesem Modell können mehreren nachgeschaltete Analysen durchgeführt werden, um die typischen Merkmale des EndMT, einschließlich morphologische Veränderungen, Downregulation endotheliale Marker, Hochregulation der mesenchymalen Marker und entzündlichen Gene, Zellskelett untersuchen Umstellungen und Kollagen gel Kontraktion.
Micro-RNAs (MiRNAs) sind ~ 22 nt kleine regulatorische RNAs, die direkte posttranskritionelle Unterdrückung der verschiedenen mRNA Ziele22,23. Durch Samen, Sequenz-vermittelten Zielerfassung MiRNAs Hunderte von Zielgenen zu unterdrücken und zu modulieren, diverse Zellfunktionen wie Zell-Differenzierung, Proliferation und Motilität. Dies gilt auch für die Verordnung von EMT und EndMT, und verschiedene MiRNAs als Regulatoren der EMT und EndMT24,25gemeldet wurden. In diesem Beitrag vorgestellte EndMT-Modell ist mit MiRNA Modulation Verfahren testen Sie die Rollen von MiRNAs in EndMT kombinierbar. Im Rahmen dieser Untersuchung fasst unsere experimentellen Verfahren zur Untersuchung von TGF-β-induzierte EndMT in MS-1-Zellen und umfasst auch Vergleich der Bedingungen der EndMT Induktion von TGF-β in anderen Endothelzellen.

<table><tbody><tr><td>MS-1 Zellen</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2279</td><td></td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32571036</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta2</td><td>R& D</td><td>302-B2-002</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Lab-Tek II Kammer-Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Blocking One</td><td>nacalai tesque</td><td>03953-95</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Tetramethylrhodamin B-Isothiocyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3-iodid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>VE monoklonaler Cadherin-Antikörper (BV13)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-1441-82</td><td></td></tr><tr><td>alpha-SMA Cy3 monoklonaler Antikörper (1A4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenlösung</td><td>Nitta gelatine Inc.</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen-Verdünnungspuffer</td><td>Nitta gelatine Inc.</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>LNA miRNA-Inhibitor</td><td>EXIQON&nbsp;</td><td>miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negativkontrolle B und Ziel-miRNA)</td><td></td></tr><tr><td>synthetische miRNA Duplex</td><td>Qiagen</td><td>miScript miRNA Mimic</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778030</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr></tbody></table>

molekulare analyse der endothelialen mesenchymale transition induziert durch transforming growth factor-β-signalisierung

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phänotypische Plastizität der Endothelzellen zugrunde liegt, Herz-Kreislauf-System-Entwicklung, Herz-Kreislauf-Krankheiten und verschiedenen Bedingungen im Zusammenhang mit Orgel Fibrose. Unter diesen Bedingungen erwerben differenzierte endotheliale Zellen mesenchymalen-ähnlichen Phänotypen. Diesen Prozess nennt man endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT) und zeichnet sich durch Herabregulation der endotheliale Marker, Hochregulation von mesenchymalen Marker und morphologische Veränderungen. EndMT wird durch mehrere Signalwege, einschließlich der Umwandlung Wachstumsfaktor (TGF) induziert-β, Wnt und Kerbe, und reguliert durch die molekularen Mechanismen, die für die Gastrulation, Gewebe Fibrose, ähnlich denen der epitheliale-Mesenchymale Transition (EMT) wichtig und Krebsmetastasen. Verständnis der Mechanismen des EndMT ist wichtig, diagnostische und therapeutische Ansätze für EndMT zu entwickeln. Robuste Induktion der EndMT in Vitro ist nützlich, um gemeinsame Gen Ausdruck Signaturen zu charakterisieren, druggable Molekulare Mechanismen zu identifizieren und Bildschirm für Modulatoren des EndMT. Hier beschreiben wir eine in-vitro- Methode zur Induktion von EndMT. MS-1 Maus Pankreas mikrovaskuläre Endothelzellen unterliegen EndMT nach längerer Einwirkung von TGF-β und Hochregulation der mesenchymalen Marker und morphologische Veränderungen aber auch Induktion von mehreren entzündlichen Chemokinen und Zytokinen. Methoden für die Analyse von MicroRNA (MiRNA) Modulation sind ebenfalls enthalten. Diese Methoden bieten eine Plattform, um die Mechanismen, die EndMT und der Beitrag der MiRNAs, EndMT zu untersuchen.

TGF-β ist ein potenter Induktor von EndMT in verschiedenen Endothelzellen. Nach 24 h Behandlung mit TGF-β in MS-1-Zellen zeigt die Färbung für F-Aktin Reorganisation von Aktin Stress Fasern (Abbildung 1A)20. Vorbehandlung mit einem ROCK-Inhibitor Y-27632 hemmt die Induktion von Aktin Reorganisation20. MS-1 Endothelzellen ändern von einer klassischen Pflasterstein-ähnliche Morphologie eine Mesenchymale spindelför...

Ein Protokoll für in-vitro- Induktion von endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT), die nützlich für die Untersuchung von zelluläre Signalwege an EndMT beteiligt ist, wird beschrieben. In diesem experimentellen Modell ist EndMT durch Behandlung mit TGF-β in MS-1 Endothelzellen induziert.

Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Gefäß- und Krebsbiologie zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen der endothelialen Plastizität bei verschiedenen pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine robuste Induktion von in vitro EndMT durch die Behandlung mit TGF-in MS-1-Endothelzellen erreicht wird. Züchten Sie zunächst die MS-1-Zellen unter Standardkulturbedingungen und vermeiden Sie, dass die Kultur konfluent ist.Anschließend die MS-1-Zellen auf einer 10 cm großen Schüssel mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen. Geben Sie dann 1 ml Trypsin in die Platte und inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann 9 ml Nährmedium zu den trypsinisierten Zellen zur Ablösung.Sammeln Sie dann die trypsinisierte Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen. Die Zellsuspension wird fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300 bis 400 x G zentrifugiert. Verwenden Sie als Nächstes einen automatischen Zellzähler, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu zählen.Anschließend plattieren Sie die MS-1-Zellen auf unbeschichteten Standardkulturplatten für die Langzeitkultur. Nach 24 Stund

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein einfaches Verfahren ist für die Induktion von epithelialen mesenchymale Transition (EMT) in einer Vielzahl von Zelltypen beschrieben. Methoden zur Analyse von Zellen in EMT-Staaten durch Immunzytochemie sind enthalten.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Es wurde gezeigt, dass die alternative Spleißregulation zum epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) beiträgt, einem essentiellen zellulären Programm in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das ein induzierbares EMT-Modell zur Detektion von alternativem Spleißen während der EMT verwendet.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Hier beschreiben wir die Entwicklung und Anwendung eines Gelkontraktionsassays zur Bewertung der kontraktilen Funktion in mesenchymalen Zellen, die einen epithelial-mesenchymalen Übergang durchlaufen haben.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Dieses Manuskript beschreibt einen Röhrenbildungsassay, um die Auswirkungen einer gegebenen Verbindung oder Bedingung auf die Angiogenese zu quantifizieren, indem die Bildung von Endothelzellröhren in einer kontrollierten Umgebung verwendet wird.

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Wir stellen hier ein Zellkulturverfahren für die auf Basis von kombinierten ektopische Expression von microRNA-200 Familienmitgliedern und grainyhead-like 2 (GRHL2) mesenchymale-epithelialen Transitionen (MET) in Sarkomzellen zu induzieren. Dieses Verfahren ist für eine besseren geeignet, die biologische Wirkung der phänotypischen Plastizität auf Krebs Aggressivität und Behandlungen zu verstehen.

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Wir präsentieren einen mit Silikonkautschuk (PDMS) hergestellten Assay mit hoher Durchsatz-Traktionskraft. Dieser neuartige Test eignet sich zur Untersuchung körperlicher Veränderungen der Zellkontraktilität während verschiedener biologischer und biomedizinischer Prozesse und Krankheiten. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode, indem wir eine TGF--abhängige Erhöhung der Kontraktilität während des epitheliaal-mesenchymalen Übergangs messen.

Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie mit PDMS zeigt dosisabhängige Effekte transformierender Wachstumsfaktoren auf den epitheliaal-mesenchymalen Übergang

MiRNA-Therapeutika haben erhebliches Potenzial bei der Regulierung der Tumorprogression. Hier demonstriert werden analytische Ansätze zur Identifikation der Aktivität einer kombinatorischen MiRNA-Behandlung in der Eindämmung des Zellzyklus und Angiogenese verwendet.

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Wir beschreiben einen systematischen Workflow zur Untersuchung der TGF-β Signalisierung und tGF-β-induzierten EMT, indem wir die Protein- und Genexpression untersuchen, die an diesem Signalweg beteiligt sind. Die Methoden umfassen Western Blotting, ein Luziferase Reporter Assay, qPCR, und Immunfluoreszenz Färbung.

Untersuchung von TGF-β Signalisierung und TGF-β-induzierten epitheliaal-mesenchymalen Übergang bei Brustkrebs und normalen Zellen

Wir beschreiben Methoden zur Untersuchung von TGF-β2-induzierter EndMT in Endothelzellen, indem wir Veränderungen der Zellmorphologie beobachten und die Expression EndMT-bedingte Markerveränderungen mittels Immunfluoreszenzfärbung untersuchen. CrispR/Cas9-Gen-Editing wurde beschrieben und verwendet, um das Gen zu erschöpfen, das für Snail kodiert, um seine Rolle bei TGF-β2-induzierter EndMT zu untersuchen.

TGF-β-vermittelter endothelialer zu mesenchymaler Übergang (EndMT) und die funktionelle Bewertung von EndMT-Effektoren mittels CRISPR/Cas9-Gen-Editing

Hier etablieren wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Visualisierung und Analyse mehrerer SMAD-Komplexe mittels Proximity Ligation Assay (PLA) in Endothelzellen, die pathologischen und physiologischen Flüssigkeitsscherstressbedingungen ausgesetzt sind.

Visualisierung und Quantifizierung der TGFβ/BMP/SMAD-Signalisierung unter verschiedenen Fluidscherspannungsbedingungen mittels Proximity-Ligation-Assay

Das vorliegende Protokoll ermöglicht die Wiederherstellung von röhrenartigen Strukturen, die im klassischen in vitro Angiogenese-Röhrenbildungsassay gebildet wurden, bei dem Zellen, wie z. B. Trophoblastzellen, in kapillarartigen Strukturen über einer Schicht aus extrazellulärer Basalmembranmatrix organisiert sind. Die gewonnenen Strukturen werden zur RNA- und Proteinisolierung für verschiedene biochemische Analysen verwendet.

Trophoblastenzellgewinnung aus Angiogenese-Röhrchenbildungsassay für die Analyse der Differenzierungsmarkerexpression

Erfahren Sie die endothelial-mesenchymale Transition in MS-1-Zellen durch TGF-β2-Behandlung zur Analyse morphologischer und molekularer Veränderungen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von EndMT-Mechanismen in der Gefäßbiologie.

Molekulare Analyse der endothelialen Mesenchymale Transition induziert durch Transforming Growth Factor-β-Signalisierung

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