Name: Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Erfahren Sie die elektrochemische Detektion des Deuterium-Kinetik-Isotopeneffekts bei Shewanella oneidensis MR-1. Diese Methode untersucht den Protonentransport im extrazellulären Elektronentransport lebender Bakterien.

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Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe für speziell gefördert Forschung von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-Nummer 24000010, 17 H 04969, und JP17J02602, die uns Office of Naval Research Global (N62909-17-1-2038) finanziell unterstützt. Y.T JSPS Research Fellow und unterstützt von JSPS durch das Programm für führende Graduierten Schulen (Verdienst).

1. Bildung von Biofilm Monolayer von S. Oneidensis MR-1 auf einer ITO-Elektrode (Abbildung 1)
Hinweis: Um die Kontamination des elektrochemischen Reaktors mit anderen Mikroben zu verhindern, sollten alle Medien, Geräte und Komponenten des elektrochemischen Reaktors im Voraus sterilisiert werden. Wenn MR. S. Oneidensis -1 Zellen und konstruieren die elektrochemischen Reaktoren, alle Verfahren auf einer sauberen Werkbank durchgeführt werden sollten.
<ol><li>Kultivierung von S. Oneidensis MR-1 Zellen Hinweis: Ein Monolage Biofilm von S. Oneidensis MR-1 entstand auf einer ITO Elektrode nach den Bedingungen berichtete zuvor4.<ol>
<li>Um S. Oneidensis MR-1 Zellen wachsen, fügen Sie eine Kolonie von S. Oneidensis MR-1 auf einer nährbodenplatte bestehend aus Luria-Bertani (LB) (20 g/L) und Bacto Agar (15 g/L) in 15 mL LB-Medium (20 g/L) bei 30 ° C für 24 h unter aeroben Bedingungen mit 160 u/min schütteln angebaut.</li>
		<li>Die Zellsuspension bei 6.000 × g für 10 min zentrifugieren und Aufschwemmen der daraus resultierenden Zelle Pellet in 15 mL definierte Medium (pH 7,8) (DM: Nahco33 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] und 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] Ethanesulfonic Säure [HEPES; 7,2 g/L]), ergänzt mit 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefeextrakt als Quelle von Kohlenstoff, und Spurenelemente für S. Oneidensis MR-1 , beziehungsweise.</li>
		<li>Weiter kultivieren die Zellsuspension aerob bei 30 ° C für 12 h unter Schütteln bei 160 u/min und Zentrifugieren wieder bei 6.000 × g für 10 min. waschen das resultierende Zelle Pellet zweimal mit DM Medium durch Zentrifugation für 10 min bei 6000 × g vor der elektrochemischen Experimentieren Sie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bau eines elektrochemischen drei-Elektroden-Reaktors (Abbildung 1)<ol>
<li>Setzen Sie ein Substrat ITO als Arbeitselektrode an der Unterseite des Reaktors.</li>
		<li>Anschließend fügen Sie einen Glaszylinder (Durchmesser 2 cm) und ein Cover von Polytetrafluorethylen (PTFE). Dann fügen Sie Ag/AgCl (KCl gesättigt) und einem Platindraht in den Reaktor als die Referenz und Zähler Elektroden bzw.. Hinweis: Um das Austreten von Luft und Lösung zu verhindern, legen Sie ein Butyl-Kautschuk-Blatt zwischen einzelnen Komponenten.</li>
		<li>Fügen Sie 4,0 mL DM ergänzt mit 10 mM Laktat und Hefeextrakt 0,5 g/L in den elektrochemischen Reaktor hinzu.</li>
		<li>Fließen Sie nachdem Sie bestätigt haben, dass gibt es keine Leckage aus dem elektrochemischen Reaktor die Stickstoffgas in den elektrochemischen Reaktor über 20 min, anaerobe Bedingungen innerhalb des elektrochemischen Reaktors aufrechtzuerhalten. Hinweis: Um Verunreinigungen mit anderen Mikroben zu verhindern, sollte das Gas gefiltert werden, bevor es in den elektrochemischen Reaktor fließt.</li>
		<li>Verbinden Sie den elektrochemischen Reaktor mit einem potentiostaten und + 0,4 V gelten (im Vergleich zu standard-Wasserstoff-Elektrode, sie) auf die ITO-Elektrode, wobei die Temperatur des elektrochemischen Reaktors bei 30 ° C mit einer externen Wasserkreislauf. Hinweis: Um die Wirkung eines externen elektrischen Feldes zu verhindern, sollte der elektrochemische Reaktor in einen Faradayschen Käfig platziert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektrochemische Kultivierung von S. Oneidensis MR-1 Zellen (Abbildung 1 und Abbildung 2)<ol>
<li>Passen Sie die Zelle Dichte der Suspension in Schritt 1.1 zu einer optischen Dichte von 1,43 bei 600 erhaltenen nm (OD600) mit DM 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefe ergänzt zu extrahieren. Hinweis: Um die richtige OD600zu erhalten, gelten Sie die Zellsuspension OD600 ≤ 0,8 für eine UV-Vis-Spektrometer vor Einstellen der OD600 bis 1,43.</li>
