Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, den Beitrag des Protonentransports zur Rate des bakteriellen extrazellulären Elektronentransports durch den Nachweis des kinetischen Isotopeneffekts von Deuterium zu beobachten. Unsere Methode zeigt den Einfluss des Protonentransports auf die Kinetik des extrazellulären Elektronentransports (EET) von Bakterien zu einer Elektrode über c-Typ-Cytochrome der äußeren Membran. Unser Assay spiegelt das native Protonenmanagement bei der EET wider, da wir lebende Bakterien anstelle von gereinigten Enzymen verwendet haben.

Unsere Herausforderung bestand jedoch darin, die Geräusche von anderen zellulären Prozessen zu entfernen. Der kinetische Isotopeneffekt von Deuterium, der als KIE bezeichnet wird, ist eine der besten Techniken, um den Beitrag des Protonentransports zum damit verbundenen Elektronentransportprozess zu untersuchen. Um Shewanella MR-1-Zellen zu züchten, überführen Sie eine Kolonie der auf einer Agarplatte gezüchteten Zellen in 15 Milliliter LB-Medium.

Züchten Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius unter aeroben Bedingungen mit Schütteln bei 160 U/min. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 10 Minuten lang bei der 6.000-fachen Schwerkraft. Dann resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet in 15 Millilitern definiertem Medium, ergänzt mit 10 Millimolarlactat als Kohlenstoffquelle und 0,5 Gramm Hefeextrakt pro Liter als Spurenelemente für die Zellen.

Nach weiterer Kultivierung der Zellsuspension aerobe bei 30 Grad Celsius für 12 Stunden mit Schütteln bei 160 U/min erneut bei 6.000-facher Schwerkraft für 10 Minuten zentrifugieren. Waschen Sie das resultierende Zellpellet zweimal mit DM-Medium durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 6.000-facher Schwerkraft, bevor Sie das elektrochemische Experiment durchführen. Um einen elektrochemischen Reaktor mit drei Elektroden zu konstruieren, platzieren Sie ein ITO-Substrat als Arbeitselektrode am Boden des Reaktors.

Setzen Sie anschließend einen Glaszylinder und eine Abdeckung aus Polytetrafluorethylen ein und führen Sie einen Platindraht als Gegenelektrode ein. Führen Sie dann eine Silberchloridelektrode als Referenzelektrode in den Reaktor ein. Als nächstes geben Sie vier Milliliter TM, ergänzt mit 10 Millimolarlactat und 0,5 Gramm Hefeextrakt pro Liter, in den elektrochemischen Reaktor.

Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass es keine Leckage aus dem elektrochemischen Reaktor gibt, strömen Sie das Stickstoffgas über 20 Minuten in den elektrochemischen Reaktor, um die anerobischen Bedingungen im elektrochemischen Reaktor aufrechtzuerhalten. Schließen Sie den elektrochemischen Reaktor an einen Potentiostaten an und legen Sie positive 0,4 Volt an die ITO-Elektrode an, wobei die Temperatur des elektrochemischen Reaktors mit Hilfe eines externen Wasserzirkulationssystems auf 30 Grad Celsius gehalten wird. Um eine elektrochemische Kultivierung durchzuführen, stellt man zunächst die Zelldichte der Suspension auf eine optische Dichte von 1,43 bei 600 Nanometern ein, wobei TM mit 10 Millimolarlactat und 0,5 Gramm pro Liter Hefeextrakt ergänzt wird.

Geben Sie 0,3 Milliliter der Zellsuspension mit einer Spritze durch die Injektionsöffnung in den elektrochemischen Reaktor. Der OD 600 im Reaktor ändert sich auf 0,1. Setzen Sie die potenzielle Anwendung bei positiven 0,4 Volt an der ITO-Elektrode für 25 Stunden fort.

Stoppen Sie die mögliche Anwendung und trennen Sie den elektrochemischen Reaktor vom Potentiostaten und dem Wasserkreislaufsystem. Das Stickstoffgas wird über einen Zeitraum von 20 Minuten in eine Flasche mit TM mit 10 Millimolarlactat geleitet, um dem Medium Sauerstoff zu entziehen. Entfernen Sie nun extrem langsam und vorsichtig den gesamten Überstand aus dem Inneren des elektrochemischen Reaktors mit einer Spritze unter strömendem Stickstoffgas.

