Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Diese Methode könnte dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Bauchspeicheldrüse zu beantworten, indem sie diese Pankreatoiden verwendet, um zu verstehen, wie sich endokrine Zellen in einer architektonisch und zellulär komplexen Umgebung bilden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Pankreatoiden aufgrund des Einschlusses des umgebenden Mesenchyms endokrine Zellen entwickeln. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Bauchspeicheldrüse mit e10,5 sehr klein ist.

Und die Dissektion ist entscheidend für die Bildung von Pankreatoiden, um genügend nicht kontaminierendes Gewebe zu erhalten. Um das Sezieren vorzubereiten, füllen Sie einen Eiskübel und stellen Sie einen Behälter mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung in das Eis. Reinigen Sie zwei Pinzetten mit feiner Spitze und eine Präparierschere mit 70 % Ethanol.

Stellen Sie in der Nähe des Präparierbereichs einen Behälter mit mindestens drei Borosilikat-Kapillarröhrchen, einem Feuerzeug und gefilterten 1000-Mikroliter-Pipettenspitzen auf. Als nächstes pipettieren Sie mindestens einen Milliliter 1,25 Milligramm pro Milliliter kalte Dispase, verdünnt in sterilisiertem Wasser, in die zweite Vertiefung einer 12-Well-Platte auf Eis. Pipettieren Sie PBS in die erste, dritte und vierte Vertiefung der 12-Well-Platte.

Pipettieren Sie außerdem einen Milliliter 0,05 % Trypsin in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Nach dem Einschläfern von e10.5 zeitgesteuerten trächtigen Mäusen gemäß den IACUC-Richtlinien besprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol, um die Region zu reinigen. Machen Sie dann mit Schere und Pinzette einen V-förmigen Schnitt im Genitalbereich der Maus und setzen Sie den Schnitt bis zum Zwerchfell fort.

Schneiden Sie die Gebärmutter vorsichtig heraus, indem Sie einen Schnitt an den obersten seitlichen Teilen der Gebärmutter machen, das Organ nach oben von der Maus weg ziehen und diesem Schnitt bis in die Genitalregion folgen, bevor Sie ihn auf der gegenüberliegenden Seite wiederholen. Legen Sie die herausgeschnittene Gebärmutter in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit dem kalten PBS. Legen Sie die Petrischale unter ein Lichtmikroskop und öffnen Sie vorsichtig das Gebärmuttergewebe, indem Sie zwei Pinzetten zwischen jeden Embryo legen und das Gewebe vom Dottersack entfernen.

Übertragen Sie die Embryonen, indem Sie den Dottersack vorsichtig mit einer Pinzette greifen und in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit frischem, kaltem PBS legen. Stellen Sie die Petrischale auf Eis. Geben Sie als Nächstes mehrere PBS-Tropfen auf den 10 Zentimeter großen Petrischalendeckel.

Verwenden Sie diese Tröpfchen, um den Embryo während der Dissektion zu übertragen, während extraembryonales Gewebe entfernt wird, um die Sichtbarkeit zu gewährleisten. Übertragen Sie einen Embryo in einen PBS-Tropfen und entfernen Sie ihn vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Dottersack, während die restlichen Embryonen in PBS auf Eis bleiben. Entfernen Sie den Kopf, bevor Sie den Embryo in einen neuen PBS-Tropfen setzen, indem Sie eine Pinzette verwenden, um den Embryo leicht zu schöpfen, ohne das Gewebe zu beschädigen.

Entfernen Sie in einem neuen PBS-Tropfen die vier Gliedmaßenknospen mit einer Pinzette. Platzieren Sie die Pinzette in der Öffnung, in der sich die Gliedmaßenknospe befand, und reißen Sie vorsichtig nur das äußerste Gewebe nach vorne. Drehen Sie den Embryo und wiederholen Sie den Vorgang in hinterer Richtung, wobei Sie an der Knospe der hinteren Gliedmaßen anhalten.

Zu diesem Zeitpunkt sollte der Magen-Darm-Trakt sichtbar sein. Der hintere Bereich des Magen-Darm-Trakts weist eine leichte Biegung auf; Führen Sie hinter dieser Biegung eine Pinzette in die Öffnung zwischen dem Magen-Darm-Trakt und der Wirbelsäulenregion an der Körperwand ein. Lösen Sie den Magen-Darm-Trakt und arbeiten Sie sich langsam nach oben, bis der vorderste Bereich erreicht ist, an dem sich die Herzregion verbindet.

In den folgenden Schritten ist es wichtig, das umgebende Gewebe in der Kultur zu vermeiden, um die Pankreatoiden nicht mit nicht-pankreatischem Gewebe zu kontaminieren. Wenn Du jedoch nicht die ganze Bauchspeicheldrüsenknospe nimmst, wird die Anzahl und Größe der Bauchspeicheldrüsen beeinträchtigt. Übertragen Sie den Magen-Darm-Trakt auf das frische PBS-Tröpfchen.

Fahren Sie fort, das äußere Gewebe zu entfernen, das den Magen-Darm-Trakt umgibt. Sobald dieses äußere Gewebe entfernt ist, kann die Bauchspeicheldrüsenknospe hinter den Leberknospen, zwischen Magen und Darm, sichtbar gemacht werden. Nehmen Sie dann eine Pinzette und kneifen Sie das Gewebe unter der hervorstehenden Knospe im Darm vorsichtig zusammen und heben Sie die Bauchspeicheldrüsenknospe leicht ab.