		<li>Hinzufügen von 0,3 mL Zellsuspension in den elektrochemischen Reaktor durch die Injektion Port mit einer Spritze: die OD600 im Reaktor ändert sich auf 0,1. Hinweis: Die Zugabe von 0,3 mL Zellsuspension mit OD600 = 1,43 in elektrochemischen Reaktor mit 4,0 mL mittlere Ergebnissen in 4,3 mL der Lösung mit einer OD600 = 0,1. Bei Verwendung von anderen Reaktoren mit unterschiedlichen Volumina ist die Berechnung der Zelldichte erforderlich.</li>
		<li>Die mögliche Anwendung auf + 0,4 V (gegen sie), die ITO-Elektrode für 25 h fort. Hinweis: Für die Bildung von Biofilm Monolage auf einer ITO-Elektrode, sicherzustellen Sie, dass der erzeugte Strom eine Abweichung von weniger als 50 % aus Abbildung 2zeigt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Ersatz des Überstands mit frischen DM Medium mit 10 mM Laktat (Abbildung 3)
<ol><li>Die mögliche Anwendung zu stoppen und die potentiostaten und den Wasserkreislauf den elektrochemischen Reaktor trennen.</li>
	<li>Laktat-Ersatz des Überstands mit frischen DM Medium mit 10 mM<ol>
<li>Das Stickstoffgas fließen in eine Flasche mit DM mit 10 mM Laktat über 20 min, Sauerstoff vom Medium zu entfernen.</li>
		<li>Entfernen Sie langsam den überstand im elektrochemischen Reaktor mit einer Spritze unter fließendem Stickstoffgas (Abb. 3a, b). Hinweis: Um zu vermeiden, brechen den Biofilm auf die ITO-Elektrode durch Stickstoffgas, sollte das Gas über der Flüssigkeitsoberfläche fließen.</li>
		<li>Zugeben Sie 4,0 mL frische DM mit 10 mM Laktat mit einer Spritze (Abb. 3 c). Hinweis: Um zu vermeiden, brechen den Biofilm auf die ITO-Elektrode, injizieren Sie langsam das Medium entlang der Mauer des elektrochemischen Reaktors. Um den Biofilm feucht zu halten, sollte das Medium sofort nach dem Entfernen des Überstandes hinzugefügt werden. Injektion von der Mittel-bis zu 1 min nach dem Entfernen des Überstandes beeinträchtigt nicht die aktuelle Produktion aus der Biofilm von S. Oneidensis MR-1.</li>
		<li>Schräge des elektrochemischen Reaktors Entfernen aller der Überstand an der Wand des elektrochemischen Reaktors befestigt.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2-2.2.4 in insgesamt drei Mal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stoppen Sie den Gasstrom zu und verbinden Sie den elektrochemischen Reaktor mit dem potentiostaten wiederum die ITO-Elektrode bei 303 k + 0,4 V (gegen sie) zuweisen</li>
</ol>(3) Zugabe von Deuterium Wasser zur Messung der KIE auf den EET-Prozess (Abbildung 4)
<ol><li>Bestätigen Sie, dass die laufenden Produktion aus einem monomolekularen Film Biofilm von S. Oneidensis MR-1 stabil ist und wird nicht schnell erhöht. Wenn der Strom steil steigt, warten Sie, bis der Strom innerhalb einer Erhöhung um 5 % über 10 min stabilisiert. Hinweis: Eine Monolage Biofilmbildung auf eine ITO-Elektrode ohne Kontamination der andere mikrobielle Stämme rDNA Sequenzen und ein Scan Elektron mikroskopische Bild des Biofilms auf eine ITO-Elektrode, bestätigte wie zuvor4berichtet. Zur Bestätigung der Rate Beschränkung durch die EET Prozess überwachen Sie den Effekt des Hinzufügens pendelt Elektron Mediatoren wie 100 µM anthraquinon-1-Sulfonate (α-AQS). Siehe Abschnitt Vertreter Ergebnisse und15 für weitere Details verweisen.</li>
	<li>Fügen Sie 40 µL anoxischen 50 % (V/V) D2O in den elektrochemischen Reaktor mit einer Spritze, so dass die Konzentration 0,5 % (V/V) D2O im Reaktor. Hinweis: Zur Vermeidung von Schäden an den Biofilm durch D2O Zusatz injizieren Sie D2O tropfenweise.</li>
	<li>Warten Sie, bis des Stroms zu stabilisieren, und anschließend fügen Sie die D-2O bis zu 4,0 % (V/V). Hinweis: Um den KIE-Wert (das Verhältnis der laufenden Produktion in Anwesenheit D2O und H2O) zu erhalten, überprüfen Sie die Wirkung des gleichen Volumens von H2O Zusatz auf der aktuellen Produktion.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Unsere ganze Zelle elektrochemischen Test hat einige technische Vorteile verglichen mit Protein Elektrochemie. Während Proteinreinigung mehrstufige zeitaufwändige Verfahren erfordert, dauert unsere gesamte-Cell-Methode einen Tag von selbstorganisierten Biofilmbildung nach Zellkultur. Um eine stabile Wechselwirkung zwischen OM czu erreichen - Cyts und der Elektrode, brauchen wir nur Sterilisation und Reinigung der Elektrodenoberfläche; Es erfordert keine Elektrode Modifikation für organisieren die Ausrichtung der...