Fügen Sie dann vier Milliliter frisches TM mit 10 Millimolarem Laktat mit einer Spritze hinzu. Kippen Sie den elektrochemischen Reaktor, um den gesamten Überstand an der Wand des Reaktors zu entfernen. Wiederholen Sie diese Schritte insgesamt dreimal.

Stoppen Sie den Gasfluss und schließen Sie den elektrochemischen Reaktor wieder an den Potentiostaten an, indem Sie positive 0,4 Volt an die ITO-Elektrode bei 303 Kelvin anlegen. Vergewissern Sie sich, dass die derzeitige Produktion aus einem Monolayer-Biofilm von Shewanella MR-1 stabil ist und nicht schnell zunimmt. Wenn die Strömung stark ansteigt, warten Sie, bis sich die Strömung mit einem Anstieg von 5 % über 10 Minuten stabilisiert hat.

Geben Sie extrem langsam und schonend 40 Mikroliter anoxisches D2O mit einer Spritze in den elektrochemischen Reaktor, so dass die Konzentration im Reaktor 0,5 Volumenprozent D2O beträgt. Um eine Schädigung des Biofilms durch D20-Zugabe zu verhindern, injizieren Sie das D2O tropfenweise. Warten Sie, bis sich der Strom stabilisiert hat, und fügen Sie anschließend den D2O-Wert auf bis zu 4,4 Volumenprozent hinzu, um den KIE-Wert zu erhalten, der das Verhältnis von aktueller Produktion und Vorhandensein von D2O und H2O ist.

Überprüfen Sie die Auswirkungen des gleichen Volumens der H2O-Zugabe auf die aktuelle Produktion. Hier ist die durchgezogene Linie das repräsentative Ergebnis für die mikrobielle Stromänderung, die durch D2O-Zugabe induziert wird. Die Zugabe von D2O verringerte den mikrobiellen Strom innerhalb von 10 Sekunden stark, während H20 fast keine Stromabnahme aufwies, wie in der gestrichelten Linie dargestellt

Um zu bestätigen, dass die beobachtete Stromabnahme durch D2O auf den Elektronentransport durch die Cytochrome der äußeren Membran zurückzuführen ist, wurde ein diffundierender Elektronenmediator verwendet. Hier erhöhte die Zugabe von 100 mikromolaren alpha-AQS die aktuelle Produktion um mehr als das Fünffache und die aktuelle Produktion blieb von der D2O-Zugabe unberührt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kinetik der Stoffwechselreaktionen schnell genug ist, so dass der extrazelluläre Elektronentransferprozess geschwindigkeitsbegrenzend ist.

Eine alternative Methode, um dies zu beurteilen, ist die Zugabe des Flavinmoleküls in den elektrochemischen Reaktor. Ein sofortiger anodischer Stromanstieg durch Flavin-Addition deutet auf eine Geschwindigkeitsbegrenzung durch den Elektronentransportprozess über die Cytochrome der äußeren Membran hin. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Effekt der kinetischen Isotope auf den extrazellulären Elektronentransportprozess untersuchen können.

Der kritischste Punkt, um den kinetischen Isotopeneffekt erfolgreich zu erzielen, ist die Klärung und Bestätigung des Zustands, in dem der Elektronentransport durch die Cytochrome der äußeren Membran die Rate der Stromproduktion begrenzt. In diesem Video haben wir zwei Methoden vorgestellt, um diesen Zustand zu bestätigen: die Beobachtung der Stromänderung durch Zugabe von Flavin und durch Zugabe von diffundierenden zusätzlichen Mediatoren, wie z.B. alpha-AQS. Sobald die Geschwindigkeitsbegrenzung bestätigt ist, kann dieses System nicht nur für das Deuterium-Experiment, sondern auch für die biochemische Charakterisierung von Cytochromen der äußeren Membran verwendet werden.

Darüber hinaus könnte dieses Protokoll auf die Untersuchung anderer elektroaktiver Mikroben anwendbar sein, solange der extrazelluläre Elektronentransportprozess geschwindigkeitsbegrenzend ist. Unsere Methodik bietet eine grundlegende und allgemeine Technik, um den extrazellulären Elektronentransportprozess über Cytochrome der äußeren Membran in vivo zu untersuchen.