A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im neuropharmakologischen Bereich zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es einfach, zuverlässig und reproduzierbar ist, Beta-Amyloid-Oligomere zu bilden. Wir zeigen, dass die Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung ist, da die Schritte zur Herstellung von Beta-Oligomeren schwer zu erlernen sind.

Stellen Sie zunächst die Konzentration der A-beta-Monomerlösung auf 0,25 Milligramm pro Milliliter ein, indem Sie 900 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser in das Röhrchen geben. Verdampfen Sie dann die Monomerlösung mit hochreinem Stickstoffgas weiter, bis das Volumen etwa 850 Mikroliter mit einer Konzentration von etwa 0,29 Milligramm pro Milliliter erreicht. Das Vorhandensein von HR5P beeinflusst die Bildung von A-beta-Oligomeren.

Daher ist das Verdampfen von so viel wie möglich ein kritischer Schritt dieses Verfahrens. Verwenden Sie anschließend doppelt destilliertes Wasser, um die Curcumin-Stammlösung zu verdünnen, um eine Arbeitslösung von 0,2 und zwei Mikromolaren herzustellen. Halten Sie ein Verhältnis von eins zu eins aufrecht und mischen Sie die A-beta-Lösung mit Curcumin, um die Endkonzentration von Curcumin bei 0,1 und einem Mikromolar zu erreichen.

Lassen Sie dann die Lösung auf einem magnetischen Rührwerk. Befestigen Sie einen Trennkasten aus Kunststoff am Magnetrührwerk. Positionieren Sie zwei magnetische Rührstäbchen an den beiden Ecken der Box und platzieren Sie dann die Röhrchen mit den Proben in der Mitte der Box.

Schütteln Sie die Box 48 Stunden lang bei Raumtemperatur bei 60 Umdrehungen pro Minute weiter und zentrifugieren Sie das Röhrchen dann 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 18.000 mal G. Nach der Zentrifugation den Überstand auffangen. Für die Dot-Blotting-Analyse nehmen Sie eine Nitrozellulosemembran und schneiden sie in einen Zentimeter breiten Streifen, dann legen Sie zwei Mikroliter der Probe gleichmäßig auf die Streifen eins und zwei mit jedem Punktabstand bei 0,5 Zentimetern.

Beim Spritzen der Probe auf die Membran ist es notwendig, sich gleichmäßig zu verteilen und die verschiedenen Tröpfchen so zu kontrollieren, dass die verschiedenen Proben nicht miteinander verbunden werden. Inkubieren Sie die Streifen anschließend fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Tröpfchen austrocknen können. Nach fünf Minuten werden die Streifen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 5 %igem Rinderserumalbumin inkubiert.

Sobald die Inkubation beendet ist, waschen Sie die Streifen fünf Minuten lang mit TBST-Puffer. Aspirieren Sie den Puffer nach dem Waschen und inkubieren Sie dann den ersten Streifen mit dem Anti-Oligomer-Antikörper A11 und den zweiten Streifen mit der Anti-A-Beta-Antikörper-6E10-Lösung für eine Stunde. Waschen Sie die Streifen nach einer Stunde dreimal fünf Minuten lang mit TBST, aspirieren Sie dann den Puffer und inkubieren Sie die Streifen 40 Minuten lang mit sekundärer Antikörperlösung.

Waschen Sie die Streifen nach der sekundären Antikörperinkubation erneut dreimal fünf Minuten lang mit TBST. Geben Sie dann etwa 300 Mikroliter gemischte ECL-Flüssigkeit auf die Oberfläche der feuchten Streifen und belichten Sie die Streifen in einem automatischen Chemilumineszenz-Bildgebungssystem. TEM-Studien zeigen das Fehlen sichtbarer Aggregate in der HFIP-gelösten A-beta-Monomerlösung, jedoch bilden dieselben Monomer nach 48 Stunden Inkubation Oligomere, bei denen es sich hauptsächlich um kugelförmige Aggregate mit einem Durchmesser von 10 bis 80 Nanometern handelt.

Bei der Dot-Blot-Analyse der A-beta-Monomer und oligomerreichen Proben zeigt sich das Vorhandensein von A11-positiven A-beta-Oligomeren in A-beta-Oligomer-reichen Proben. Interessanterweise sind A-beta 6E10-positive A-beta-Peptide sowohl in den A-beta-Monomer- als auch in den oligomerreichen Proben vorhanden. Als nächstes wird auch eine semiquantitative Analyse durchgeführt, um die spezifischen Antikörper-positiven A-beta-Monomer und oligomerreichen Proben als Prozentsatz der Kontrolle zu exprimieren.

A11-positive A-beta-Peptide sind in A-beta-Oligomer-reichen Proben im Vergleich zu den Monomeren signifikant höher. Im Gegensatz dazu ist das A-beta 6E10-positive A-beta-Peptid sowohl in den monomeren als auch in den oligomerreichen Proben vorhanden. Tatsächlich werden A-beta-Oligomere auch mit Curcumin und A-Beta-Oligomer-Inhibitoren co-inkubiert.

Curcumin führt zu einer signifikanten Verringerung der relativen Menge an A11-positiven A-beta-Oligomeren mit verminderter A11-Färbung in den Curcumin-co-inkubierten A-beta-Oligomerproben. Unterschiedliche Konzentrationen von Curcumin haben jedoch keinen Einfluss auf die Anzahl der A-beta-Peptide in den 6E10-positiven Monomer- und oligomerreichen Proben im Vergleich zu A11-positiven Proben. Einmal gemeistert, kann diese Technik in mehreren Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, Medikamentenkandidaten für neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man A-beta-Oligomer herstellt und seine Menge bewertet.