Elektrochemische Techniken um ein Redox-Protein in einer intakten bakteriellen Zelle direkt zu charakterisieren sind seit der Entdeckung der Metall-reduzierende mikrobielle Belastungen, z. B. S. Oneidensis MR-1 oder Geobacter Sulfurreducens PCA vor kurzem entstanden, äußere Membran Cytochrom c-Typ-komplexe (OM c-Cyts) ausgesetzt, die Zelle außen1,2,3,4,5haben. Das OM cvermitteln - Cyts Elektronentransport aus der Atmungskette auf festen Untergründen befindet sich extrazellulär. Dieser Transport wird als extrazelluläre Elektronentransport (EET)1,6 bezeichnet und ist ein kritischer Prozess für neue Biotechnologien, wie mikrobielle Brennstoffzellen-6. Daher, um die zugrunde liegenden EET-Kinetik und Mechanismen und seiner Verbindung zum mikrobielle Physiologie verstehen, OM c -Cyts wurden untersucht mit ganzen Zelle Elektrochemie4,7, kombiniert mit Mikroskopie 8 , 9, Spektroskopie10,11und Molekularbiologie2,4. Im Gegensatz dazu haben Methoden, um den Einfluss der EET-assoziierten kation Transport, z. B. Protonen, auf EET Kinetik in lebenden Zellen untersuchen kaum trotz PROTONENTRANSPORT über bakterielle Membranen haben eine entscheidende Rolle im festgestellt wurde, Signalisierung, Homöostase und Energie Produktion12,13,14. In der vorliegenden Studie, beschreiben wir eine Technik, um die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT auf EET Kinetik in der S. Oneidensis MR-1 Zelle mit Hilfe von ganzen Zelle elektrochemischen Messungen, zu untersuchen, die die Identifikation der Bandbreitenbegrenzung Schritt erfordert mikrobielle aktuelle Produktion15.
Eine direkte Möglichkeit, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT auf die damit verbundenen EET zu bewerten ist der Deuterium-kinetische Isotop-Effekt (KIE). Die KIE ist zu beobachten, wie die Veränderung der Electron Transfer Kinetik auf den Ersatz von Protonen mit Deuterium-Ionen, der die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT Electron Transfer Kinetik16darstellt. Die Theorie der KIE selbst hat mit elektrochemischen Messungen mit gereinigtem Enzyme17gut etabliert. Jedoch da aktueller Produktion in S. Oneidensis MR-1 aus mehrere, unterschiedliche und schwankende Prozesse18, kann man einfach EET als die Bandbreitenbegrenzung Prozess nicht identifizieren. Um die KIE auf Proton Transportprozesse gepaart mit EET zu beobachten, müssen wir bestätigen, dass die mikrobiellen laufenden Produktion durch Elektronentransport durch OM cbegrenzt ist - Cyts an der Elektrode. Zu diesem Zweck haben wir die überstehende Lösung durch frisches Medium mit einer hohen Konzentration von Laktat als ein Elektron Spender an der optimalen pH und Temperaturbedingungen vor KIE Messung ersetzt; Dieser Ersatz diente zwei Rollen: (1) erhöht die Rate der vorgelagerten Stoffwechselprozesse im Vergleich zu den EET, und (2) ausgelassen die Zellen Schwimmen im überstand der Monolage Biofilm von S. Oneidensis MR-1 auf den arbeitenden Elektrode (befreit Indium-Zinn-dotierte oxid (ITO)-Elektrode). Die vorgestellte ausführliche Protokoll soll helfen neue Praktiker erhalten und bestätigen, dass die EET-Bestimmung Schritt erfolgt.