Nach dem Einklemmen der Region, in der die Knospe mit dem Darm verbunden ist, wird die Knospe getrennt. Wasche die Blüten einmal in einer neuen PBS-Blase, bevor Du sie in die erste Vertiefung der 12-Well-Platte gibst und PBS auf Eis kalt stellst. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Knospen aus den Embryonen entnommen und in die erste Vertiefung der 12-Well-Platte gelegt wurden.

Legen Sie als Nächstes die 12-Well-Schale unter das Lichtdissektionsmikroskop. Zähle die Anzahl der erfolgreich präparierten Bauchspeicheldrüsenknospen, um später das Teilungsverhältnis zu berechnen. Setzen Sie eine gefilterte 1000-Mikroliter-Pipettenspitze in die Pipette ein, an der das Kapillarröhrchen befestigt ist.

Flammsterilisieren Sie das Kapillarrohr und erzeugen Sie eine Biegung im Rohr, um die Verwendung zu erleichtern. Verwende die Kapillare, um die Knospen zwei Minuten lang in die zweite Vertiefung mit kalter Dispaselösung zu übertragen, bevor du sie in die dritte Vertiefung mit sauberem PBS überträgst. Pipettiere die Knospen auf und ab und übertrage sie in die vierte Vertiefung mit sauberem PBS.

Zum Schluss überträgst Du die Knospen mit dem Kapillargerät in das 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 0,05 % Trypsin. Legen Sie das Röhrchen in den vorgewärmten 37 Grad Celsius Shaker und schütteln Sie es vier bis fünf Minuten lang bei 1.500 U/min. Nachdem Sie das Röhrchen etwa 10 Sekunden lang vortext haben, legen Sie es sofort in die Zentrifuge und drehen Sie es fünf Minuten lang bei 200 g.

Entfernen Sie vorsichtig alle bis auf etwa 50 Mikroliter der Lösung, um die zentrifugierten Zellen nicht zu stören. Für jede Knospe, die bei 400 Mikrolitern Organogenesemedium gesammelt wird, in die zentrifugierten Zellen wird der Pulswirbel dreimal gepulst und 100 Mikroliter pro Vertiefung einer 96-Well-Platte mit geringer Bindung aufgetragen, wobei die Knospen im Verhältnis eins zu vier geteilt werden. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, um dissoziierte Zellen frei schwebend zu sehen.

Stellen Sie dann die Kulturschale in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5% Kohlendioxid auf einer Wippe bei mittlerer Geschwindigkeit. Eine sorgfältige Dissektion von Mausembryonen bei e10.5 aus dem Gebärmutterhorn sollte unbeschädigte Embryonen in PBS für eine weitere Dissektion erhalten. Der Magen-Darm-Trakt kann effizient aus dem Embryo entnommen werden, so dass die dorsale Pankreasknospe an der Verbindung von Darm und Magen unterschieden werden kann.

In Organogenese-Medien organisieren sich diese frei schwebenden, gerüstfreien Zellen selbst und organisieren sich zu dreidimensionalen Pankreatoiden, die wachsen und mindestens 10 Tage in Kultur bestehen bleiben. Die Anwendung eines Proteinkinase-C-Aktivators in hohen Konzentrationen verändert die Morphologie der sich entwickelnden Pankreatoiden, was zu locker assoziierten Epithelzellen und einer verstärkten Verzweigung führt. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung transgener Tiere die Visualisierung von Zellen bei der Differenzierung in Echtzeit.

Um die Assoziation von Pankreas-Mesenchymgewebe mit Pankreosepithelzellen zu beurteilen, kann eine Immunfärbung für Marker jedes Gewebes durchgeführt werden. Die Immunfärbung eines Gangmarkers mit einem endokrinen Marker und Zellkernen zeigt die Bildung mehrerer Linien bei Pankreatoiden. Ein Mesenchymmarker, der mit einem Pankreasvorläufermarker kogefärbt ist, zeigt, dass das Mesenchym das Pankreatoid umhüllt.

Entwicklung von Betazellen wird durch Färbung des Epithelmarkers und des Betazellmarkers nachgewiesen. Mittels quantitativer PCR-Analyse können Transkripte von Vorläuferzellen und differenzierenden Zellen wie Vorläufergene und differenzierte Marker beurteilt werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Stunde durchgeführt werden, einschließlich Vorbereitungszeit, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Dissektion durchführen, um Pankreasgewebe von 10,5 Mäusen zur Erzeugung von Pankreatoiden zu gewinnen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den Magen-Darm-Trakt vorsichtig von den Embryonen zu entfernen, da es sonst sehr schwierig sein wird, die Bauchspeicheldrüsenknospe zu finden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie GSIS und ELISA durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie viel Insulin oder C-Peptid nach der Glukosestimulation produziert wird.

Nach ihrer Entwicklung ebnete uns diese Technik den Weg, um die morphologischen Folgen der PKC-Aktivierung mit kleinen Molekülen zu erforschen. Eine Möglichkeit, dieses System weiter zu implementieren, um die Wirkung des Transkriptionsfaktors der Expression zu untersuchen und sogar wichtige Epistase-Experimente durchzuführen.