<table><tbody><tr><td>Glaszylinder</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung, die als Abdeckung und Basis des elektrochemischen Reaktors verwendet</td></tr><tr><td>wird</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung, die als Abdeckung und Grundlage des elektrochemischen Reaktors verwendet wird</td></tr><tr><td>Hüttylkautschuk</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung, eingefügt zwischen den einzelnen Komponenten des elektrochemischen Reaktors</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>Wird als Injektionsöffnung einer elektrochemischen Reaktorelektrode</td></tr><tr><td>verwendet Indiumzinn-dotiertes Oxid (ITO)</td><td>GEOMATEC</td><td>Nr. 0001</td><td>Wird als Arbeitselektrode verwendet, 5&Omega;/sq</td></tr><tr><td>Ag/AgCl KCl gesättigte Elektrode</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>Wird als Referenzelektrode verwendet, &Phi; 0,30 mm</td></tr><tr><td>Platindraht</td><td>The Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>Wird als Gegenelektrode</td></tr><tr><td>verwendet Luria-Bertani (LB) Broth, Miller</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>244620</td><td>Medium für die Vorkultivierung von S. oneidensis MR-1</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Anthrachinon-1-sulfonat (&alpha;-AQS)</td><td>TCI</td><td>A1428</td><td></td></tr><tr><td>Flavin-Mononukleotid (FMN)</td><td>Wako</td><td>184-00831</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>Wird für definiertes Medium (DM)</td></tr><tr><td>CaCl2 & Middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>Verwendet für DM</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>Verwendet für DM</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>Wird für DM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Verwendet für DM</td></tr><tr><td>2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure (HEPES)</td><td>DOJINDO</td><td>346-08235</td><td>Verwendet für DM-Natriumlactatlösung</td></tr><tr><td></td><td>Wako</td><td>195-02305</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Hefeextrakt</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxid (D, 99,9 %)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-PK</td><td>Additiv für Experimente mit kinetischem Isotopeneffekt</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>Wird für die Vorkultivierung</td></tr> verwendet <tr><td>Schüttler</td><td>TAITEC</td><td>NR-3</td><td>Wird für die Vorkultivierung</td></tr><tr><td>verwendet Autoklavenmaschine</td><td>TOMY SEIKO CO., LTD.</td><td>LSX-500</td><td>Wird zur Sterilisation des elektrochemischen Reaktors und des Mediums verwendet</td></tr><tr><td>Reinbank</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>Wird verwendet, um die Kontamination des elektrochemischen Reaktors und des Mediums mit anderen Mikroben zu verhindern</td></tr><tr><td>Zentrifugenseparator</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>Drehzahl bis zu 6000x; g wird benötigt</td></tr><tr><td>Stickstoffgasgenerator</td><td>Puequ CO. LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>Stickstoffgasflasche kann auch anstelle des Gasgenerators verwendet werden</td></tr><tr><td>UV-Vis-Spektrometer</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>Wird zur Optimierung der Zelldichte verwendet</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>Wird für Biofilmbildung und Experimente mit kinetischen Isotopeneffekten verwendet</td></tr><tr><td>Thermalwasserzirkulator</td><td>AS ONE</td><td>TR-1A</td><td>Wird zur Aufrechterhaltung der Temperatur des elektrochemischen Reaktors verwendet</td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>Wird für elektrochemische Experimente verwendet</td></tr></tbody></table>

elektrochemische detektion von deuterium kinetische isotop effekt auf extrazelluläre elektronentransport in shewanella oneidensis mr-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direkte elektrochemische Detektion von c-Typ Cytochrom-komplexe, eingebettet in die äußeren bakterienmembran (äußere Membran c-Typ Cytochrom-komplexe; OM c- Cyts) hat vor kurzem erwies sich als eine neuartige ganze Zelle analytische Methode um den bakteriellen Elektronentransport aus der Atmungskette der Zelle äußeren zu charakterisieren, als die extrazelluläre Elektronentransport (EET) bezeichnet. Während der Weg und die Kinetik der Elektronenfluss während der EET Reaktion untersucht wurden, hat eine ganze Zelle elektrochemische Methode zu prüfen, die Auswirkungen des kation Verkehrs EET zugeordnet noch nicht etabliert. In der vorliegenden Studie wird ein Beispiel für eine biochemische Technik zu prüfen, die Deuterium kinetische Isotop Wirkung (KIE) auf EET durch OM c- Cyts mit einem Modell Mikrobe, Shewanella Oneidensis MR-1, beschrieben. Die KIE auf den EET-Prozess erhalten Sie EET durch OM c- Cyts fungiert als die Bandbreitenbegrenzung Schritt in der mikrobiellen laufenden Produktion. Zu diesem Zweck vor der Zugabe von D2O ersetzte die überstehende Lösung mit frischen Medium mit einer ausreichenden Menge an der Elektron-Spender, die Rate der vorgelagerten Stoffwechselreaktionen zu unterstützen und eine einheitliche planktonischen Zellen entfernen Monolage Biofilm an der Arbeitselektrode. Alternative Methoden zur Bestätigung die Bandbreitenbegrenzung Schritt mikrobielle laufende Produktion als EET durch OM c- Cyts werden ebenfalls beschrieben. Unsere Technik eines ganzen Zelle elektrochemische Assays für die Untersuchung von Proton Transport Kinetik kann auf andere Elektroaktive mikrobielle Belastungen angewendet werden.

Nach 25 h mögliche Anwendung auf + 0,4 V (gegen sie) bildete ein monomolekularen Film Biofilm auf die Arbeitselektrode ITO Glas, zuvor durch ein Rasterelektronenmikroskop oder einem konfokalen Mikroskopie4bestätigt wurde. Der repräsentative zeitliche Verlauf der aktuellen Produktion von S. Oneidensis MR-1 während einer Monoschicht Biofilmbildung ist in Abbildung 2dargestellt. Obwohl der Strom in jeder Messung verändert, wird d...

Hier präsentieren wir ein Protokoll der gesamten Zelle elektrochemische Experimente, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT, die Rate der extrazellulären Elektronentransport über die äußere Membran Zellfarbstoffe Komplex in Shewanella Oneidensis MR-1 zu studieren.

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, den Beitrag des Protonentransports zur Rate des bakteriellen extrazellulären Elektronentransports durch den Nachweis des kinetischen Isotopeneffekts von Deuterium zu beobachten. Unsere Methode zeigt den Einfluss des Protonentransports auf die Kinetik des extrazellulären Elektronentransports (EET) von Bakterien zu einer Elektrode über c-Typ-Cytochrome der äußeren Membran. Unser Assay spiegelt das native Protonenmanagement bei der EET wider, da wir lebende Bakterien anstelle von gereinigten Enzymen verwendet haben.Unsere Herausforderung bestand jedoch darin, die Geräusche von anderen zellulären Prozessen zu entfernen. Der kinetische Isotopeneffekt von Deuterium, der als KIE bezeichnet wird, ist eine der besten Techniken, um den Beitrag des Protonentransports zum damit verbundenen Elektronentransportprozess zu untersuchen. Um Shewanella MR-1-Zellen zu züchten, überführen Sie eine Kolonie der auf einer Agarplatte gezüchteten Zellen in 15 Milliliter LB-Medium.Züchten Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius unter aeroben Bedingungen mit Schütteln bei 160 U/min. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 10 Minuten lang bei der 6.000-fachen Schwerkraft. Dann resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet in 15 Millilitern definiertem Medium, ergänzt mit 10 Millimolarlactat als Kohlenstoffquelle und 0,5 Gramm Hefeextrakt pro Liter als Spurenelemente für die Zellen.Nach weiterer Kultivierung der Zellsuspension aerobe bei 30 Grad Celsius für 12 Stunden mit Schütteln bei 160 U/min erneut bei 6.000-facher Schwerkraft für 10 Minuten zentrifugieren. Waschen Sie das resultierende Zellpellet zweimal mit DM-Medium durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 6.000-facher Schwerkraft, bevor Sie das elektrochemische Experiment durchführen. Um einen elektrochemischen Reaktor mit drei Elektroden zu konstruieren, platzieren Sie ein ITO-Substrat als Arbeitselektrode am Boden des Reaktors.Setzen Sie anschließend einen Glaszylinder und eine Abdeckung aus Polytetrafluorethylen ein und führen Sie einen Platindraht als Gegenelektrode ein. Führen Sie dann eine Silberchloridelektrode als Referenzelektrode in den Reaktor ein. Als nächstes geben Sie vier Milliliter TM, ergänzt mit 10 Millimolarlactat und 0,5 Gramm Hefeextrakt pro Liter, in den elektrochemischen Reaktor.Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass es keine Leckage aus dem elektrochemischen Reaktor gibt, strömen Sie das Stickstoffgas über 20 Minuten in den elektrochemischen Reaktor, um die anerobischen Bedingungen im elektrochemischen Reaktor aufrechtzuerhalten. Schließen Sie den elektrochemischen Reaktor an einen Potentiostaten an und legen Sie positive 0,4 Volt an die ITO-Elektrode an, wobei die Temperatur des elektrochemischen Reaktors mit Hilfe eines externen Wasserzirkulationssystems auf 30 Grad Celsius gehalten wird. Um eine elektrochemische Kultivierung durchzuführen, stellt man zunächst die Zelldichte der Suspension auf eine optische Dichte von 1,43 bei 600 Nanometern ein, wobei TM mit 10 Millimolarlactat und 0,5 Gramm pro Liter Hefeextrakt ergänzt wird.Geben Sie 0,3 Milliliter der Zellsuspension mit einer Spritze durch die Injektionsöffnung in den elektrochemischen Reaktor. Der OD 600 im Reaktor ändert sich auf 0,1. Setzen Sie die potenzielle Anwendung bei positiven 0,4 Volt an der ITO-Elektrode für 25 Stunden fort.Stoppen Sie die mögliche Anwendung und trennen Sie den elektrochemischen Reaktor vom Potentiostaten und dem Wasserkreislaufsystem. Das Stickstoffgas wird über einen Zeitraum von 20 Minuten in eine Flasche mit TM mit 10 Millimolarlactat geleitet, um dem Medium Sauerstoff zu entziehen. Entfernen Sie nun extrem langsam und vorsichtig den gesamten Überstand aus dem Inneren des elektrochemischen Reaktors mit einer Spritze unter strömendem Stickstoffgas.Fügen Sie dann vier Milliliter frisches TM mit 10 Millimolarem Laktat mit einer Spritze hinzu. Kippen Sie den elektrochemischen Reaktor, um den gesamten Überstand an der Wand des Reaktors zu entfernen. Wiederholen Sie diese Schritte insgesamt dreimal.Stoppen Sie den Gasfluss und schließen Sie den elektrochemischen Reaktor wieder an den Potentiostaten an, indem Sie positive 0,4 Volt an die ITO-Elektrode bei 303 Kelvin anlegen. Vergewissern Sie sich, dass die derzeitige Produktion aus einem Monolayer-Biofilm von Shewanella MR-1 stabil ist und nicht schnell zunimmt. Wenn die Strömung stark ansteigt, warten Sie, bis sich die Strömung mit einem Anstieg von 5 % über 10 Minuten stabilisiert hat.Geben Sie extrem langsam und schonend 40 Mikroliter anoxisches D2O mit einer Spritze in den elektrochemischen Reaktor, so dass die Konzentration im Reaktor 0,5 Volumenprozent D2O beträgt. Um eine Schädigung des Biofilms durch D20-Zugabe zu verhindern, injizieren Sie das D2O tropfenweise. Warten Sie, bis sich der Strom stabilisiert hat, und fügen Sie anschließend den D2O-Wert auf bis zu 4,4 Volumenprozent hinzu, um den KIE-Wert zu erhalten, der das Verhältnis von aktueller Produktion und Vorhandensein von D2O und H2O ist.Überprüfen Sie die Auswirkungen des gleichen Volumens der H2O-Zugabe auf die aktuelle Produktion. Hier ist die durchgezogene Linie das repräsentative Ergebnis für die mikrobielle Stromänderung, die durch D2O-Zugabe induziert wird. Die Zugabe von D2O verringerte den mikrobiellen Strom innerhalb von 10 Sekunden stark, während H20 fast keine Stromabnahme aufwies, wie in der gestrichelten Linie dargestellt.Um zu bestätigen, dass die beobachtete Stromabnahme durch D2O auf den Elektronentransport durch die Cytochrome der äußeren Membran zurückzuführen ist, wurde ein diffundierender Elektronenmediator verwendet. Hier erhöhte die Zugabe von 100 mikromolaren alpha-AQS die aktuelle Produktion um mehr als das Fünffache und die aktuelle Produktion blieb von der D2O-Zugabe unberührt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kinetik der Stoffwechselreaktionen schnell genug ist, so dass der extrazelluläre Elektronentransferprozess geschwindigkeitsbegrenzend ist.Eine alternative Methode, um dies zu beurteilen, ist die Zugabe des Flavinmoleküls in den elektrochemischen Reaktor. Ein sofortiger anodischer Stromanstieg durch Flavin-Addition deutet auf eine Geschwindigkeitsbegrenzung durch den Elektronentransportprozess über die Cytochrome der äußeren Membran hin. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Effekt der kinetischen Isotope auf den extrazellulären Elektronentransportprozess untersuchen können.Der kritischste Punkt, um den kinetischen Isotopeneffekt erfolgreich zu erzielen, ist die Klärung und Bestätigung des Zustands, in dem der Elektronentransport durch die Cytochrome der äußeren Membran die Rate der Stromproduktion begrenzt. In diesem Video haben wir zwei Methoden vorgestellt, um diesen Zustand zu bestätigen: die Beobachtung der Stromänderung durch Zugabe von Flavin und durch Zugabe von diffundierenden zusätzlichen Mediatoren, wie z.B. alpha-AQS. Sobald die Geschwindigkeitsbegrenzung bestätigt ist, kann dieses System nicht nur für das Deuterium-Experiment, sondern auch für die biochemische Charakterisierung von Cytochromen der äußeren Membran verwendet werden.Darüber hinaus könnte dieses Protokoll auf die Untersuchung anderer elektroaktiver Mikroben anwendbar sein, solange der extrazelluläre Elektronentransportprozess geschwindigkeitsbegrenzend ist. Unsere Methodik bietet eine grundlegende und allgemeine Technik, um den extrazellulären Elektronentransportprozess über Cytochrome der äußeren Membran in vivo zu untersuchen.

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Wir beschreiben einen elektrochemischen Sensor Testverfahren zum schnellen Nachweis von Bakterien und Identifikation. Der Test umfasst eine Sensoranordnung mit DNA-Oligonukleotid-Capture-Sonden für die ribosomale RNA (rRNA) artspezifische Sequenzen funktionalisiert. Sandwich-Hybridisierung der Ziel-rRNA mit dem Capture-Sonde und einem Meerrettichperoxidase-linked DNA-Oligonukleotid Detektorsonde erzeugt eine messbare amperometrischen Strom.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Quelle: Tokunou, Y., et al., Elektrochemischer Nachweis des deuteriumkinetischen Isotopeneffekts auf den extrazellulären Elektronentransport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt eine elektrochemische Ganzzellmethode, um zu beurteilen, wie sich der Protonentransfer auf den extrazellulären Elektronentransport (EET) in elektroaktiven Bakterien auswirkt. Durch das Ersetzen von Protonen durch Deuteronen unter Verwendung von Deuteriumoxid misst die Methode...

Messung des kinetischen Isotopeneffekts auf den mikrobiellen Elektronentransport mit Hilfe von Deuteriumoxid

Exosomen sind mikrovesikuläre Strukturen, die in Bioflüssigkeiten vorkommen und möglicherweise wichtige krankheitsdiskriminierende Biomarker tragen. Hier wird eine neuartige Methode verwendet, um Exosomen spezifisch zu extrahieren und die exosomale Fracht für beide RNA/Protein-Ziele nach dem Aufschluss von Exosomen mit ungleichmäßigen elektrischen zyklischen Rechteckwellen schnell zu testen.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Ein Protokoll zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit von lebenden mikrobielle Biofilme unter physiologisch relevanten Bedingungen wird vorgestellt.

Charakterisierung von Elektronentransport durch lebende Biofilme

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Das Ziel dieses Protokolls ist, spektralphotometrisch Trans-Plasma Membran Elektronentransport Nutzung extrazelluläre Elektronen Akzeptoren überwachen und enzymatische Interaktionen zu analysieren, die mit dieser extrazellulären Elektronen-Akzeptoren auftreten können.

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Vor-Ort-mikrobielle Bereicherung oder in Situ Anbautechniken können die Isolierung der mikrobiellen Taxa schwierig zu Kultur, vor allem von Low-Biomasse oder geochemisch extreme Umgebungen erleichtern. Hier beschreiben wir eine elektrochemische Einrichtung ohne eine externe Stromquelle, um mikrobielle Belastungen zu bereichern, die extrazelluläre Elektronentransport (EET) geeignet sind.

Selbststehende elektrochemischen Aufbau Anode atmender Bakterien vor Ort zu bereichern

Dieses Protokoll stellt einen schnellen Test auf antimikrobielle Empfindlichkeit (AST) innerhalb von 2,5 h durch einzelzellstimulierte Raman-Streubildgebung desD2O-Metabolismusdar. Diese Methode gilt für Bakterien im Urin oder Vollblut, was für eine schnelle einzellige phänotypische AST in der Klinik transformativ ist.

Schnelle antimikrobielle Empfindlichkeitstests durch stimulierte Raman-Streubildgebung des Deuteriumeinbaus in ein einzelnes Bakterium

Die Nanoimpact-Elektrochemie, ein zunehmend wichtiger werdender Ansatz zur Zählung und Charakterisierung von elektroinaktiven Partikeln im Nanometerbereich, leidet als Analysetechnik aufgrund der heterogenen Stromverteilungen, die sich aus der Verwendung von Ultramikroelektroden ergeben, unter schlechter Präzision. Hier wird ein allgemeiner Ansatz skizziert, der als "elektrokatalytische Unterbrechung" bezeichnet wird und die Präzision solcher Messungen erhöht.

Präzise elektrochemische Größenbestimmung einzelner elektroinaktiver Partikel

Hier stellen wir ein Protokoll zur Charakterisierung des vermittelten extrazellulären Elektronentransfers (EET) in Milchsäurebakterien unter Verwendung eines bioelektrochemischen Systems mit drei Elektroden und zwei Kammern vor. Wir veranschaulichen diese Methode mit Lactiplantibacillus plantarum und dem Redoxmediator 1,4-Dihydroxy-2-naphthoinsäure und geben eine ausführliche Beschreibung der elektrochemischen Techniken, die zur Evaluierung der vermittelten EET verwendet werden.

Charakterisierung des vermittelten extrazellulären Elektronentransfers in Milchsäurebakterien mit einem bioelektrochemischen System mit drei Elektroden und zwei Kammern

Hier stellen wir ein Protokoll für die Verwendung von organischen elektrochemischen Transistoren (OECTs) vor, um die Aktivität des extrazellulären Elektronentransfers (EET) in Shewanella oneidensis in elektrische Signale zu übersetzen. Das hybride OECT-System bietet eine verbesserte Robustheit, Empfindlichkeit und das Potenzial für schnelle Tests mit hohem Durchsatz, was es zu einem effektiven Werkzeug für EET-Messungen macht.

Translation extrazellulärer Elektronentransferaktivitäten mit organischen elektrochemischen Transistoren

Erfahren Sie die elektrochemische Detektion des Deuterium-Kinetik-Isotopeneffekts bei Shewanella oneidensis MR-1. Diese Methode untersucht den Protonentransport im extrazellulären Elektronentransport lebender Bakterien.

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1 (Video) | JoVE Journal

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

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